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  • Inducible zebrafish line은 어떻게 이용되는가요? 제브라피쉬 형질전환
    • 유도형(inducible) 제브라피쉬 라인은 특정 시기에 유전자의 발현을 외부 자극(heat, drug, light 등)에 의해 조절할 수 있도록 설계된 시스템입니다. 이 시스템을 이용하면 발생 초기에 치명적인 유전자의 기능을 시간적으로 조절하여 분석할 수 있으며, 성체 단계나 재생 과정처럼 특정 시점에서만 유전자의 역할을 탐색할 수 있다는 장점이 있습니다.
     
    • 유도형 라인 제작에 널리 사용되는 방법 중 하나는 heat-shock 프로모터(hsp70 promoter)를 이용하는 것입니다. 이 프로모터는 고온(약 37–38 °C) 자극 시 전사활성이 급격히 증가하여 수 시간 내에 유전자의 발현을 유도합니다. 제브라피쉬 배아는 열 자극 전달이 용이하고, transgene 발현의 속도와 강도가 높기 때문에 이러한 방식에 특히 적합합니다.
     
    • 이러한 유도형 전사활성 시스템을 이용하면 원하는 시점에 특정 유전자를 과발현하거나, dominant-negative 형태의 단백질을 일시적으로 발현시켜 신호전달을 차단함으로써 해당 유전자의 기능을 규명할 수 있습니다. 예를 들어, hsp70:dn-fgfr1 (dominant-negative Fgf receptor) 트랜스제닉 라인을 heat shock으로 유도하면 FGF 신호전달을 일시적으로 억제할 수 있습니다.
     
    • 초기 발달 단계에서 FGF 신호는 필수적이기 때문에, 이러한 유도형 시스템이 아니면 후기 유생 단계나 성체 단계에서의 기능을 분석하기 어렵습니다.
     
     
     
    • 이 시스템은 성체 제브라피쉬 재생 연구에서도 강력한 도구로 활용됩니다. 예를 들어, 성체 지느러미 재생 과정에서 hsp70:dn-fgfr1 라인을 이용해 FGF 신호를 억제하면, FGF 신호가 blastema 형성, 세포 증식률, 재생 속도, 그리고 절단 위치에 따른 성장 조절에 직접 관여함을 확인할 수 있습니다.
     
    • 이처럼 heat-shock-inducible 라인은 발생 단계별 신호의 시계열적 역할을 정밀하게 규명하며, 특정 시점에서의 유전자 기능을 분석할 수 있는 핵심적인 연구 도구로 널리 사용되고 있습니다.
     
    유사질문
    • Heat-shock 유도형 제브라피쉬 라인은 어떤 원리로 작동하나요?
    • 성체나 특정 시점에서 유전자를 발현·억제하기 위해서는 어떤 유도형 시스템을 이용할 수 있나요?
    References
      1. Lee Y., Hami D., De Val S., Kagermeier-Schenk B., Wills A.A., Black B.L., Weidinger G., Poss K.D. (2009). “Maintenance of blastemal proliferation by functionally diverse epidermis in regenerating zebrafish fins.” Developmental Biology, 331(2), 270–280.
       
      2. Lee Y., Grill S., Sanchez A., Murphy-Ryan M., Poss K.D. (2005). “Fgf signalling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.” Development, 132(23), 5173–5183.
    제브라피쉬 형질전환 inducible transgenic line Heat-shock 프로모터 재생
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  • 재생연구를 위한 세포 특이적 손상 방법이 있나요? 제브라피쉬 형질전환

    NTR/MTZ cell ablation 시스템은 세포 특이적 손상을 위해 제작된 형질전환 시스템으로, 1991년 Bryant and Deluca에 의해서 엔테로박터 클로카에(Enterobacter cloacae)라는 막대 모양의 그람음성간균의 NTR(nitroreductase)을 발견하면서 NTR이 다른 동물에는 발현하지 않고 박테리아 계통에 발현되는 점을 발견하였다. 이러한 점을 활용하여 Nitroreductase(NTR)는 전구약물인 메트로니다졸(metronidazole, MTZ)을 환원시켜 독성 물질을 생성하는 효소로, 특정 세포를 사멸시키는 데 사용됩니다1.

