[노화와 관련된 바이오마커, β-Galactosidase 염색]

제브라피쉬 노화 연구에서 β-Galactosidase 염색은 세포 노화와 관련된 주요 바이오마커로 사용되고 있습니다.

노화된 세포에서는 pH 6.0에서 활성화되는 Senescence-Associated β-Galactosidase 형태의 β-Galactosidase가 나타납니다. 이 효소는 젊은 세포에서는 거의 검출되지 않지만 노화된 세포에서는 높은 활성도를 보입니다. β-Galactosidase 염색은 노화된 세포를 파란색으로 염색한 후 시각적 확인을 통해 다양한 조직의 노화 상태를 평가할 수 있습니다.

그림 1. 제브라피쉬의 유생 및 성체에서의 β-Galactosidase 염색

* 그림출처: Kishi S et al. PLoS Genet. 2008;4(8):e1000152.

[β-Galactosidase 염색 실험방법 ]

1. 샘플들을 fixation buffer에 넣고 4℃에서 overnight 합니다.
2. 다음날 샘플들을 4번에 걸쳐 PBS에 세척해 줍니다.
3. 37℃에서 24시간 *염색용액(Staining Solution, Reagent B, Reagent C, X-gal Solution, UPW)을 처리해 줍니다.
4. 다음날 3번에 걸쳐 PBS에 세척해 줍니다.
5. 모든 과정이 끝난 후 이미징을 하거나 PBS+0.1% NaN3 또는 70% Glycerol를 넣어 4℃에 보관해줍니다.

*Senescence Cell Histochemical Staining Kit (Sigma-Aldrich, CS0030-1KT)

[제브라피쉬 마이크로바이옴 연구 개요]

제브라피쉬도 다른 동물들과 마찬가지로 발생 중과 성체 모두 각각 단계별, 조직 특이적인 마이크로바이옴을 가지고 있으며 다양한 질병의 조건에서 장내불균형을 보입니다. 이를 기초로 하여, 제브라피쉬와 장내미생물의 상호작용을 통한 각종 생리조절과 질병발생 기전을 이해하고 유용 마이크로바이옴을 이용한 개선효과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있습니다.

1. 발생 및 조성: 수정 후 3일 입이 열리고 장관(Gastrointestinal Tract) 발생이 진행되면서 초기 마이크로바이옴의 정착이 시작됩니다. 발달단계별(라바, 청소년기;Juvenile, 성체) 특이적인 마이크로바이옴이 형성되며 이러한 형성과정에서 특히 Proteobacteria 문이 구성에서 급격한 변화를 보이는 것으로 알려져 있습니다.

2. 사람 마이크로바이옴과 비교: 사람과 제브라피쉬의 마이크로바이옴은 대부분의 마이크로바이옴 문(門, 6종류의 문)을 공유하지만 우점하는 종류에서 차이가 있습니다. (사람은 Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria가 대표적인 문인 반면 제브라피쉬는 Proteobacteria, Firmicutes, Fusobacterium이 대표적입니다.) 다만, 우점 마이크로바이옴의 종류가 다르더라도 미생물에 대한 기주(Host)의 반응은 사람과 제브라피쉬 간에 잘 보존되어 있다는 것이 알려져 있습니다.

3. 기능연구: 라바단계에서의 무균 구축조건과 미생물 또는 대사체 처리 조건이 잘 확립되어 있어 특정세균의 처리 및 정착을 통한 기능연구가 용이합니다. 따라서 제브라피쉬 모델의 장점인 돌연변이체 및 형질전환체 확보의 용이성, 실시간 고해상도 형광 이미징 등의  특징과 결합하여 기주와 마이크로바이옴 상호작용에 대한 새로운 시각의 기능연구를 수행할 수 있습니다.

[제브라피쉬 마이크로바이옴 연구 기법]

1. 장마이크로바이옴 분석 방법
- 16S rRNA sequencing: 제브라피쉬를 포함하여 일반적으로 마이크로바이옴 분석을 위하여 가장 일반적으로 사용하는 방법이며, 개체에서 DNA 추출 후 박테리아 특이적 16S rDNA의 일부를 증폭하여 염기서열을 확인함으로써 장마이크로바이옴의 다양성을 확인하는 방법입니다.

