[Rodent Whole Body Perfusion이란?]

고정의 목표는 조직을 살아있을 때와 유사한 상태로 빠르고 균일하게 보존하는 것입니다. 작은 조직은 고정액에 직접 담그는 방법이 효과적이지만, 뇌와 같은 큰 표본은 고정액이 모든 부위에 동일한 속도로 도달하지 않아 침지 고정이 어렵습니다. 순환계를 통해 고정액을 직접 주입하면 혈관 네트워크를 통해 신속하게 조직 전체에 고정액이 퍼질 수 있다는 장점이 있습니다. 

Whole body perfusion은 심장의 대동맥에서 가깝게 공급되는 혈액으로 순환되는 ‘뇌’와 같은 장기들을 고정할 때 적합합니다. 관류의 최종 성공 지표는 조직의  초미세구조의 보존입니다.

[Rodent Whole Body Perfusion 준비]

1. 관류 장치
Whole body perfusion을 위해서 순환계를 효과적으로 활용하려면 생리적 압력에 맞춰 일정한 압력을 유지하며 고정액을 관류하는 것이 중요합니다. 이를 위해 적절한 관류 장치가 필요할 수 있습니다.

2. Fixative & Perfusion Buffers
  1) Fixative: 4% Paraformaldehyde Fixative (Fixative 8% Paraformaldehyde Stock + 0.2M Sodium Phosphate Buffer; pH 7.4)

  2) Perfusion Buffers
   - Phosphate Buffered Saline; pH 7.4
   - HEPES Buffered Hanks Solution(HBHS) with Sodium Azide; pH 7.4

그림 1. 관류장치 예시

* 참고 동영상: Gage GJ et al. J Vis Exp. 2012;(65):3564.

[Rodent Whole Body Perfusion 과정]

1. 관류 장치 준비
 1) 고정액 라인 준비
  먼저 고정액 라인을 준비합니다. 주사기를 사용하여 버퍼를 빠르게 주입하고 빼내면서 튜브 내 공기 방울을 제거하고 버퍼로 채웁니다. 그 다음, 바늘 끝의 밸브를 닫습니다. 고정액 라인을 고정액 병에 연결할 때 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오.

그림 2. 관류장치 준비

 2) 버퍼 라인 준비
 먼저 바늘 끝의 밸브를 열고 버퍼 밸브(파란색)를 흐름 위치로 돌립니다. 주사기를 사용하여 버퍼를 빠르게 주입하고 빼내면서 튜뷰 내 공기 방울을 제거하고 버퍼로 채운 후, 바늘 끝의 밸브를 닫습니다. 튜브를 버퍼 병에 연결하고, 마노미터 블러브를 펌핑하여 압력을 테스트하고 게이지를 확인하여 시스템이 제대로 밀봉되었는지 확인합니다. 

2. 관류 수술
 1) 동물이 수술에 적합한 마취 상태에 도달하면, 으깬 얼음으로 채운 얕은 트레이에 동물을 올려놓습니다.
 2) 피부와 복벽을 가로로 절개한 후, 횡격막에 절개를 가하고 횡격막을 가로로 잘라 심장을 노출시킵니다. 늑골을 따라 평행하게 절개를 진행하여 쇄골까지 자릅니다. 이후 흉골 끝을 지혈기로 잡고 지혈기를 머리 쪽으로 이동시킵니다.
 3) 관류 바늘을 좌심실을 통해 상행 대동맥에 삽입한 후, 지혈기를 사용하여 심장을 고정하고 바늘이 움직이지 않도록 합니다. 바늘 끝 주변의 대동맥을 고정하기 위해 수정된 지혈기를 추가로 사용할 수 있습니다. 이후 홍채 가위를 사용하여 좌심실의 후방 끝에 작은 절개를 가합니다.

그림 3. 관류수술 1

 4) 배출 포트를 열고 바늘 베이스에 연결하면서 공기 방울이 들어가지 않도록 주의합니다.
 5) 마노미터 블러브를 80mmHg의 압력으로 신속하고 균일하게 펌핑합니다. 이 압력을 버퍼 주입 동안 유지해야 하며 관류 시간을 측정하기 위한 타이머를 시작합니다.

그림 4. 관류수술 2

 6) 버퍼가 거의 소진되면(200ml) 버퍼 밸브(파란색)를 전환합니다. 이 때, 액체가 맑게  흐르고 있어야 합니다. 간이 맑아지는 것은 관류가 잘 이루어지고 있다는 신호이며 이 시점에서 간이 맑아져야 합니다.

 7) 압력은 최대 130 mmHg까지 점진적으로 증가시켜 안정적인 유속을 유지할 수 있으며 고정액이 소진되면 배출 밸브를 닫고 종료 시간을 기록합니다.

