추가 질문 내용에 대해 답변 드립니다.

유리관의 끝을 불로 가열해 막는 것은 두가지 이유가 있습니다. 

1) 이전 답변에서 70% Ethanol에 담가 보관한다고 하였는데, 모세관 현상에 의해 보관 시 70% Ethanol이 유리관 내로 들어가는 것을 방지하기 위해서 입니다. 

2) 유리관의 끝을 불로 가열하여 막는 과정에서 끝 부분이 둥그렇게 되어 Viginal plug(질전) 확인 과정에서 유리관 끝이 조직에 상처를 주는 것을 막기 위해서 입니다. 생식기에 넣을 때는 관의 막힌 쪽을 넣어서 관찰해보시기 바랍니다. 

예쁜꼬마선충(이하 선충)은 주로 고체 NGM (Nematode Growth Medium) 배지를 이용해서 계대 배양을 합니다. 고체 선충 배지는 간단히 최종 2% 한천(Agar)과 1L에 염분(NaCl 2g, KH2PO4 3g, K2HPO4 0.5g)과 영양분(Tryptone 4g)을 섞어 멸균하여 섭씨 60-65도 정도로 식힌 후, 4mL의 콜레스테롤(5mg/mL)을 넣고 직경 55-60mm의 페트리디쉬(Petri dish)에 분주해 줍니다. NGM 배지는 각 실험실마다 조성과 만드는 방법이 조금씩 다른데, 표준 프로토콜은 WormBook: The Online Review of C. elegans Biology의 Maintenance of C. elegans (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/)를 참조하십시오. 선충의 먹이가 되는 대장균(OP50 strain)은 LB에 배양하여, 앞서 만든 NGM plate에 분주하면 됩니다. 1-2일 배양하면 대장균이 충분히 자라게 되고, 첨부한 그림과 같은 모양으로 상자에 담아 냉장 보관하면 1달 이상 보관할 수 있습니다.

선충은 성체의 크기가 1mm 정도에 불과하여, 해부현미경(실체현미경)과 백금픽(Platinum pick)을 이용하여 기존 배지에서 새 배지로 옮겨 줍니다. 자웅동체이기 때문에 3-5마리의 성체를 옮기면 3-4일 뒤에 배지를 가득 채울 정도의 개체 수로 증가합니다.

실험실에서 생물체의 배양 배지는 기본적으로 멸균기(Autoclave)를 이용하거나 미세 필터를 이용하여 멸균을 합니다. 세균과 곰팡이 등의 오염은 선충의 성장 및 생식을 비롯한 여러 가지에 영향을 주기 때문입니다.   

1. 플러그 체크의 방식을 질을 벌려서 확인하는 것 외에 막대로 살살 건드려보면 느껴지는 경우도 있다하는데, 질을 벌려보는 것과 둘 중에 어느 방식이 더 알기 쉬울까요?

Vaginal plug(질전)을 확인할 수 있는 방법은 다양하며, 조금 더 확실히 확인 가능한 방법을 소개해 드립니다.그림1. 가천대학교 의과대학 이영재교수님 제공

Vaginal plug(질전)이 육안으로 보일 정도로 확실한 경우도 있지만, 안쪽에 생겨 육안으로 확인이 어려운 경우도 있어 질전 확인 용 유리 파이펫을 이용하면 조금 더 확실하게 확인 가능합니다.

1) 질전 확인 용 유리 파이펫 (Drummond Scientific Company, calibrated pipettes, Cat. No. 2-000-100) 끝을 불로 가열해 완전히 막고, 소독을 위해 70% Ethanol에 담가 보관합니다.

2) 질전의 확인은 마우스가 앞발로 사육 케이지 위 철망을 잡게하고 꼬리를 들어 암컷 생식기를 보이게 한 상태에서 질전 확인 용 유리 파이펫을 가볍게 생식기 내부에 넣어(너무 깊게 들어갈 필요는 없음) 막히는 것으로 확인이 가능합니다.