1) 제브라피쉬 라바 장의 분리 (6일 라바 기준): tricane으로 마취한 라바를 멸균된 침으로 항문근처를 고정하고 해부용 칼을 이용하여 아가미 부분을 절개 및 고정 후  전체 장을 위쪽에서부터 추출. (3~40마리 Pooling)
2) Lysis buffer에 넣고 bead beating으로 파쇄 후 리조자임 분해 뒤 Qiagen Dneasy Kit를 이용하여 DNA 추출
3) 추출된 DNA를 이용하여 V3-V4 부위를 PCR 증폭 후 일루미나 NGS 통해 염기서열 확보
4) 확보된 박테리아 염기서열을 QIIME 파이프라인 기반 생물분석학적 분석을 통해 각 조건의 샘플 내 및 샘플 간의 다양성 (각각 ɑ- diversity, 𝛽-diversity) 분석 및 후보미생물 도출

그림 1. 제브라피쉬 라바의 장 적출 예시

그림 2. 16S rRNA sequencing 분석 예시

* 그림출처: Lee JG et al. Microbiome. 2022;10(1):3.

2. 무균 제브라피쉬 라바 구축: 무균동물(Germ-free Animal)은 체표면 및 체내에 다른 생명체에 존재하지 않는 개체를 의미하며 마이크로바이옴과 기주의 상호작용 연구를 위한 주요한 자원으로 활용됩니다. 제브라피쉬의 경우, 외부 음식섭취가 필요없는 수정 후 7일 전후 라바 시기에 상대적으로 손쉽게 무균화가 가능한 장점이 있습니다. 최근 일부 연구에서 무균화된 성체 제브라피쉬를 사용한 보고가 있습니다. 

1) 수정란에 암포테리신, 암시실린, 카나마이신 항생제 조합의 배양액에서 28℃에서 약 5-6시간 배양
2) 0.1% 포비돈 아이오딘에 2분간 노출하여 1차 무균화 유도 후 세척
3) 0.003% 차아염소산나트륨에 20분간 담궈 2차 무균화 유도 후 세척 및 28℃에서 보관
4) 무균화 조건 검증을 위해 매일 호기조건 및 혐기조건에서 사육수 일부를 영양배지(예: TSA 배지)에 떨어뜨려 5일간 배양 후 미생물 생장 확인

그림 3. 제브라피쉬 라바 무균화 모식도

그림 4. 무균화 조건 검증을 위한 미생물 생장 확인 예시

제브라피쉬 배아는 어둠 조건에서 활발하게 움직이며 빛 조건에서 거의 움직이지 않는 특성을 가지고 있습니다. 이러한 제브라피쉬 배아의 행동특성을 DanioVision, Viewpoint와 같은 장비로 추적할 수 있으며 신경행동 기반의 다양한 end point를 이용하여 신경독성을 평가할 수 있습니다. 

* 신경행동의 end point: 총 움직인 거리, 수영속도(mm/s, freezing: ≤5, cruising: 5-20, bursting: ≥20)별 기간, 거리, 횟수 등

그림 1. 제브라피쉬 신경행동 분석절차

활성산소종(ROS)의 항상성 유지는 세포성장과 생존에 매우 중요하다. 세포 내 활성산소종의 증가는 산화 스트레스를 유발하여 세포를 손상시키며, 활성산소종을 2차 메신저로 사용하는 신호전달체계를 통해 세포사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다.
제브라피쉬에서 Reactive Oxygen Species (ROS) 생성 및 산화 스트레스를 측정하는 시험법으로 일반적으로 다음과 같은 방법이 사용된다.

1. Dichlorofluorescein Diacetate (DCFDA /H2DCFDA) 염색
2. MitoSOX Red 염색 (미토콘드리아 내 ROS 측정)
3. Dihydroethidium (DHE) 염색
4. Enzyme-linked Assays (예: Superoxide Dismutase, Catalase Activity)

가장 많이 사용되는 Dichlorofluorescein Diacetate (DCFDA /H2DCFDA) 염색법은 제브라피쉬 배아의 ROS를 시각화하고 정량화 하는데 효과적이며, ROS 수준에 따른 산화 스트레스 연구에 유용하다. 