3. 관류 확인
관류의 성공 여부를 초기적으로 판단할 수 있는 지표는 코, 귀, 발과 같은 외부 사지와 흉선 및 간과 같은 내부 장기의 혈액이 제거되는 것입니다. 뇌의 육안 검사를 통해 혈관이 혈액이 없어 흰색에서 연한 노란색으로 변하며 조직 절편에서도 마찬가지로 확인될 수 있습니다. 

* 그림출처: Gage GJ et al. J Vis Exp. 2012;(65):3564.

Ear notching은 빠르고 간편한 개체식별 방법으로 출혈은 거의 일어나지 않습니다. 만약 출혈이 발생하면 지혈될 때까지 거즈로 가볍게 압박해 주어야 합니다.

[주의사항]

1. 시간이 오래 지나면 천공된 표시가 회복되면서 구별이 어려워질 수 있습니다.
2. 개체 간 싸움 등으로 인해 구멍이 찢어지면서 개체식별이 모호해질 수 있습니다.
3. Punching 도구는 금방 무뎌질 수 있고 개체에 상처가 생길 수 있으므로 항상 확인하고 날카로운 도구로 교체해야 합니다.

[절차]

Ear Notching은 생후 14일 이상 개체에서 진행하며 절차는 아래와 같습니다.
① 먼저 Ear punch를 점검 및 소독합니다.
    이물질이 없는지 확인하고 DNA 교차오염을 막기 위해 도구는 사용할 때마다 소독해야 합니다. 
    충분히 날카롭지 않은 도구는 실험동물에게 외상을 유발할 수 있으므로 주의해야 합니다.
② 귓바퀴에 도구를 놓고 꾹 눌러 구멍을 뚫습니다.
    이 때, 비틀거나 잡아당기면 귀가 찢어질 수 있으니 주의해야 합니다.
    원형을 뚫을 때는 귀 가장자리에서 약 2mm 떨어진 곳에 구멍을 뚫어야 합니다. 이렇게 하면 구멍이 찢어지거나 반원으로 잘못 식별되는 것을 방지할 수 있습니다.
③ 만약, 출혈이 발생한다면 거즈로 가볍게 압박지혈합니다.   
④ 동물을 케이지에 돌려놓은 뒤 케이지 카드에 각각의 동물에 대한 정보를 기록합니다.

그림 1. 귀 천공 방법 및 도구(Thumb Type and Scissor Type)

* 그림출처: Wang L. Lab Anim. 2013;47(3):134-145.

그림 2. 귀 천공 번호

* 그림출처: The Jackson Laboratory. Mouse Identification.

[Ear Notching Sample을 이용한 Genotyping]

Ear Notching 할 때 채취한 조직으로 Genotyping이 가능합니다. 단, DNA 교차오염을 방지하기 위해 개체별로 사용할 때마다 반드시 도구를 소독해야 하며 불필요한 통증유발을 방지하기 위해 도구는 항상 날카롭게 관리해야 합니다. 

조직 샘플이 작업대 표면에 떨어져 필터로 빨려 들어가거나 유실될 수 있습니다. 작업은 작업대의 공기 흐름이 방해되지 않도록 테두리가 있는 트레이 위에서 하는 것을 권장합니다. 

조직이 귀나 천공도구에 붙어 있는 경우, 소독된 핀셋을 이용하여 튜브로 옮깁니다. 단, 조직이 아직 귀와 연결되어 있을 경우 핀셋으로 강제로 당기지 않고 같은 부위를 다시 천공하거나 가위를 이용하여 잘라내야 합니다. 

임신 후 14일 미만의 태아는 지각 신경이 충분히 발달하지 않아 모체에서 신속히 제거함으로써 안락사할 수 있지만 임신 15일 이상부터의 태아와 갓 태어난 새끼는 통증을 지각하며 저산소와 높은 이산화탄소의 환경에 강한 내성을 가지고 있습니다. 이러한 성체 랫드와는 다른 생리적 특성으로 인해 태아와 신생 랫드의 안락사는 반드시 훈련된 인력에 의해 신중하게 수행되어야 합니다.

[태아(Fetuses)]