     

    NTR/MTZ cell ablation 시스템의 장점은 특정한 세포를 유전적인 모델을 활용하여 세포 특이적인 손상을 유도할 수 있고, 이를 바탕으로 특정세포가 손상되었을 때 재생이 어떻게 일어나는 지를 연구할 수 있는 장점이 있습니다.

     

    최근 간에 존재하는 간세포 특이적으로 NTR을 발현시키는 형질전환개체를 제작하여 간세포 특이적인 손상을 유도하고 간이 어떠한 세포의 기원으로 재생이 되는가를 연구를 진행하였고 간 세포의 심각한 손상이 유도되면 간세포 유래의 간 재생이 이루어지는 것이 아니고 주변에 존재하는 담낭세포 기원의 간 재생이 이루어지는 점을 발견하였다2,3. 이외에도 현재는 NTR/MTZ cell ablation 시스템을 활용하여 다양한 세포들 특이적인 손상을 유도하고 재생이 어떻게 이루어지는가에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다4.

     

    유사질문
    • 장기의 세포 특이적 손상에 대해 알고싶어요
    References
      1) Silvia Curado, Didier Y R Stainier, Ryan M Anderson. Nat Protoc. 2008;3(6):948–954. "Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies"
       
      2) Tae-Young Choi, Mehwish Khaliq, Sungjin Ko, Juhoon So, and Donghun Shin. JoVE-Journal of Visualized Experiments, May, 20;99;e52785. "Hepatocyte-specific ablation in zebrafish to study biliary-driven liver regeneration"
       
      3) Tae-Young Choi, Nikolay Ninov, Didier Y R Stainier, Donghun Shin. Gastroenterology. 2014 Mar;146(3):776-88. "Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish“
       
      4) Ah-Young Chung, Pan-Soo Kim, Suhyun Kim, Eunmi Kim, Dohyun Kim, Inyoung Jeong, Hwan-Ki Kim, Jae-Ho Ryu, Cheol-Hee Kim, June Choi, Jin-Ho Seo, Hae-Chul Park. Molecules and Cells Volume 36, Issue 1, July 2013, Pages 82-87 "Generation of Demyelination Models by Targeted Ablation of Oligodendrocytes in the Zebrafish CNS"
    형질전환 NTR/MTZ cell ablation system 세포 특이적 유전자발현 세포 손상 모델 재생
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  • QF/QUAS 시스템은 무엇인가요? 제브라피쉬 형질전환

    QF/QUAS 시스템은 조건적 유전자발현을 위해 제작된 형질전환 시스템으로, 붉은 곰팡이 Neurospora crassa 의 quinic acid를 감지하는 유전자발현조절시스템에서 기원하였습니다. 조직 또는 세포특이적인 프로모터에 의해 조절되는 전사활성화 인자인 QF를 보유한 형질전환체와 QUAS에 의해 발현되는 타겟유전자 (gene of interest)를 가진 형질전환체의 교배를 통해 QF가 QUAS에 결합함으로써 최종적으로 원하는 유전자의 시공간적 특이적 발현을 조절할 수 있습니다1.

     

     최근 기존의 QF/QUAS를 개량한 QF3/QUAS (또는 IQ-switch, EQ-on) 시스템은 기존 QF/QUAS의 독성을 유의미하게 감소시켰으며, QUAS의 반복횟수에 따라 타겟유전자 발현정도를 결정할 수 있습니다3. 또한 유사한 용도로 기존에 널리 사용되어온 Gal4/UAS 시스템의 제브라피쉬 모델에서의 최대 약점인 유전자 침묵 (gene silencing)이 발생하지 않는 것으로 보고되었습니다2,3.

     

    QF3/QUAS 시스템은 제브라피쉬 모델에서 시공간적 (spatio-temporal) 유전자 발현을 위해 매우 효과적으로 활용될 수 있으며, 더 나아가 CRISPR 유전자가위 기술과 같은 기존의 유전자조절기술과 결합하여 유전자 발현제어를 위한 다재다능한 연구기법으로 확장될 수 있는 높은 가능성을 보여줍니다3.