DCFDA/H2DCFDA를 이용한 활성산소 생성 평가방법은 약물에 의해 변화되는 활성산소를 측정하기 위해 세포 내에서 하이드록실, 퍼옥실 및 기타 반응성 산소종의 활성을 측정하는 분소생성 염료를 이용한 방법이다. 세포 내 에스터라제(Esterase)에 의해 탈아세틸화되어 비형광성 화합물이 되고, ROS에 의해 2‘, 7’-디클로로플루오레세인(DCF)로 산화된다. DCF는 높은 형광을 가지며 485/535nm에서 excitation/emission하는 파장에서 형광 분광법에 의해 검출되어 형광의 강도는 ROS 생성 정도를 나타낸다.

그림 1. DCFDA 원리 

* 그림출처: Lyublinskaya OG et al. Redox Biol. 2017;12:758-769.

[시험방법]

1. 그룹군 당 적정한 발생 단계에 따라 예비실험을 통하여 적절한 개체 수를 선택(Ex: 120 hpf, 15-30마리)한다.
2. DCFDA stock solution을 E3 배양액에 희석하여 최종 농도가 5-20μM이 되도록 한다.
3. 준비된 DCF-DA 용액에 배아를 넣고 빛을 피하여 30-60분간 28.5°C에서 배양한다. (DCF-DA는 빛에 민감하므로 어두운 곳에서 실험을 진행하는 것이 좋다.)
4. 염색 후 남아있는 DCFDA를 제거하기 위해 배아를 E3 배양액으로 3회 이상 세척한다. 
5. 형광 현미경 또는 confocal 현미경을 사용하여 ROS에 의해 형성된 DCF의 형광 신호를 관찰한다. 일반적으로 DCF의 형광은 녹색(488 nm에서 흡수, 525-530nm에서 방출)으로 나타난다.
6. 형광분광기에 넣고 485/535nm 파장에서 형광의 세기를 측정한다. 
7. 측정된 결과는 대조군 및 실험군의 형광 강도를 비교하여 ROS 생성량을 평가한다. 결과는 형광 강도의 평균값을 산출하고 실험군의 ROS 생성 여부를 통계적으로 분석할 수 있다.

그림 2. DCFDA 방법을 이용한 ROS 측정 예시

* 그림출처: Issac PK et al. Fish Physiol Biochem. 2021;47(2):293-311.

어류의 배아 단계에서 화학 물질의 급성 독성을 확인하기 위해 고안된 OECD Test Guideline No. 236 "Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test" 를 따르며 실험 목적에 따라 시험법을 변형하여 사용합니다.

제브라피쉬 배아의 화학물질 급성 독성 시험을 위하여 96시간 동안 테스트 화학물질에 노출하며, 매 24시간 동안 치사율의 지표로 최대 4개의 정점 관찰기록을 통하여 물고기의 50%를 죽이는 농도(LC₅₀)를 결정합니다.

[관찰지표]

1. Coagulation of fertilized eggs 
2. Lack of somite formation 
3. Lack of detachment of the tail-bud from the yolk sac 
4. Lack of heartbeat

그림 1. 제브라피쉬 배아 급성 독성 시험에 사용되는 관찰지표 대표 표현형

* 그림출처: Bai H et al. Mar Biotechnol (NY). 2016;18(2):264-270.

[실험방법]

1. 실험 준비물
 1) 테스트 물질
 2) 양성 대조물질 : 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA)
 3) 유기용매 대조군 (유기용매 사용 시)
 4) 시험용기: 96-well plate
 5) Media

2. 배아준비
 1) 시험 전날 저녁, 성체 제브라피쉬를 mating tank에 암수가 분리되게 준비한다.
 2) 시험 당일 아침, 암수 분리막을 제거하여 제브라피쉬의 mating을 시작한다.
 3) 교배 시작 3시간 후 산란알을 수거한다.
 4) 수거한 산란알에서 발생 시기가 동일한 수정란을 선별하여 준비한다.

그림 2. 제브라피쉬 배아 급성 독성 시험

* 그림출처: Lammer E et al. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2009;149(2):196-209.