1. 임신 14일 미만의 태아 : 이 시기의 태아는 신경 발달이 미미하며 통증을 인지할 가능성이 없습니다. 어미의 안락사나 어미로부터 태아 제거 시, 태아는 혈액 공급의 중단으로 인해 신속하게 사망하므로 태아를 별도로 안락사 할 필요는 없습니다.
2. 임신 15일 이상부터 출생 전까지의 태아 : 이 시기의 태아는 통증 경로의 발달로 인해 통증 인지 가능성이 있으므로 완전히 성숙한 동물에 적용되는 것과 동일한 윤리적 고려를 적용해야 합니다. 
3. 태아 조직이 필요한 경우: 태아에게 화학적 마취제를 충분히 주입하여 확실한 죽음을 유도하거나, 수술용 가위를 이용한 단두 또는 경추 탈구 같은 물리적 방법이 신속하고 효과적이며 인도적인 안락사 방법으로 허용됩니다. 이 시기의 태아는 저산소증에 저항력이 있으며 CO2를 포함한 흡입 마취제에 장시간 노출이 필요하므로 CO2 노출에 의한 안락사 방법은 추천되지 않습니다. 
4. 액체 질소에 의한 냉동 또는 화학적 고정이 필요한 경우: 태아는 냉동되기 전에 마취를 해야 하며 마취 없이 액체 질소를 사용한 급속 냉동만으로 안락사하는 것은 비인도적입니다. 또한, 태아를 고정액에 침지하거나 고정액을 관류하기 전에 반드시 마취해야 하며, 마취는 다음 중 하나의 방법으로 유도할 수 있습니다.
 1) 화학적 마취제 주사
 2) 태반을 통과하는 화학적 마취제를 사용한 어미의 깊은 마취
 3) 어미로부터 제거한 후 태아의 저체온증 유도
5. 태아가 필요 없는 경우: 태아의 뇌에 산소 공급 부족(뇌 허혈)을 유도하고 자궁 환경에 최소한으로 영향을 주어 태아가 자궁 내에서 깨어나지 않고 사망하게 하는 방법이 권장됩니다. 이를 위해 어미에게 CO2 를 노출한 후 경추 탈구를 시행하는 방법이 권장됩니다.

[신생 랫드(Neonates)]

1. 출생 후 10일 이내 신생 랫드: 성체 랫드에 권장되는 안락사 방법을 신생 랫드에게도 적용할 수 있으나 신생 랫드의 경우 성체와는 다른 생리적 특성으로 인해 안락사 방법을 달리해야 합니다. 신생 랫드에 대한 안락사 방법을 결정할 때는 해당 기관의 전임수의사 또는 전문가의 조언을 받는 것이 좋습니다. 
 

이산화탄소(CO2) 흡입에 의한 안락사 방법은 신생 랫드에게 권장되지 않습니다. 이 시기의 신생 랫드는 성체 랫드보다 CO2 과다 노출에 저항성이 있어 신생 랫드가 사망하는 데 35분 이상 걸릴 수 있으므로, 마취가 완료된 후 2차 물리적 방법(예: 경추 탈구, 수술용 가위를 이용한 단두 등)이 필요합니다. 이러한 2차 물리적 방법은 CO2 노출 또는 마취제 투여 후 통증 반응이 없을 때만 사용해야 합니다.

출생 후 10일 이내 신생 랫드는 마취 목적으로 저체온법이 허용됩니다. 서서히 냉각되는 과정이 마취 상태를 유도하며 동물의 움직임이 멈추면 2차 물리적 방법(예: 경추 탈구, 수술용 가위를 이용한 단두 등)을 보조적으로 수행해야 합니다. 조직 손상과 통증을 유발할 수 있으므로 동물들은 얼음이나 사전 냉각된 표면과 직접적인 접촉을 피해야 합니다. 대신 냉각 표면 위에 라텍스 장갑, 거즈, 또는 천을 올려 놓고 그 위에 동물을 놓습니다. 마취 목적으로의 저체온증은 출생 후 10일 후에는 권장되지 않으며 이후 연령의 동물에게는 부적합한 마취 방법입니다. 액체 질소에 의한 냉동 또는 화학적 고정이 필요한 경우 마취가 선행되어야 합니다.

2. 출생 후 10일 이상 신생 랫드: 성체 랫드와 동일한 안락사 방법을 적용합니다.

[랫드 연령별 권장 안락사 방법]

임신 후 14일 미만의 태아는 지각 신경이 충분히 발달하지 않아 모체에서 신속히 제거함으로써 안락사할 수 있지만, 임신 15일 이상부터의 태아와 갓 태어난 새끼는 통증을 지각하며 저산소와 높은 이산화탄소의 환경에 강한 내성을 가지고 있습니다. 이러한 성체 마우스와는 다른 생리적 특성으로 인해 태아와 신생 마우스의 안락사는 반드시 훈련된 인력에 의해 신중하게 수행되어야 합니다.
 