     

    유사질문
    • IQ-Switch, EQ-on System에 대해서 알고 싶습니다
    References
      1) Subedi A, MacurakM, Gee ST, Monge E, Goll MG, Potter CJ, Parsons MJ, Halpern ME. Methods 2014. 66(3):433-40 “Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis”
       
      2) Goll MG, Anderson R, Stainier DY, Spradling AC, Halpern ME. Genetics 2009. 182:747–55. “Transcriptional silencing and reactivation in transgenic zebrafish”
       
      3) Hong JK, Lee JG, Sohn KC, Lee K, Lee S, Lee J, Hong J, Choi D, Hong Y, Jin HS, Choi DK, Lee SU, Kee Y, Jung J, Bae YK, Hwang RH, Hur GM, Lee JS, Ro H Commun. Biol. 2021 4(1):1405 “IQ-Switch is a QF-based innocuous, silencing-free, and inducible gene switch system in zebrafish”
    binarygeneexpressionsystem 조건적유전자발현 시공간적유전자발현조절
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  • 제브라피쉬 형질전환 모델로 신경독성을 평가할 수 있나요? 제브라피쉬 형질전환
    - 신경독성은 화학물질이나 약물이 신경계에 미치는 유해한 영향을 의미하며, 세포 분화 억제, 세포사멸 등 다양한 형태로 나타납니다. 제브라피쉬 형질전환 모델을 활용하여 다양한 신경독성의 형태를 관찰하고 평가할 수 있습니다.
     
    - HuC 프로모터를 이용한 형질전환 모델은 neuron을, Sox10 프로모터를 이용한 모델은 신경교세포인 oligodendrocyte를 각각 형광 표지합니다. 세포사멸은 TUNEL assay를 이용하여 정량할 수 있습니다. 세포 분화는 live imaging을 통해 형광 표지된 분화 세포 수를 정량하며, 세포사멸이 증가하지 않는 상황에서 분화 세포 수가 감소한다면 이는 분화가 억제된 것으로 해석할 수 있습니다. 예를 들어, Sox10+ 세포 수가 현저히 감소하였을 때, Sox10+/TUNEL+ 세포 수에 변화가 없다면 분화 억제를, Sox10+/TUNEL+ 세포 수가 유의미하게 증가한다면 세포사멸을 의미합니다.
     
    [참고 그림]
     
     
     
     
    유사질문
    • 제브라피쉬에서 관찰된 신경독성이 세포사멸에 의한 것인지 구분할 수 있나요?
    References
      1) Benard EL, Küçükaylak I, Hatzold J, Berendes KUW, Carney TJ, Beleggia F, Hammerschmidt M. wnt10a is required for zebrafish median fin fold maintenance and adult unpaired fin metamorphosis. Dev Dyn. 2024 Jun;253(6):566-592.
       
      2) Wang Q, Kurosaka H, Kikuchi M, Nakaya A, Trainor PA, Yamashiro T. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Dis Model Mech. 2019 Oct 4;12(10):dmm040279.
       
      3) Tran CM, Do TN, Kim K-T. Comparative Analysis of Neurotoxicity of Six Phthalates in Zebrafish Embryos. Toxics. 2021 January; 9(1):5.
       
      4) Xu D, Wang B, Xu B. et al. Midazolam Exposure Impedes Oligodendrocyte Development via the Translocator Protein and Impairs Myelination in Larval Zebrafish. Mol Neurobiol. 2022 July;59:93–106.
    독성평가 뇌 신경세포 neuron 신경교세포
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  • 제브라피쉬에서 페록시좀의 실시간 관찰은 어떻게 하나요? 제브라피쉬 형질전환
    - RFP-SKL 라인은 peroxisome targeting signal1 (PTS1)을 이용한 형질전환 모델입니다. SKL (Ser-Lys-Leu) 서열은 PTS1 신호로 작용하며, 세포질 내 Peroxin 5 (Pex5) 단백질이 PTS1 수용체로서 작용하여 이 단백질을 peroxisome matrix 내부로 이동시키는 역할을 합니다.
     