3. 시료 준비
 1) 시료준비는 2-2)를 수행하고 바로 시작한다.
 2) 양성 대조물질은 4 mg/L 3,4-dichloroaniline으로 준비한다.
 3) 테스트 물질의 stock solution 농도는 100-1000X로 준비한다.
 4) Working solution은 stock solution을 희석하여 1X, 0.46X, 0.22X, 0.1X, 0.046X, 0.022X, 0.01X 7가지 농도로 준비한다. (약물별로 농도가 다르니 그에 맞는 농도로 준비할 것.)
 5) 유기용매를 사용할 경우, 유기용매 대조군을 준비하며 최대 농도는 0.1%를 넘지 않도록 한다.
 6) 준비한 시료(대조군, 양성 대조군, 용매 대조군, 테스트군)는 96-well plate에 분주하여 incubator (26±1 ℃)에서 준비한다.

그림 3. 독성시험에 적합한 로그식 농도(출처: OECD Guideline No. 215)

4. 본시험
 1) 3-6)에서 준비한 96-well plate에 2-4) 에서 준비한 수정란을 각 well 당 한 개체씩 노출되도록 옮긴다. 이때, 약물처리 시작 시간은 수정 후 4시간을 초과하지 않도록 주의한다.
 2) 분주를 완료한 plate는 parafilm으로 sealing 한 후, 수정 후 120시간까지 incubator(26±1 ℃)에서 배양한다. 

5. 관찰
 1) 24시간마다 well plate를 꺼내어 독성 영향을 확인한다. 시간별 관찰사항은 엑셀 파일에 작성한다.
 2) 살아남은 개체의 수는 mortality part에 기입하고 malformation이 일어난 경우, 그 수를 기입한다. 
 3) 대조군에 비해 발달이 많이 늦어질 경우에는 발생이 지연된 개체의 수를 기입한다.  (Developmental delay의 경우, 발달단계 전후 4시간까지 정상범위로 간주한다.)

6. 시험의 유효성 기준
 1) 산란알의 수정률은 70% 이상이어야 한다.
 2) 시험기간 동안 온도는 26±1 ℃로 유지되어야 한다.
 3) 대조군(및 용매 대조군)에서 배아의 생존율은 90% 이상이어야 한다.
 4) 120시간 관찰 시, 양성 대조군(3,4-dichloroaniline)은 최소 30%의 치사를 나타내야 한다.
 5) 대조군의 부화율이 80% 이상이어야 한다.

제브라피쉬는 염증 반응을 경험할 수 있는 동물 모델로 인간의 면역 시스템과 유사한 면역 반응을 보입니다. 이 특성으로 인해 제브라피쉬는 감염이나 상해에 대응하는 염증 과정을 연구하는 데 매우 유용합니다. 특히 염증성 장 질환 및 감염성 질환 등 다양한 염증 관련 질병의 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 역할을 하고 있습니다.

* 그림출처: Xie Y et al. Front Cell Dev Biol. 2021;8:620984.

제브라피쉬에서의 염증 유발 모델로는 여러 방법이 있으며, 이 중 하나는 리포다당(LPS)을 사용하는 것입니다. LPS는 강력한 염증 유발제로서, 제브라피쉬에 주입하거나 처리하였을 때 신속하게 염증 반응을 유발합니다. 이 모델에서 염증의 진행은 호중구의 증식을 포함하여 다양한 면역 반응의 활성화를 통해 관찰될 수 있습니다. Sudan Black B 염색을 사용하여 초기 염증 단계에서 활성화된 호중구를 특정할 수 있으며, 이는 염증의 초기 응답을 시각적으로 확인하는 데 유용합니다.

또한 염증과 관련된 주요 사이토카인 및 전사 인자의 발현 분석을 통해 염증 반응의 정도를 정량적으로 평가할 수 있습니다. IL1B, NFkB, TNFa 등의 유전자는 염증의 중요한 마커로서 이들의 발현 변화는 RT-PCR과 western blotting을 통해 확인이 가능합니다. 
항염증 물질의 스크리닝에 있어서 LPS로 유도된 염증 모델은 후보 물질의 염증 억제 효과를 평가하는데 중요합니다. 후보 물질을 다양한 농도로 처리하여 염증 반응에 미치는 영향을 관찰함으로써 효과적인 항염증 물질을 선별할 수 있습니다. 이 과정에서 생체 내 염증 억제 효과를 입증하는 것은 새로운 항염증 치료제 개발의 중요한 단계입니다.