2. 현재 플러그를 메이팅 다음날 아침 9시 30분경에 확인하고 있습니다. 이 시간을 더 일찍 당겨볼 필요가 있을까요?

9시 30분이면 적당한 시간이며 Vaginal plug(질전)은 시간이 지날수록 탈락되기 쉬우므로 오후에는 확인이 불가능할 수 있습니다.

3. 전날 메이팅을 위해 합사할 때 20~30분 내로 수컷이 메이팅을 시도하는 장면을 몇번 본 적 있습니다. 이 경우에는 플러그가 안보이더라도 메이팅이 성공했다고 봐야 하나요?

Vaginal plug(질전)이 확인되거나, 교배를 시도하더라도 모두 수정이 이루어진 것을 의미하는 것은 아닙니다. 암컷이 발정상태가 아닌 경우에도 교배가 진행될 수 있는데, 이 경우에는 임신되지 않습니다.

4. 이건 조금 논외인데, 합사를 진행할 때 암컷의 케이지에 수컷을 합사시키는 것과 수컷의 케이지에 암컷을 합사시키는 것 두 방식의 차이점이 있을지 궁금합니다.

암컷의 케이지에 수컷을 합사하는 경우, 수컷은 영역확보를 위해 암컷을 공격할 수 있으므로 암컷의 케이지에 수컷을 합사하는 것은 좋지 않습니다. 암컷을 수컷 케이지에 합사하고 임신이 확인되면 새 케이지로 분리하여 단독 사육하는 것이 좋습니다.

번식성공율을 높이기 위한 몇 가지 방법을 소개해 드립니다.

1) 번식 경험이 있는 수컷과 젊은 암컷을 합사하는 것이 좋습니다.

2) 소등(Dary Cycle) 후 3~5시간 후에 배란을 하는 것으로 알려져 있으므로, 늦은 오후 미리 준비해둔 수컷 케이지에 암컷을 합사시키되 Fighting이 생길 수 있으므로 합사 후 잠시 관찰했다가 공격하는 경우에는 분리해야 합니다.

3) 생식주기(estrus cycle)을 확인하고 교배를 진행하는 것이 좋습니다.BALB/cByJ 계통(좌) C57BL/6J 계통(우)의 생식주기 사진 A: 발정전기 B: 발정기 C: 발정후기 D: 발정휴지기

그림 출처: Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE 7(4): e35538. 2012

안녕하세요. 

질문자가 올리신 사진으로는 무엇인지 구체적으로 알 수가 없는데요, 

1) 물고기가 변으로 배출한 점액성 똥이거나, 

2) 암수가 같이 있다면 암컷이 낳은 수정이 되지 않은 알 같아 보입니다. 

사진에서 보여지는 색으로는 2)번에 가까워 보이긴하고요, 이 경우는 암수를 따로 두시거나, 수온을 25도정도로 키우시면 됩니다. 

1)번인 경우는 지속적인 물환수(아래 설명)가 필요하고, 

물에 떠다니는 것을 물고기가 먹기 때문에 가능하시면 부유물을 제거하시고, 2-3주 정도 두셔야 하고, 심각한 경우라면 감염원을 확인 한 후 약물 치료를 해야합니다. 

보통 물고기의 감염원은 복합적으로 확인되기 때문에 포르말린, OTC, 프라지콴텔 정도를 사용합니다. 하지만, 이러한 치료방법은 전문가 처방(수의사, 수산질병관리사)에 의해 가능합니다.

수산생물을 실내에서 키우는 방법은 크게 2가지가 있습니다. 

1. 순환여과사육 방법은 물고기가 서식하고 있는 물을 순환시켜 물을 정화해 재사용하면서 키우는 방법, 

   물고기가 살고 있는 물을 계속 쓰는 방법이기 때문에 여과 시설이 잘 되어 있어야 합니다. 