[태아(Fetuses)]

1. 임신 14일 미만의 태아 : 이 시기의 태아는 신경 발달이 미미하며 통증을 인지할 가능성이 없습니다. 어미의 안락사나 어미로부터 태아 제거 시, 태아는 혈액 공급의 중단으로 인해 신속하게 사망하므로 태아를 별도로 안락사 할 필요는 없습니다.
2. 임신 15일 이상부터 출생 전까지의 태아 : 이 시기의 태아는 통증 경로의 발달로 인해 통증 인지 가능성이 있으므로 완전히 성숙한 동물에 적용되는 것과 동일한 윤리적 고려를 적용해야 합니다. 
3. 태아 조직이 필요한 경우: 태아에게 화학적 마취제를 충분히 주입하여 확실한 죽음을 유도하거나 수술용 가위를 이용한 단두 또는 경추 탈구 같은 물리적 방법이 신속하고 효과적이며 인도적인 안락사 방법으로 허용됩니다. 이 시기의 태아는 저산소증에 저항력이 있으며 CO2를 포함한 흡입 마취제에 장시간 노출이 필요하므로 CO2 노출에 의한 안락사 방법은 추천되지 않습니다. 
4. 액체 질소에 의한 냉동 또는 화학적 고정이 필요한 경우: 태아는 냉동되기 전에 마취를 해야 하며 마취 없이 액체 질소를 사용한 급속 냉동만으로 안락사하는 것은 비인도적입니다. 또한 태아를 고정액에 침지하거나 고정액을 관류하기 전에 반드시 마취해야 하며, 마취는 다음 중 하나의 방법으로 유도할 수 있습니다.
  1) 화학적 마취제 주사
  2) 태반을 통과하는 화학적 마취제를 사용한 어미의 깊은 마취
  3) 어미로부터 제거한 후 태아의 저체온증 유도
5. 태아가 필요 없는 경우: 태아의 뇌에 산소 공급 부족(뇌 허혈)을 유도하고 자궁 환경에 최소한으로 영향을 주어 태아가 자궁 내에서 깨어나지 않고 사망하게 하는 방법이 권장됩니다. 이를 위해 어미에게 CO2 를 노출한 후 경추 탈구를 시행하는 방법이 권장됩니다.
 

[신생 마우스(Neonates)]

1. 출생 후 10일 이내 신생 마우스: 성체 마우스에 권장되는 안락사 방법을 신생 마우스에게도 적용할 수 있으나, 신생 마우스의 경우 성체와는 다른 생리적 특성으로 인해 안락사 방법을 달리해야 합니다. 신생 마우스에 대한 안락사 방법을 결정할 때는 해당 기관의 전임수의사 또는 전문가의 조언을 받는 것이 좋습니다. 

이산화탄소(CO2) 흡입에 의한 안락사 방법은 신생 마우스에게 권장되지 않습니다. 이 시기의 신생 마우스는 성체 마우스보다 CO2 과다 노출에 저항성이 있어 신생 마우스가 사망하는 데 50분 이상 걸릴 수 있으므로 마취가 완료된 후 2차 물리적 방법(예: 경추 탈구, 수술용 가위를 이용한 단두 등)이 필요합니다. 이러한 2차 물리적 방법은 CO2 노출 또는 마취제 투여 후 통증 반응이 없을 때만 사용해야 합니다.

출생 후 10일 이내 신생 마우스는 마취 목적으로 저체온법이 허용됩니다. 서서히 냉각되는 과정이 마취 상태를 유도하며 동물의 움직임이 멈추면 2차 물리적 방법(예: 경추 탈구, 수술용 가위를 이용한 단두 등)을 보조적으로 수행해야 합니다. 조직 손상과 통증을 유발할 수 있으므로 동물들은 얼음이나 사전 냉각된 표면과 직접적인 접촉을 피해야 합니다. 대신 냉각 표면 위에 라텍스 장갑, 거즈, 또는 천을 올려 놓고 그 위에 동물을 놓습니다. 마취 목적으로의 저체온증은 출생 후 10일 후에는 권장되지 않으며, 이후 연령의 동물에게는 부적합한 마취 방법입니다. 액체 질소에 의한 냉동 또는 화학적 고정이 필요한 경우 마취가 선행되어야 합니다.

2. 출생 후 10일 이상 신생 마우스: 성체 마우스와 동일한 안락사 방법을 적용합니다.

[마우스 연령별 권장 안락사 방법]
 

CO2 안락사는 밀폐된 챔버(Chamber)에 동물을 넣고 점진적으로 이산화탄소(CO2) 농도를 증가시켜 동물을 고통 없이 사망에 이르게 하는 절차입니다. CO2 의 농도가 높아지면 동물은 수면 상태에 이르고 이후 저산소증으로 사망하게 됩니다. CO2 안락사는 훈련 받은 인력에 의해 적절한 장비와 기술을 사용하여 환기가 잘 되는 장소에서 수행되어야 합니다.

1. 안락사 챔버(Chamber)
CO2 안락사를 수행하는 챔버는 동물의 상태를 지속적으로 관찰할 수 있도록 투명하거나 적어도 내부를 볼 수 있는 재질로 만들어져야 합니다. 챔버에 너무 많은 동물이 들어가면 혼잡해질 수 있으므로 각 동물이 정상적인 자세를 취할 수 있는 충분한 공간을 제공해야 합니다. 가능하다면 동물들이 원래 사육되던 홈 케이지에서 안락사를 수행하는 것이 좋습니다. 홈 케이지를 사용할 수 없는 경우, 다른 케이지에서 사육되었던 동물들을 혼합하지 말고 챔버를 사용하기 전마다 청소하거나 새로운 챔버를 사용해야 합니다. 