    - RFP (red fluorescent protein)에 SKL을 fusion 시켜 발현을 유도함으로써 peroxisome이 붉은 형광을 띄게 하여 실시간으로 관찰이 가능합니다.
     
    - 이 Transgenic 시스템의 핵심은 세포의 생리적 상태를 방해하지 않고 peroxisome의 형태학적 변화 및 dynamic behavior를 실시간으로 관찰할 수 있다는 장점이 있습니다.
     
     
    [참고 그림]
     
     
     
     
    유사질문
    • 페록시좀을 생체에서 관찰할 수 있는 형질전환 제브리피쉬가 있나요?
    References
    • 1) Demers ND, Riccio V, Jo DS, Bhandari S, Law KB, Liao W, Kim C, McQuibban GA, Choe SK, Cho DH, Kim PK. PEX13 prevents pexophagy by regulating ubiquitinated PEX5 and peroxisomal ROS. Autophagy. 2023 Jun;19(6):1781-1802.
    •  
    • 2) Metz J, Castro IG, Schrader M. Peroxisome Motility Measurement and Quantification Assay. Bio Protoc. 2017 Sep 5;7(17):e2536. 
    •  
    • 3) Lorenz H, Hailey DW, Lippincott-Schwartz J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 2006 Mar;3(3):205-10.
    •  
    • 4) Yang YM, Ma HB, Xiong Y, Wu Q, Gao XK. PEX11B palmitoylation couples peroxisomal dysfunction with Schwann cells fail in diabetic neuropathy. J Biomed Sci. 2025 Feb 12;32(1):20.
    RFP-SKL peroxisome targeting signal1 (PTS1) 형질전환 peroxisome Fluorescence
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  • Peroxisome autophagy (Pexophagy)는 생체 내에서 어떻게 시각적·정량적으로 분석할 수 있을까요? 제브라피쉬 형질전환
    - Pexophagy는 세포 내 오래되거나 손상된 peroxisome이 lysosome에 의해 선택적으로 제거되는 자가포식 과정입니다. 제거될 Peroxisome이 인식되면, 이중막 구조인 autophagosome을 형성하고 이 후 Lysosome과 융합하여 autolysosome을 형성하게 되며, 내부는 산성화(pH4.5~5.5)가 되어 다양한 단백질 분해효소가 활성화되고, 이로 인해 손상된 peroxisome이 분해됨으로써 세포 항상성이 유지됩니다.
     
    - Autophagy 과정에서의 세포 내 pH가 변화하는 원리를 활용하여 pH-sensitive fluorescent protein (e.g.., pHluorin)을 이용한 Transgenic system이 유용하게 사용됩니다. 정상적인 peroxisome의 경우, 중성 pH를 유지하기 때문에 mCherry와 pHluorin이 동시에 발현되어 노란색 형광(적색 + 녹색)을 나타냅니다. 반면, Pexophagy가 진행되면 Peroxisome이 lysosome과 융합하면서 산성 pH에 노출되고 이로 인해 pHluorin 형광은 불안정해져 감소하게 됩니다. 결과적으로 mCherry 형광만 남아 적색 형광을 나타내게 되어 이를 통해 Pexophagy의 진행 여부를 시각적으로 확인할 수 있습니다.
     
    - pHluorin을 이용한 Transgenic system 활용은 조직이나 생체 내에서도 Peroxisome의 변화를 시각적으로 분석할 수 있으며, mCherry/pHluorin 형광 비율을 측정함으로서 pexophagy의 활성 정도를 정량적으로 평가할 수 있다는 장점이 있습니다.
     
     
    [참고 그림]
     
     

     

    유사질문
    • Mitochondria를 포함한 기타 세포소기관의 선택적 autophagy도 유사한 방식으로 관찰 및 평가가 가능할까요?
    References
      1) Isei Tanida, Takashi Ueno. A super-ecliptic, pHluorin-mKate2, tandem fluorescent protein-tagged human LC3 for the monitoring of mammalian autophagy. PLoS One. 2014 Oct 23;9(10):e110600.
       