* 그림출처: Lee S et al. Sci Rep. 2024;14(1):5237.

[근육이란?]

골격근은 크게 속근과 지근 2가지 근육으로 구성됩니다.

속근(Fast Muscle)은 주로 해당 섬유(Glycolytic Fiber Type)로 구성되어 있어 ATP를 생성할 때 혐기성 과정인 해당과정을 통해 에너지를 만듭니다. 이 때문에 산소 소요량이 적고 모세혈관의 분포도 적습니다. 또한 미토콘드리아의 수가 적어 산소 의존성이 낮습니다. 속근은 수축 속도가 빨라 즉각적이고 강한 힘을 발휘할 수 있지만, 피로에 대한 저항성이 낮아 지속적으로 사용되는 근육에는 상대적으로 적은 비율로 분포합니다.

지근(Slow Muscle)은 산화 섬유(Oxidative Fiber Type)로 이루어져 있어 산소를 이용해 천천히 근육 수축이 일어납니다. 산소를 활용하기 때문에 모세혈관의 분포가 많고 미토콘드리아의 수도 풍부하여 지구력이 필요한 근육에 높은 비율로 분포합니다.

골격근은 척추동물 체중의 상당 부분(체중의 약 35- 60%)을 차지하며 물고기도 예외는 아닙니다.

[구조적 차이]

- 인간 : 인간의 골격근은 목적에 따라 속근과 지근의 비율이 다르게 구성되어 있습니다. 예를 들어, 허벅지 앞쪽에 위치한 대퇴사두근과 대퇴이두근은 속근의 비율이 높아 점프와 같은 큰 힘을 요구하는 운동에 적합하지만 종아리 근육과 척추기립근은 지근의 비율이 높아 자세 유지와 같은 지속적인 활동에 더 적합하게 구성되어 있습니다.

- 제브라피쉬 : 성체 제브라피쉬의 몸통 근육은 약 32개의 근절(Myotomes)로 구성되어 있으며 인간의 근육과는 다른 분포를 보입니다. 제브라피쉬의 골격근은 대부분 속근으로 이루어져 있으며, 주로 내측에 위치하지만 지근은 측선(Lateral Line)을 따라 분포해 있어 속근과 지근이 인간보다 더 뚜렷하게 구분됩니다. 또한 배아가 투명하기 때문에 근육 발달과 재생 과정을 연구하는 데 유용하다는 장점이 있습니다.
 

[발달과 성장과정 차이]

- 인간 : 인간의 근육은 태어나기 전에 형성되며 출생 후 성인이 되기까지 근육의 양과 질이 서서히 증가하고 발달합니다.
- 제브라피쉬 : 제브라피쉬는 배아 단계에서 근육이 빠르게 발달합니다. 제브라피쉬는 인간에 비해 근육 형성이 훨씬 빠르게 이루어져 일반적으로 3개월 이내에 성체로 성장하며, 수정 후 약 3일 정도 지나면 근육뿐만 아니라 기본적인 신경계와 장기 구조도 형성됩니다. 

[근육 관찰]

제브라피쉬의 근육은 주로 광학 및 형광 현미경을 이용하여 관찰합니다.
1. 제브라피쉬의 배아, 유충의 경우 몸이 투명하기 때문에 살아있는 상태를 광학현미경을 통해 관찰이 가능합니다.

그림 1. 편광을 이용한 제브라피쉬 근육 관찰: 편광을 이용하면 정상 근육의 경우 편광에 반사되어 밝게 빛나는 반면 손상된 근육은 편광이 통과하여 어둡게 나타나게 됩니다.

* 그림출처: Gupta V et al. Hum Mol Genet. 2011;20(9):1712-1725.

그림 2. 제브라피쉬 근육에 손상을 준 후 1, 3일 후 근육 재생 관련 연구

* 그림출처: Ratnayake D et al. Methods Mol Biol. 2019;1889:245-254.

2. 성체의 경우 근섬유가 구분되어 있어 특정 형광을 이용하여 근육의 구조 관찰이 가능합니다.