    1단계 : 물리적 여과장치(분비물 등을 1차제거)

    2단계: 화학적여과장치(물성을 조절)

   3단계: 생물학적 여과장치(암모니아 등을 조절해주는 미생물에 의한 분해)

    자외선 조사 등

  최소한 위의 여과방법이 있어야 물을 재사용해도 물고기가 건강할 수 있습니다. 

2. 비순환사육 방법, 

    물을 일부 버리고 추가적으로 더 넣어주거나, 

    물을 추가적으로 더 넣어주면서 사육하는 방법.  일반적으로 가정에서 사용하는 방법입니다. 

위 두방법 모두 산소도 충분히 공급해 주어야 합니다..

어류의 순치는 일반적으로 2-3주정도를 합니다. 실험하는 곳의 물에 적응하도록 하는 시간. 

물고기가 물에 서식하면서 용변을 봅니다. 또, 먹다남은 사료가 서식하는 물에 남고요. 

이 두가지가 물환경을 나쁘게 만드는 주요 원인입니다. 이 두 원인에 의해  질산성 물질(쉽게 이야기 하면 똥, 오줌에서 나오는 암모이아, 사료에서 녹아져 나오는 질소영양분 등)이 수중 생물에게 가장 위험합니다. 가장 기본적으로 호흡에 영향을 주어 물고기의 전체 건강을 점진적으로 악화 시킵니다(암모니아 스파이크라고도 하죠). 그래서 물고기는 물을 주기적으로 교환을 해주어야 합니다. 

물은 대기보다 용존산소량이 1/20~ 1/30 낮기 때문에, 위 두가지에 의한 물환경이 개선이 되지 않으면 물고기가 보기에는 멀쩡해도 속병이 듭니다. 

또, 수조의 물환수량은 하루 5-10%이내로 하는 것이 좋습니다. 

특히, 물환수량이 40-100%는 대량환수 혹은 전체환수인데, 이 경우 물이 안정화되지 못해(물속에 분해자 역할을 하는 미생물이 적응할 시간) 물이 깨져 물고기의 건강을 더 악화 시킬 수 있습니다. 

물고기가 사는 물을 교환해 주는 이유는 

1. 물도 고여있으면 썩고, 

2. 물고기들 분비물에 의한 유기물이 물에 쌓여 호흡에 어려움을 겪기 때문입니다. 

물도 물고기의 종류, 건강상태, 하편, 물의 수원지에 따라 물 특성도 많이 다릅니다. 

예로 경도 등등. 

무거운 물(밀도가 높은 물)에서 살고 있는 물고기의 물을 갑자기 많이 바꾸면 물고기가 갑자기 적응해야 하니 힘들겠죠? 

그래서 물 환수량도 적당한 기간, 적당한 량이 필요합니다. 

원칙적으로는 물의 물성을 확인한 후, 모두 같다면 전부를 한번에 교환해도 상관은 없겠지요. 

하지만 생물이 서식하는 물의 물성은 늘 동일하지 않습니다. 

물고기들은 물에 살기 때문에 다른 물고기에 의한 감염원에 그냥 노출되어 있습니다. 

그래서, 물고기를 어디서 가져왔는지, 

혹시 수족관에서 사왔다면 어떤 물고기들이랑 같이 있었는지도 중요합니다. 

 참고문헌

1. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 2007. 269, 1-4.

2. Methods in Cell Biology. Chapter 24 - Aquaculture and Husbandry at the Zebrafish International Resource Center. 2011. Vol. 104, 429-451.