      2) Sushil Bhandari, Yong-Il Kim, et al. Loss of pex5 sensitizes zebrafish to fasting due to deregulated mitochondria, mTOR, and autophagy. Cell Mol Life Sci. 2023 Feb 23;80(3):69.
       
      3) Laura F DiGiovanni,  Prabhsimran K Khroud, et al. ROS transfer at peroxisome-mitochondria contact regulates mitochondrial redox. Science. 2025 Jul 10;389(6756):157-162.
       
      4) Nicholas D Demers,  Victoria Riccio, et al. PEX13 prevents pexophagy by regulating ubiquitinated PEX5 and peroxisomal ROS. Autophagy. 2023 Jun;19(6):1781-1802.
    •   
    형질전환 Fluorescence Autophagy Peroxisome Organelle
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  • 대식세포 형질전환 제브라피쉬를 알고 싶어요 제브라피쉬 형질전환

    대식세포 형질전환 제브라피쉬의 유전자 이름은 mpeg으로 대식세포 계통 세포만 특이적으로 표지하여 형광이 발현되도록 제작한 형질유전자입니다. 그렇기 때문에 호중구 표지 형질유전자는 발현하지 않습니다.

     

    제브라피쉬의 대식세포도 포유류와 동일하게 난황난에서 원시전구대식세포를 생성하고, 특정시기가 되면 조직정착대식세포와 순환계세포(단핵구)로 이동하여 면역세포의 기능을 하기 위해  분화 및 성숙하는 단계를 거치기 때문에 포유류와 유사한 면역반응을 관찰할 수 있어, 면역반응 연구에 활용합니다.

     

        - 다른 형질전환 제브라피쉬와 달리, 배아에서의 mpeg 형질유전자는 PFA로 고정 할 경우 평균 2-3시간이 경과하면 형광이 사라집니다. 유전형질의 변화 또는 화합물질을 처리한 배아에서의 mpeg 형광은 건강한 배아에 비해 빨리 사라지기 때문에, 배아에서의 mpeg관찰은 살아있는 상태에서 마취하여 관찰하는 것을 제안합니다.

     

     

    * 그림출처: 한서대 차선희교수

    유사질문
    • 공초점형광현미경으로 면역세포 관찰이 되지 않아요
    References
      1. Ellett et al., Blood. 2010 Nov 17;117(4):e49–e56 “mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish”
    제브라피쉬 면역반응 대식세포 zebrafish macrophage macrophage
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  • Knock-in 제브라피쉬를 제작할 수 있나요? 제브라피쉬 형질전환

    1. knock-in은 제브라피쉬 유전체의 특정 위치에 원하는 DNA 서열(형광리포터, 에피토프 태그, 포인트 변이 등)을 넣어 기능을 관찰하거나 조절할 수 있게 만드는 기술입니다. 핵심은 CRISPR/Cas9로 표적 위치를 자른 뒤, 공여(donor) DNA가 수선 과정에서 정확히 통합되도록 유도하는 것입니다. 이 기술은 단순히 유전자의 기능을 없애는 knock-out과 달리, 새로운 기능을 넣거나 시각화 도구를 삽입할 수 있어 정교한 연구에 활용됩니다. 예를 들어, 세포 안에서 어떤 유전자가 발현되는지를 관찰하기 위해 그 옆에 형광 단백질(GFP, RFP 등)을 붙여 넣을 수 있습니다. 이렇게 하면 세포가 유전자를 발현할 때마다 특정 형광을 내어 관찰할 수 있습니다. 특히  제브라피쉬는 투명한 배아를 가지고 있어 현미경으로 발달 과정을 직접 볼 수 있기 때문에 knock-in 기술은 다음과 같은 연구에 효과적으로 활용될 수 있습니다.

     

    2. 형광 리포터 제작 및 유전자 기능 연구 

     

    특정 유전자 옆에 형광 리포터를 붙여, 해당 유전자가 언제, 어디에서 발현되는지를 생체 내에서 직접 관찰 및 추적할 수 있습니다. 특히 제브라피쉬의 투명한 배아 특성 덕분에 시간 경과에 따른 발달 과정을 장시간 촬영하기 용이합니다.