2. 안락사 절차
 1) 압축 CO2 가스 사용: CO2 안락사에는 유량 조절기가 부착된 실린더에서 나오는 압축 CO2 가스를 사용하는 것이 권장됩니다. 드라이아이스, 소화기 또는 화학적 방법 등 다른 모든 CO2 소스는 이 목적에 사용해서는 안 됩니다.
 2) CO2 미리 채우기 금지: 고농도의 CO2는 일부 설치류에게 스트레스를 주거나 고통을 유발할 수 있기 때문에 챔버를 미리 CO2로 채우는 것은 허용되지 않습니다. 
 3) CO2 적정 유입 속도: 동물들의 고통 및 스트레스를 줄이기 위해 CO2 는 챔버 용적의 30-70% 비율로 분당 유입(예: 10ℓ 용량의 챔버라면 CO2 를 분당 3~7ℓ의 속도로 유입) 되어야 하며 이를 정확하게 조절하기 위해 CO2 유량계를 사용해야 합니다. 너무 낮은 유입 속도는 호흡곤란으로 인한 스트레스를 증가시킬 수 있으며, 너무 높은 유입 속도는 점막 통증을 유발할 수 있습니다. 
 4) 의식 소실 확인: CO2 에 노출된 후 2-3분 이내에 동물은 의식을 잃고 호흡이 정지됩니다. 의식 상실이 2-3분 이내에 발생하지 않으면 챔버의 CO2 유입 속도 및 공급 상태를 점검해야 합니다. CO2 노출 후 최소 5분 이상 지속하여야 합니다.
 5) 사망 확인: 동물의 호흡과 심박동 정지, 동공 확장, 눈 색상 변화 등을 확인하여 사망 여부를 확인합니다. 사망이 확인되지 않을 경우, CO2 노출을 계속하고 이후에 경추 탈구(Cervical Dislocation), 단두(Decapitation), 양측 개흉술(Bilateral Thoracotomy), 방혈(Exsanguination) 등의 물리적 추가 방법을 사용하여 확실히 사망에 이르게 합니다.
 6) 사후 처리: 동물의 사망이 완료되면 CO2 유량계를 잠그고 챔버를 열어 동물의 사체를 폐기물 봉투에 담아 의료 폐기물로 폐기합니다. CO2는 공기보다 무겁기 때문에 사용 후 챔버를 뒤집어 비우고 소독제로 청소하여 남아 있는 CO2를 제거해 CO2가 미리 채워지는 상황을 방지해야 합니다. 또한 챔버는 사용 후 반드시 청소 및 소독하여 잔해나 페로몬 등이 새로운 동물들에게 스트레스를 유발하지 않도록 해야합니다.

3. 신생 랫드(Neonate)의 안락사
출생 후 10일 미만 새끼는 CO2로 유발되는 저산소증에 저항력이 있어 무의식 상태에 이르기까지 시간이 오래 걸릴 수 있으며 최대 40분 이상이 소요될 수 있습니다. 따라서 신생 랫드는 충분한 CO2 노출 시간을 제공하여 안락사를 시행하거나 또는 CO2 챔버에 10-15분 동안 넣어 두어 신생 랫드가 통증 자극에 반응하지 않는 무의식 상태에 도달하면 보조적인 방법(예: 경추 탈구 또는 수술용 가위를 이용한 단두)을 추가로 실시하여 안락사를 완료할 수 있습니다. CO2 만으로는 신생 랫드의 사망을 확실히 보장하기 어려우므로, CO2 로 마취를 유도한 후 추가적인 물리적 안락사 방법을 사용하여 사망을 확실히 해야 합니다.

4. 랫드 연령별 CO2 Gas 노출시간 권장사항 

CO2 안락사는 밀폐된 챔버(Chamber)에 동물을 넣고 점진적으로 이산화탄소(CO2) 농도를 증가시켜 동물을 고통 없이 사망에 이르게 하는 절차입니다. CO2의 농도가 높아지면 동물은 수면 상태에 이르고 이후 저산소증으로 사망하게 됩니다. CO2 안락사는 훈련 받은 인력에 의해 적절한 장비와 기술을 사용하여 환기가 잘 되는 장소에서 수행되어야 합니다.

1. 안락사 챔버(Chamber)
CO2 안락사를 수행하는 챔버는 동물의 상태를 지속적으로 관찰할 수 있도록 투명하거나 적어도 내부를 볼 수 있는 재질로 만들어져야 합니다. 챔버에 너무 많은 동물이 들어가면 혼잡해질 수 있으므로, 각 동물이 정상적인 자세를 취할 수 있는 충분한 공간을 제공해야 합니다. 가능하다면 동물들이 원래 사육되던 홈 케이지에서 안락사를 수행하는 것이 좋습니다. 홈 케이지를 사용할 수 없는 경우, 다른 케이지에서 사육되었던 동물들을 혼합하지 말고 챔버를 사용하기 전 마다 청소하거나 새로운 챔버를 사용해야 합니다. 