3. The Zebrafish in Biomedical Research. 2021. Chapter 24 - Introduction to Zebrafish Husbandry. 263-264

4. The Zebrafish in Biomedical Research. 2021.Chapter 29 - Water Quality For Zebrafish Culture. 321-335

5.  The Zebrafish in Biomedical Research. 2021. Chapter 30 - Recirculating Aquaculture Systems (RAS) for Zebrafish Culture. 337-356

네, 일반적으로 L4 혹은 어린 성충(young adult) 시기부터 선충의 수명을 측정합니다. 그 이유는 태어나서부터 수명을 측정하면 배아 시기에서 L4 시기까지의 발달 과정에서 중단(arrest)이나 심한 지연(delay)이 발생할 경우 잘못된 해석으로 장수로 오해될 수 있기 때문입니다. 다시 말해, 발달 지연을 장수로 오해하는 것을 방지하기 위해서 거의 성체가 된 이후부터 수명을 측정하고 있습니다.

동물모델에서 활용 가능한 imaging 기법은 크게 2가지로 나누어 볼 수 있습니다.
 

1. Fluorescence imaging techniques

 - 비침습적인 imaging 기법으로 세포를 포함한 유기체에서 생물학적 현상을 시각화한 이미지로 나타낼 수 있는 기법입니다.

   해당 기법을 활용하기 위해서는 형광 염색이나 형광 단백질이 관찰하고자 하는 molecular mechanism이나 조직 등에서 발현할 수 있도록 처리하는 것이 필요합니다.

  광원(light source)으로부터 발생한 빛은 유기체 또는 표본에 부딪히게 되고 빛이 부딪힐 때 발생하는 에너지는 유기체 또는 표본에 흡수됩니다.

  흡수된 에너지로 인해 흥분상태(excited state)가 된 형광단(fluorophore)은 원래 상태(ground state)로 돌아가면서 빛을 배출하게 되는데 이것이 형광(fluorescence)이며, 이때 발생한 형광을 이미징 장비 통해 감지하여 시각화하는 것이 fluorescence imaging technique 입니다.
 

   일반적으로 이 기법을 위해 사용하는 이미징 장비는 현미경이며, 대표적인 현미경 종류는 아래와 같습니다.

   1) Light-Sheet/Widefield Microscope

   2) Confocal Microscope

   3) Multiphoton Microscope

*그림출처:  Carl Zeiss. https://www.zeiss.com/microscopy/en/applications/life-sciences/imaging-large-model-organisms.html 

  해당 기법 및 현미경에 대한 자세한 원리는 아래 사이트를 참고하시기 바랍니다.

   https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/

2. Radiographic imaging techniques

 - 방사선을 이용하여 유기체 내 구조 및 대사 활동을 시각화하는 기법입니다.

   해당 기법에 활용되는 방사선은 전리 방사선(ionizing radiation), 비전리 방사선(non-ionizing radiation)으로 나눌 수 있습니다.

   대표적으로 사용되는 장비는 아래와 같습니다.

   1) X-ray

   2) CT

   3) PET Scan

   4) MRI 

   5) SPECT Scan

   *그림 출처:

    CT- Clark DP, Badea CT. Phys Med. 2021;88:175-192.

    MRI-  Kabli S et al. Zebrafish. 2006;3(4):431-439.

* References

1. United States Environmental Protection Agency. https://www.epa.gov/radiation/radiation-basics#ioniandnonioni

2. Carl Zeiss. Education in Microscopy and Digital Imaging.  https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/

3. Gielen, JLMA, Van Dyck P. Radiologic Imaging Techniques. In: Glaudemans A, Dierckx R, Gielen J, Zwerver J, eds. Nuclear Medicine and Radiologic Imaging in Sports Injuries. Springer; 2015:9-23.
4. Clark DP, Badea CT. Advances in micro-CT imaging of small animals. Phys Med. 2021;88:175-192.

5. Carl Zeiss. Imaging Large Model Organisms Fixed or Living. https://www.zeiss.com/microscopy/en/applications/life-sciences/imaging-large-model-organisms.html
6. Kabli S, Alia A, Spaink HP, Verbeek FJ, De Groot HJ. Magnetic resonance microscopy of the adult zebrafish. Zebrafish. 2006;3(4):431-439.