     

    *그림 출처 : Chestnut B et al. Developmental Dynamics. 2020 Feb;249(2):245-261

     

    3. 질병 모델 제작: 제브라피쉬에서 인간의 돌연변이 유전자를 발현시킬 수 있는 라인을 구축할 수 있습니다.

    이를 통해 질병 과정을 재현하고 실제로 어떤 문제가 생기는지 연구할 수 있습니다.

     

    4. 약물 스크리닝 활용: 특정 세포(예: 신경세포, 혈관세포)에서 빛나는 라인을 만들어 약물이 특정 세포 및 기관의 기능에 어떤 영향을 주는지 빠르게 확인할 수 있습니다.

    *그림 출처 : Shi Ouyang et al. Front Cardiovasc Med. 2022 Apr 5:9:839166

     

    유사질문
    • Knock-in이란 무엇이며, 제브라피쉬 연구에서 어떻게 활용될 수 있나요?
    References
    • 1. Chestnut B, Sumanas S. Zebrafish etv2 knock-in line labels vascular endothelial and blood progenitor cells. Developmental Dynamics. 2020; 249: 245–261.
    •  
    • 2. Ouyang S, Qin WM, Niu YJ, Ding YH, Deng Y. An EGFP Knock-in Zebrafish Experimental Model Used in Evaluation of the Amantadine Drug Safety During Early Cardiogenesis. Front Cardiovasc Med. 2022;9:839166.
    •  
    제브라피쉬 Knock-in, CRISPR/Cas9 유전자 편집, 형광 리포터 라인
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  • 제브라피쉬에서 운동신경계 연구를 할 수 있나요? 제브라피쉬 형질전환

    * 제브라피쉬 운동신경계

     

    제브라피쉬(zebrafish, Danio rerio)는 운동신경계는 구조적으로 단순하면서도 보존성이 높아,

    포유류 운동신경계의 기본 원리를 잘 반영하고 있어 척추동물 신경계 연구, 특히 운동신경계 발달과 기능을 이해하는 데 널리 쓰이고 있습니다.

    인간의 운동 신경계는 척수 (spinal cord), 뇌간 (brainstem), 운동피질 (motor cortex)의 세 가지 제어 수준으로 계층적으로 구성되어 있으나, 제브라피쉬의 운동신경계는 대뇌운동피질 경로가 없으며, 뇌간에서 운동명령을 전달하는 상위 신경세포와 하위의 근육과 연결된 신경회로를 가집니다.

     

    * 그림 출처: Prog Neurobiol. 2014 Jul;118:36-58.

     

     

    ◆ 1차 운동신경세포 (Primary motor neuron, PMNs)
     

      - 배아기 (약 수정 후 17-20시간)부터 가장 먼저 발생됨

     

      - 큰 세포체와 축삭을 가지며, 수가 적음

     

      - fast muscle 에 운동신경(motor nerve)이 연결됨

     

      - 크고 빠른 반응과 강한 수축성 운동을 조절

       (escape, fast swimming, spontaneous coiling)

     

      - 운동신경세포의 축삭 방향에 따라 4가지 유형으로 구분

        • CaP (Caudal Primary motor neuron): 척수에서 배측으로 나와 꼬리근육 ventral 영역을 조절.
        • MiP (Middle Primary motor neuron): 등쪽으로 뻗어 dorsal 근육을 조절.
        • RoP (Rostral Primary motor neuron): 상대적으로 작은 세포, 주로 몸통 근육 innervation.
        • VaP (Variable Primary motor neuron): 일부 개체에서만 나타남.
     
     

    * 그림 출처: Dis Model Mech (2012) 5 (6): 921–929.

     

    * 그림 출처: Dev Biol. 2001 Jul 1;235(1):86-97.

     

     

    ◆ 2차 운동신경세포 (Secondary motor neuron, SMNs)

     

      - PMN 발달 이후 형성되나 PMN보다 아랫쪽 척수에 훨씬 많은 숫자로 형성됨

     

      - 상대적으로 작은 세포체와 얇은 운동신경을 가지고 있음

     

      - fast, slow muscle 에 운동신경(motor nerve)이 연결됨

     

      - 체절별 근육의 정교한 조절을 담당하여 운동의 미세조율, 유영 지속에 관여

     

    * 그림 출처: Prog Neurobiol. 2014 Jul;118:36-58.