2. 안락사 절차
 1) 압축 CO2 가스 사용: CO2 안락사에는 유량 조절기가 부착된 실린더에서 나오는 압축 CO2 가스를 사용하는 것이 권장됩니다. 드라이아이스, 소화기 또는 화학적 방법 등 다른 모든 CO2 소스는 이 목적에 사용해서는 안 됩니다.
 2) CO2 미리 채우기 금지: 고농도의 CO2는 일부 설치류에게 스트레스를 주거나 고통을 유발할 수 있기 때문에 챔버를 미리 CO2 로 채우는 것은 허용되지 않습니다. 
 3) CO2 적정 유입 속도: 동물들의 고통 및 스트레스를 줄이기 위해 CO2 는 챔버 용적의 30-70% 비율로 분당 유입 (예: 10ℓ 용량의 챔버라면 CO2 를 분당 3~7ℓ의 속도로 유입) 되어야 하며, 이를 정확하게 조절하기 위해 CO2 유량계를 사용해야 합니다. 너무 낮은 유입 속도는 호흡곤란으로 인한 스트레스를 증가시킬 수 있으며, 너무 높은 유입 속도는 점막 통증을 유발할 수 있습니다. 
 4) 의식 소실 확인: CO2 에 노출된 후 2-3분 이내에 동물은 의식을 잃고 호흡이 정지됩니다. 의식 소실이 2-3분 이내에 발생하지 않으면, 챔버의 CO2 유입 속도 및 공급 상태를 점검해야 합니다. CO2 노출 후 최소 5분 이상 지속하여야 합니다.
 5) 사망 확인: 동물의 호흡과 심박동 정지, 동공 확장, 눈 색상 변화 등을 확인하여 사망 여부를 확인합니다. 사망이 확인되지 않을 경우, CO2 노출을 계속하고 이후에 경추 탈구(Cervical Dislocation), 단두(Decapitation), 양측 개흉술(Bilateral Thoracotomy), 방혈(Exsanguination) 등의 물리적 추가 방법을 사용하여 확실히 사망에 이르게 합니다.
 6) 사후 처리: 동물의 사망이 완료되면 CO2 유량계를 잠그고 챔버를 열어 동물의 사체를 폐기물 봉투에 담아 의료폐기물로 폐기합니다. CO2 는 공기보다 무겁기 때문에 사용 후 챔버를 뒤집어 비우고 소독제로 청소하여 남아 있는 CO2 를 제거해 CO2 가 미리 채워지는 상황을 방지해야 합니다. 또한 챔버는 사용 후 반드시 청소 및 소독하여 잔해나 페로몬 등이 새로운 동물들에게 스트레스를 유발하지 않도록 해야 합니다.

3. 신생 마우스(Neonate)의 안락사
출생 후 10일 미만 새끼는 CO2 로 유발되는 저산소증에 저항력이 있어 무의식 상태에 이르기까지 시간이 오래 걸릴 수 있으며 최대 50분 이상이 소요될 수 있습니다. 따라서 신생 마우스는 충분한 CO2 노출 시간을 제공하여 안락사를 시행하거나 또는 CO2 챔버에 10-15분 동안 넣어 두어 신생 마우스가 통증 자극에 반응하지 않는 무의식 상태에 도달하면 보조적인 방법(예: 경추 탈구 또는 수술용 가위를 이용한 단두)을 추가로 실시하여 안락사를 완료할 수 있습니다. CO2 만으로는 신생 마우스의 사망을 확실히 보장하기 어려우므로 CO2 로 마취를 유도한 후 추가적인 물리적 안락사 방법을 사용하여 사망을 확실히 해야 합니다.

4. 마우스 연령별 CO2 노출 시간 권장 사항 

랫드에서 심장 채혈은 실험종료 단계(Terminal Stage)에서 가능한 채혈법으로 안락사를 실시하기 전 심마취 상태나 안락사 된 상태에서 실시할 수 있습니다. 랫드의 체중에 따라서 10~15ml의 채혈이 가능합니다. 안락사 된 상태보다 마취 상태에서 수행할 경우 혈류에 따라 더 많은 양의 채혈이 가능할 수 있습니다.

심실로 접근하는 것이 좋으며, 왼쪽 흉부/횡격막 등으로 접근하거나 혹은 개흉술을 통해 채혈을 수행할 수 있습니다. 심장채혈을 수행한 뒤 채혈이 완료되면 동물의 심정지 상태를 확인합니다. 필요시 적절한 방법으로 안락사를 수행합니다.