그림 3. 근육의 다양성

* 그림출처: Schiaffino S. FEBS J. 2018;285(20):3688-3694.

형광면역염색(Fluorescence Immunostaining)과 형질전환체(Transgenic Organisms)를 이용한 세포소기관 관찰은 생물학 및 세포생물학에서 자주 사용하는 기법입니다. 각각의 방법이 세포소기관을 시각화하고 연구하는데 어떤 역할을 하는지 설명해 보겠습니다.

1. 형광면역염색(Fluorescence Immunostaining)

형광면역염색은 특정 단백질이나 항원에 결합하는 항체에 형광 표지를 달아 세포 또는 조직 내에서 특정 단백질의 위치를 시각화하는 방법입니다.
 1) 항원 인식: 관심 있는 단백질(항원)을 인식하는 1차 항체를 사용합니다.
 2) 형광 표지: 형광 표지가 결합된 2차 항체를 사용하여 1차 항체에 결합합니다. 이렇게 함으로써 형광을 발산할 수 있는 단백질 위치를 확인할 수 있습니다.
 3) 공초점현미경: 형광 신호를 발현하는 세포소기관을 공초점현미경을 통해 관찰할 수 있으며, 이를 통해 세포 소기관 내 단백질의 정확한 구조와 상호작용하는 세포소기관의 형태를 알 수 있습니다.
 4) 장점
  - 특정 단백질의 위치를 정확하게 확인 가능.
  - 다양한 형광 색소를 사용하여 여러 단백질을 동시에 시각화할 수 있음. (다중 염색)
 5) 단점
  - 고정된 세포에서만 수행할 수 있기 때문에 실시간으로 관찰 불가능하고 실험과정에서 단백질의 특성으로 인한 시료 고정 조건상 전처리 요구사항이나 1차항체의 반응성에 따라 비 특이적 신호 (Non-Specific Signal) 발생 가능성이 존재함.
  - 제브라피쉬의 경우 항체 반응성이 마우스나 랫드와 상이한 경우가 있을 수 있기 때문에 항체 사용 조건 확인이 필수적임.

2. 형질전환체(Transgenic Organisms) 

형질전환체는 외래 유전자를 세포나 생물체에 도입하여 원하는 유전자의 발현을 유도하거나 특정 유전자를 통해 형광 단백질을 발현시키는 방법입니다.
 1) 유전자 도입: 형질전환체를 만들기 위해 특정 유전자를 생물체에 삽입합니다. 보통 녹색형광단백질(GFP)과 같은 형광단백질 유전자를 삽입하여 특정 단백질 또는 세포소기관이 형광을 발현하도록 유도합니다.
 2) 세포소기관 표지: 특정 소기관에 대한 형광단백질을 발현시키면 이 소기관이 살아있는 상태에서도 실시간으로 형광을 발산하며 그 위치를 관찰할 수 있습니다.
 3) 형광현미경 관찰: 살아있는 세포나 생물체에서 형광을 발현하는 소기관의 위치와 형태 변화를 관찰할 수 있습니다.
 4) 장점
  - 특정 유전자 발현에 따른 세포의 동적 변화를 장기적으로 모니터링 할 수 있음.
  - 실시간 관찰이 가능하다는 점에서 고정된 세포를 관찰하는 형광면역염색과 차별화.
 5) 비교
  - 형광면역염색은 고정된 세포나 조직을 분석하는데 주로 사용되며 항체를 이용해 특정 단백질을 시각화합니다.
  - 형질전환체는 살아있는 세포에서 형광 단백질을 발현시키므로, 실시간으로 세포소기관의 위치와 이동을 추적할 수 있습니다. 이 두 방법은 세포소기관의 형태, 위치, 기능을 연구하는데 유용하며 연구 목적에 따라 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있습니다.

투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)은 세포소기관을 매우 높은 해상도로 관찰할 수 있는 중요한 도구입니다. TEM은 광학현미경보다 훨씬 작은 구조물까지 볼 수 있어 세포 내부 구조를 정밀하게 연구할 수 있습니다.

[TEM의 원리]

TEM은 전자빔을 이용해 매우 얇게 절단된 시료를 투과시키고 그 전자빔이 시료를 통과하면서 형성되는 상을 기록하여 이미지를 생성합니다. 전자는 파장이 매우 짧기 때문에 광학현미경보다 훨씬 높은 해상도를 제공합니다.