     

     

    ◆  운동신경 표지 형질전환 제브라피쉬
     
     • mnx1 (previous name- hb9) 유전자 활용 – ex) Tg(mnx1:EGFP), Tg(mnx1:mCherry)
     
     • olig2 유전자 활용 – ex) Tg(olig2:EGFP), Tg(olig2:dsRed)
     
     • Isl1 유전자 활용 – ex) Tg(isl1:GFP)

    * 그림 출처: Methods Protoc. 2023, 6(6), 116

    * 그림 출처: Toxicology and Applied Pharmacology 237(1):29-40

     

     

    ◆ 형질전환 물고기를 이용한 운동신경 손상 측정 지표
     
    • 운동신경 세포 수의 비교

       - 형광 현미경/공초점 현미경을 활용하여 척수를 이미징 한 후 특정 체절 (segment) 내의 세포 수 측정

     
    • 축삭 형태 비교  

       - 전체 축삭 길이 (from soma to axon tip) 측정

     

       - 분지 (branch point)의 수 및 패턴 관찰

     

       - 잘못된 경로로 뻗은 축삭 (pathfinding error) 빈도 정량화

     
    • 근육신경접합부(neuromuscular junction) 정량화

     

        - presynaptic marker, postsynaptic marker의 수/면적  및 겹침 (co-localization) 비율 비교         

     

                               

     

    * Tg(olig2:dsRed) 이미징을 통해 측정할 수 있는 운동신경 지표

     

    * Tg(mnx1:mCherry) 이미징을 통해 관찰되는 운동신경세포

     

    * NMJ colocalization

              

    유사질문
    • 제브라피쉬에서 axonopathy를 분석할 수 있나요?
    • 제브라피쉬를 이용해서 신경세포 축삭을 관찰할 수 있나요?
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  • 형질전환 제브라피쉬(Tg zebrafish)는 어떻게 제작하나요? 제브라피쉬 형질전환

    Tol2 transposon system은 제브라피쉬 게놈에 외래 유전자를 효율적으로 삽입하기 위해 널리 사용되는 방법입니다.

    관심 유전자를 포함한 Tol2 양팔 벡터와 Tol2 transposase mRNA를 1-cell stage 배아에 미세주입하여 형질전환을 유도합니다.

     

    주요 단계는

    ① 플라스미드 설계 → ② transposase mRNA 합성 → ③ 수정란 주입 → ④ F0 형광 스크리닝 → ⑤ F1 세대에서 germline 전달 확인 → ⑥ 안정 라인 확립 입니다.

    장점은 삽입 효율이 높고 다양한 프로모터/리포터 조합이 가능하다는 점이며, 주의사항으로는 주입량 과다로 인한 독성, 무작위 삽입에 따른 발현 패턴 변동, 다중 삽입 가능성 등이 있습니다.

     

    따라서 Tol2 시스템은 zebrafish Tg 라인 제작의 표준으로 활용되며, 발생학·질환 모델링·약물 스크리닝 등 다양한 연구 분야에서 핵심적인 도구로 이용됩니다.

     

     

    * 그림출처: Koichi Kawakami. Genomr Biol. 2007;8(Suppl 1):S7.

     

     

    유사질문
    • Tol2 transposon system을 이용해 제브라피쉬 형질전환(Tg) 라인을 만드는 구체적 방법 무엇인가요?
    • Tol2 시스템을 이용한 형질전환의 장단점은?
    References
    • 1) Kawakami K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 2007;8(Suppl 1):S7.
    •  
    • 2) Kwan KM, Fujimoto E, Grabher C, et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 2007;236(11):3088–3099.
    •  
    • 3) Huang P, Zhu Z, Lin S, Zhang B. Reverse genetic approaches in zebrafish. J Genet Genomics. 2012;39(9):421–433.
    •  
    Zebrafish Transgenic line Tol2
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