- 재료: 19G~21G needle & 멸균 주사기 (10ml), 마취제, 채혈용기 (튜브) 등

[방법]

1. Dorsal Recumbency (Lateral Aspirate: 측면으로 접근하는 방법) 
  1) 심마취 된 상태의 랫드를 배(복부)가 위쪽을 향하도록 위치시킨 뒤 촉진하여 가장 심박이 강하게 느껴지는 부위를 확인합니다. 일반적으로 팔꿈치 위치 부근에 심장이 위치합니다.
  2) 바늘의 사면이 위로 오도록, 중심선에서 15-20˚ 각도로 삽입합니다. 
  3) 주사기에 혈액이 확인되면 더 이상 바늘을 넣지 않고 천천히 채혈합니다. 

그림 1. Lateral Aspirate

2. Dorsal Recumbency (Ventral Aspirate: 배/횡격막쪽에서 접근하는 방법) 
  1) 심마취 된 상태의 랫드를 배(복부)가 위쪽을 향하도록 눕히거나 혹은 랫드를 수직으로 들어서 보정합니다. 
  2) 흉곽 중앙을 따라 칼돌기(검상돌기: Xiphoid Process)를 확인합니다.
  3) 칼돌기 밑에서 바늘을 삽입하는데 바늘의 사면이 위로 오도록, 30˚ 각도로 혹은 가장 심박이 강하게 뛰는 쪽으로 삽입합니다. 
  4) 주사기에 혈액이 확인되면 더 이상 바늘을 넣지 않고 천천히 채혈합니다.

그림 2. Ventral Aspirate

3. Lateral Recumbency 
  1) 심마취 된 상태의 랫드를 오른쪽이 테이블을 향하도록 눕힙니다. 
  2) 촉진하여 가장 심박이 강하게 느껴지는 부위를 확인합니다. 일반적으로 팔꿈치 위치 부근에 심장이 위치합니다.
  3) 가장 심박이 강한 위치로 주사기를 삽입하며 주사기에 혈액이 확인되면 더 이상 바늘을 넣지 않고 천천히 채혈합니다.

그림 3. Lateral Recumbency 

마우스에서 심장 채혈은 실험종료 단계(Terminal Stage)에서 가능한 채혈법으로 안락사를 실시하기 전 심마취 상태나 안락사 된 상태에서 실시할 수 있습니다. 마우스의 체중에 따라서 0.7~1.0ml의 채혈이 가능합니다. 안락사 된 상태보다 마취 상태에서 수행할 경우 혈류에 따라 더 많은 양의 채혈이 가능할 수 있습니다.

심실로 접근하는 것이 좋으며, 왼쪽 흉부/횡격막 등으로 접근하거나 혹은 개흉술을 통해 채혈을 수행할 수 있습니다. 심장채혈을 수행한 뒤 채혈이 완료되면 동물의 심정지 상태를 확인합니다. 필요시 적절한 방법으로 안락사를 수행합니다.

- 재료: 23G-25G needle & 멸균 주사기(1ml 또는 2ml), 마취제, 채혈용기 (튜브) 등 

[방법]

1. Dorsal Recumbency (Lateral Aspirate: 측면으로 접근하는 방법) 
  1) 심마취 된 상태의 마우스를 배(복부)가 위쪽을 향하도록 위치시킨 뒤 촉진하여 가장 심박이 강하게 느껴지는 부위를 확인합니다. 일반적으로 팔꿈치 위치 부근에 심장이 위치합니다.
  2) 바늘의 사면이 위로 오도록 중심선에서 15-20˚ 각도로 삽입합니다. 
  3) 주사기에 혈액이 확인되면 더 이상 바늘을 넣지 않고 천천히 채혈합니다. 

그림 1. Lateral Aspirate

2. Dorsal Recumbency (Ventral Aspirate: 배/횡격막쪽에서 접근하는 방법) 
  1) 심마취 된 상태의 마우스를 배(복부)가 위쪽을 향하도록 눕히거나 혹은 마우스를 수직으로 들어서 보정합니다. 
  2) 흉곽 중앙을 따라 칼돌기(검상돌기: Xyphoid Process)를 확인합니다.
  3) 칼돌기 밑에서 바늘을 삽입하는데 바늘의 사면이 위로 오도록, 30˚ 각도로 혹은 가장 심박이 강하게 뛰는 쪽으로 삽입합니다. 
  4) 주사기에 혈액이 확인되면 더 이상 바늘을 넣지 않고 천천히 채혈합니다.

그림 2. Ventral Aspirate

3. Lateral Recumbency 
  1) 심마취 된 상태의 마우스를 오른쪽이 테이블을 향하도록 눕힙니다. 
  2) 촉진하여 가장 심박이 강하게 느껴지는 부위를 확인합니다. 일반적으로 팔꿈치 위치 부근에 심장이 위치합니다.
  3) 가장 심박이 강한 위치로 주사기를 삽입하며, 주사기에 혈액이 확인되면 더 이상 바늘을 넣지 않고 천천히 채혈합니다.