[TEM을 이용한 세포소기관 관찰 과정]

1. 시료 준비: TEM으로 세포를 관찰하기 위해서는 세포를 매우 얇게 절단해야 합니다(수십nm 두께). 시료는 일반적으로 고정(Fixation) 후 탈수 과정을 거쳐 플라스틱 수지에 포함된 상태로 절단됩니다.
2. 염색: 전자는 투과 중 물질과 상호작용하는 방식에 따라 이미지가 형성되기 때문에 시료는 전자를 잘 산란시키는 중금속 염료(예: 우라닐 아세테이트, 시트레이트)로 염색됩니다. 이를 통해 세포소기관 간의 명암 대비가 뚜렷해집니다.
3. 전자빔 조사: 매우 높은 에너지의 전자빔이 시료를 투과하면서 각 세포소기관이 전자를 산란시키는 정도에 따라 상이한 명암으로 나타납니다. 예를 들어, 미토콘드리아의 막 구조나 골지체의 층상 구조가 명확하게 드러납니다.
4. 이미지 형성: 전자가 투과된 후 형성된 이미지는 형광 스크린이나 디지털 감지 장치를 통해 관찰되며 이를 통해 세포 내부의 세포소기관을 nm 수준에서 시각화 할 수 있습니다.

그림 1. 미토콘드리아(초록색) 형질전환체 제브라피쉬 치어의 간과 창자 지역 단면 시료에 미세소관 단백질인 α-Tubulin(빨간색)을 형광면역염색 후 공초점현미경으로 적층촬영(Z-Stack)한 사진

그림 2. 미토콘드리아(초록색) 형질전환체 제브라피쉬 치어의 간 동결절편에 페록시좀 막단백질인 PMP70(빨간색)의 형광면역염색 시료를 공초점현미경으로 단층촬영한 사진

그림 3. 제브라피쉬 치어의 뇌세포를 투과전자현미경으로 관찰한 사진 (N=핵, M=미토콘드리아)

[세포소기관 관찰 예시]

1. 미토콘드리아: 이중막 구조와 내부의 크리스타(cristae: 주름 구조)를 상세히 관찰할 수 있습니다.
2. 소포체: 매끄러운 소포체(Smooth ER)와 거친 소포체(Rough ER)의 구분이 명확하게 보이며, 특히 거친 소포체에 부착된 리보솜도 관찰할 수 있습니다.
3. 골지체: 평평한 주머니 형태의 시스테르나(cisternae)가 층층이 쌓여 있는 구조를 고해상도로 볼 수 있습니다.
4. 리소좀 및 퍼옥시좀: 크기와 내용물에 따라 구분할 수 있으며 각각의 막 구조와 내부의 효소 등을 확인할 수 있습니다.

[TEM의 장점]

1. 고해상도: nm 수준의 세포소기관까지 관찰이 가능하여 미세한 세포 구조 연구에 적합합니다.
2. 정밀한 세포소기관 관찰: 세포의 내부 구조(막, 리보솜, 소기관의 크리스타 등)를 자세히 확인할 수 있습니다.

[TEM의 단점]

1. 시료가 살아있지 않음: 시료는 고정 및 절단되어야 하므로 살아있는 세포나 조직을 실시간으로 관찰할 수 없습니다.
2. 복잡한 시료 준비 과정: 시료를 매우 얇게 절단하고 염색하는 등의 과정이 필요하여 시간과 기술이 요구됩니다.

TEM은 매우 정밀한 세포 구조 관찰이 가능하지만 시료 준비 과정이 까다롭고 실시간으로 관찰할 수 없다는 한계도 존재합니다.

제브라피시의 경우에도 데이터베이스가 확보된 경우에 전사체를 비롯하여 단백질체나 대사체 분석이 가능합니다.

[전사체 분석]

1. Bulk RNA sequencing
 1) 제브라피쉬 성체나 배아를 모은 뒤 배지나 물을 최대한 제거해 줍니다.
 2) TRIzol을 비롯한 total RNA isolation protocol을 이용하여 RNA을 추출한 뒤 시퀀싱 회사에 의뢰합니다.