랫드에서 복대동맥 또는 복대정맥 채혈은 실험종료 단계(Terminal Stage)에서 가능한 채혈법으로 안락사를 실시하기 전 마취 상태나 안락사 된 상태에서 실시할 수 있습니다. 체중에 따라서 간문맥에서 5~10ml까지 채혈할 수 있으며, 다른 복강 내 혈관에서는 10~15ml를 채혈할 수 있습니다. 
 

- 재료: 19G-21G needle & 멸균 주사기 (10ml), 마취제 (필요시), 수술용 블레이드, 수술용 가위, 수술용 포셋, 채혈용기 (튜브), 거즈 등 

[방법]

1. 마취된 상태의 랫드를 배(복부)가 위쪽을 향하도록 고정한 뒤, 전체적으로 70% 에탄올을 뿌려 털이 복강 안으로 들어가지 않도록 합니다. (발가락이나 꼬리를 핀셋 등으로 눌러 심마취 상태임을 확인한 후 다음 단계를 수행합니다.)  
2. 복부의 피부를 Y 또는 V 모양으로 절개한 뒤 복막도 동일하게 혹은 정중앙을 절개합니다. 
3. 복강장기(장, 지방 등)를 부드럽게 옆으로 옮겨서 제거하고 간을 앞쪽으로 밀면 양쪽 신장 사이에서 척추를 따라 나란히 주행하는 복대동맥(선홍색, 심장의 박동에 맞춰 혈관의 움직임이 관찰됨) 또는 복대 정맥(짙은 적색)을 식별할 수 있습니다. 장을 터뜨리거나 다른 출혈이 발생하지 않도록 주의합니다.
4. 19G-21G의 바늘을 가능한 혈관과 평행하게 삽입하여 혈액을 채취합니다. 동맥은 주사바늘 사면이 아래로, 정맥은 주사바늘 사면이 위를 향하게 삽입합니다.
5. 채혈이 완료되면 동물의 심정지 상태를 확인합니다. (필요시 적절한 방법으로 안락사를 수행합니다.)

* 그림출처: 박여름. 차의과학대학교 실험동물센터 2020년 동물실험 실습 교육. 2020.

마우스에서 복대동맥 또는 복대정맥 채혈은 실험종료 단계(Terminal Stage)에서 가능한 채혈법으로 안락사를 실시하기 전, 심마취 상태나 안락사 된 상태에서 실시할 수 있습니다. 마우스의 체중에 따라서 0.4~1.0ml의 채혈이 가능합니다. (안락사 된 상태보다 마취 상태에서 수행할 경우, 혈류로 인해 더 많은 양의 채혈이 가능할 수 있습니다.)

- 재료: 21G-25G needle & 멸균 주사기(1ml), 마취제 (필요시), 수술용 블레이드, 수술용 가위, 수술용 포셋, 채혈 용기 (튜브), 거즈 등 

[방법]

1. 심마취된 상태의 마우스를 배(복부)가 위쪽을 향하도록 고정한 뒤, 전체적으로 70% 에탄올을 뿌려 털이 복강 안으로 들어가지 않도록 합니다. 발가락이나 꼬리를 핀셋 등으로 눌러 심마취 상태임을 확인한 후 다음 단계를 수행합니다.
2. 복부의 피부를 Y 또는 V 모양으로 절개한 뒤 복막도 동일하게 혹은 정중앙을 절개합니다. 
3. 복강장기(장, 지방 등)를 부드럽게 옆으로 옮기고 간을 앞쪽으로 밀면 양쪽 신장 사이에서 척추를 따라 나란히 주행하는 복대동맥(선홍색, 심장의 박동에 맞춰 혈관의 움직임이 관찰됨) 또는 복대정맥(짙은 적색)을 식별할 수 있습니다. 장을 터뜨리거나 다른 출혈이 발생하지 않도록 주의합니다.
4. 21~25G의 바늘을 가능한 혈관과 평행하게 삽입하여 혈액을 채취합니다. 천천히 syringe를 뒤로 당겨 채혈하며 만약 혈관이 collapse 되면 잠시 멈추고 기다린 뒤 다시 혈액이 차면 syringe를 당겨 채혈합니다. 동맥은 주사바늘 사면이 아래로, 정맥은 주사바늘 사면이 위를 향하게 삽입하며 너무 빠르게 syringe를 당기게 되면 용혈이 일어날 수 있으니 주의합니다.
5. 채혈이 완료되면 동물의 심정지 상태를 확인합니다. (필요시 적절한 방법으로 안락사를 수행합니다.)

그림 1. Retro orbital blood withdrawal in mice.

* 그림출처: JoVE. Lab Animal Research: Blood WithdrawalⅠ