2. Single Cell RNA Seqeucing 
 1) 제브라피쉬 배아 30마리를 모은 뒤 배지를 최대한 제거해 줍니다.
 2) Liberase가 들어있는 PBS에 넣고 37℃에서 incubation 합니다.
 3) Mild pipetting을 통해서 single cell로 분리 합니다.
 4) Single cell로 분리한 뒤 complete RPMI media에 resuspension 합니다.
 5) 4℃로 냉장하여 시퀀싱 회사에 의뢰 합니다.

[단백질체 분석]

1. 제브라피시 배아나 성체를 이용한 샘플을 SDS-PAGE gel에 loading 합니다.
2. Loading된 샘플을 Coomassie Blue를 통해서 단백질 샘플의 상태를 확인합니다.
3. In gel digestion/solution digestion을 통해서 단백질을 peptide로 분리합니다.
4. LC/MS-MS를 통해서 단백질체를 분석합니다.
5. 기확보된 데이터베이스 및 라이브러리를 바탕으로 단백질체를 확인합니다.

[대사체 분석]

1. 분석하고자 하는 대사체에 따른 추출 용매를 선정합니다.
2. 제브라피시 배아나 성체 샘플을 -80℃에서 동결합니다.
3. 동결건조기를 이용하여 샘플을 동결건조 합니다.
4. 동결건조된 샘플에 추출 용매을 넣고 30분간 vortexing 합니다.
5. 원심분리기를 통해서 debris 제거하고 supernatants만 확보합니다.
6. 분석에 이용가능한 용매일 경우 그대로 LC/MS-MS 분석을 합니다.
7. LC를 할 수 없는 용매일는 speed vac으로 추출 용매를 증발시킵니다.
8. LC를 할 수 있는 적절한 용매에 용해(클로로포름, 메탄올 등)시킨 뒤 분석합니다.
9. MS dial 등 프로그램을 이용하여 분석된 물질을 동정합니다.

성체 제브라피쉬에서 혈액을 채취할 수 있습니다. 일반적으로 실험을 위해 소량의 제브라피쉬의 혈액을 채취할 때 다음과 같은 방법을 사용합니다. 가장 일반적인 방법은 물고기를 마취시킨 후, 꼬리 지느러미에서 가까운 동맥 또는 정맥을 통해 주사바늘을 사용하여 혈액을 채취하는 것입니다. 이러한 방법은 마취제로 Tricaine을 사용하여 살아있는 동물의 스트레스를 최소로 해주어야 합니다. 

두번째 방법은 제브라피쉬 성체를 마취 후 심장 천자(Puncture)를 통해 이루어지는데, 이는 첫번째 실험 방법에 비해 더 많은 양의 혈액이 필요할 때 사용됩니다. 이 실험 방법은 연구의 마지막 단계에서 수행되며 가능한 동물 고통을 최소화해야 합니다.

별도로 제브라피쉬 성체의 전체적인 혈액 분포를 확인하기 위해서는 제브라피쉬의 신장기관(Kidney Marrow)을 적출하여 진행합니다. 제브라피쉬에서는 조혈줄기세포를 포함한 혈액세포들이 대부분 신장에 분포하는데, 이는 인간과 포유류의 골수와 같은 역할을 합니다. 성체 제브라피쉬를 마취한 후, 배면을 절제하여 내부 기관을 제거하고 포셉을 이용하여 적출합니다. 이 과정에서도 마취제의 사용이 필요하며 마취제를 통해 안락사 단계를 진행시킨 후 실험을 진행하게  됩니다.

* 그림출처: Song H et al. Exp Mol Med. 2024;56(1):51-58.

적출된 신장기관은 피펫팅을 통해 분리할 수 있습니다. 분리된 혈액세포는 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 분석을 통해 크기와 granulocyte의 분포에 따라 적혈구와 골수세포, 그리고 림프구와 혈구 전구세포로 나누어 분리할 수 있습니다. 이러한 FACS 분석은 제브라피쉬 성체에서의 혈액세포의 항상성이나 혈액질환 모델 연구에 활발히 이용됩니다.

* 그림출처: Traver D et al. Nat Immunol. 2003;4(12):1238-1246.