유전학 연구에서 특정 유전자의 기능을 정확히 규명하려면, 그 유전자가 다른 불필요한 변이와 섞이지 않도록 균질한 유전적 배경 위에 보존하는 것이 중요합니다. 이를 위해 널리 사용되는 기법이 Backcrossing이며 초파리 연구에서는 특히 Cantonizing이라는 형태로 활용됩니다.

초파리 연구에서 가장 널리 사용되는 표준 계통은 Canton-S입니다. 특정 유전자 변이를 가진 초파리를 이 Canton-S 계통과 반복적으로 교배하여 해당 변이를 Canton-S 배경으로 동질화하는 과정을 Cantonizing이라 합니다. 이 과정을 통해 형질 전환 초파리 생성 과정에서 발생할 수 있는 유전적 이질성 (heterogeneity)을 최소화하고 관심 있는 유전자를 제외한 불필요한 돌연변이나 변이들을 제거할 수 있습니다. Backcrossing을 통해 동일한 조건에서 실험을 수행하고 실험 재현성을 높일 수 있으며 표준 strain과의 직접적인 비교도 가능해집니다.

결국 Backcrossing은 특정 형질이나 유전자를 가진 개체(F1)를 원래의 부모형 또는 표준 strain (Canton-S)과 반복적으로 교배하여 목표 유전자만 유지하면서 나머지 유전자를 표준 배경으로 회귀시키는 과정입니다. 이러한 Backcrossing 및 Cantonizing은 불필요한 변이 제거, 유전적 배경 표준화, 연구 신뢰성 확보라는 세 가지 핵심 목적을 달성하는 데 필수적인 유전학적 기법이라 할 수 있습니다.

그림 1. D. ananassae의 특정 유전자를 D. pallidosa 유전적 배경으로 도입하기 위한 Backcrossing 과정.

각 단계는 D. ananassae에서 유래한 Dl 및 Om(2D) 유전자가 포함된 염색체를 D. pallidosa로 점차 도입하고 반복적 역교배를 통해 D. pallidosa의 유전적 배경으로 회귀시키는 과정을 나타냅니다. 첫 번째 교배에서 F1 잡종을 얻고 이 잡종 암컷을 D. pallidosa 수컷과 교배하여 Backcross line를 형성합니다. 이후 동일한 과정을 5~10세대 반복하여, D. pallidosa 배경 속에 Dl 유전자만 유지된 개체([Dl] 암컷)을 획득합니다. 이를 통해 불필요한 D. ananassae 유전자는 점차 제거되고, 표준화된 유전적 배경 위에 관심 유전자만 보존할 수 있습니다.

동물은 환경으로부터 다양한 감각 정보를 동시에 받아들이고, 그중 어떤 자극에 반응할지 결정하며 살아갑니다. 이러한 감각 자극의 신경 정보 처리 과정은 생존과 직결되는 중요한 의사결정 기전으로 먹이 선택, 포식자 회피, 짝짓기와 같은 행동의 기반이 됩니다. 예를 들어, 에너지원인 단맛과 해로운 신호인 쓴맛이 동시에 주어질 때 어떤 감각이 행동을 주도하게 되는지는 감각 처리와 신경 회로 간 상호작용을 이해하는 데 핵심적인 질문입니다. 초파리는 이런 감각 선택 과정의 분자적·신경학적 기전을 연구하기 위한 강력한 모델 생물입니다.

최근 연구에서는 단맛과 쓴맛 자극이 동시에 주어졌을 때 초파리가 단맛에 의해 쓴맛을 억제하는 ‘단맛 우세 현상(sweet-dominance)’을 보이며 이 현상이 ephaptic coupling (시냅스를 통하지 않는 신경세포 간 전기적 소통)이라는 비전형적인 기전을 통해 매개된다는 사실이 밝혀졌습니다 (그림 1). 이는 감각 간 우선순위 결정이 단순한 수용체 반응을 넘어서, 신경세포 간의 상호작용 수준에서 조절될 수 있음을 시사합니다.

그림 1. 초파리 미각 세포 (gustatory receptor neuron, GRN) 간 상호작용 개요.

단맛 세포와 쓴맛 세포는 ephaptic inhibition을 통해 서로 억제하지만, 단맛 세포에는 HCN 채널 (Ih 유전자 산물)이 발현되어 쓴맛 신호를 상쇄하며 ‘단맛 우세(sweet dominance)’ 현상을 유도한다. 이를 규명하기 위해 Ih 기능 상실 돌연변이가 활용되었으며, 대표적인 돌연변이인 Ihf03355는 piggyBac 전이인자(PBac{WH}) 삽입으로, Ih-TG4.0은 Minos 기반 Trojan-GAL4 cassette 삽입으로 제작된 기능 상실 형질전환체입니다. 정상 Ih 유전자는 신경세포의 휴지막 전위를 안정화하고 감각 신호의 균형을 유지하지만 Ih 돌연변이체에서는 단맛과 쓴맛이 섞인 먹이에 노출 시 감각 변조 능력이 손상되어 쓴맛 회피 행동이 저하되는 특징이 보고되었습니다. 따라서 Ih 형질전환체는 미각 세포 상호작용과 섭식 행동 조절의 분자적 기전을 연구하는 데 중요한 도구로 활용됩니다.

초파리의 유전자 돌연변이를 연구할 때 밸런서 염색체는 핵심 도구입니다. 밸런서는 염색체 내에서 다중 역위(inversion)를 포함하고 있어 상동염색체 간 교차(recombination)를 억제하며 가시적 표지(marker mutation)를 포함해 특정 유전자형을 쉽게 구별할 수 있도록 설계되어 있습니다. 전통적으로는 성체 초파리의 Curly (날개가 곱슬하게 말림), Stubble (짧고 뭉툭한 체모), Lobe (눈 크기 감소)와 같은 표지를 통해 유전자형을 판별했지만 이러한 형질은 성체 단계에서만 확인 가능하다는 한계가 있었습니다.

반면 애벌레 단계에서 직접 식별 가능한 밸런서는 매우 제한적입니다. 일부 형광 표지 밸런서(예: CyO-GFP, TM3-GFP)는 애벌레에서 형광현미경을 통해 구별할 수 있으나, 형광 신호가 약하거나 특정 조직에만 발현되어 정확한 선별이 어렵고 고가의 장비 의존성이 큽니다. 또한 기존의 Tubby¹ (Tb¹) 돌연변이는 3번 염색체에만 존재하여 X나 2번 염색체 밸런서와는 결합할 수 없는 제약이 있었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 2011년 Lattao 연구진은 Tubby¹ 유전자를 FM7a(X 염색체 밸런서)와 CyO(2번 염색체 밸런서)에 삽입해 각각 FM7-TbA, CyO-TbA를 개발했습니다(그림 1). 이 밸런서는 Tubby 형질(애벌레가 짧고 뚱뚱한 체형을 보임)이 발달 단계에서 뚜렷하게 나타나므로 형광 장비 없이도 육안으로 이형접합을 선별할 수 있으며, lethal 돌연변이 연구와 발생 단계 분석에 매우 유용합니다.

그림 1. Tubby¹ (Tb¹) 변이가 포함된 다양한 밸런서 염색체를 가진 번데기의 비교.

각각의 번데기 표본은 다른 Tb 변이 또는 밸런서 염색체를 가진 개체들입니다. OR-R은 변이가 없는 정상 초파리이며 TM6B와 TwdlA은 기존의 밸런서입니다.

FM7-TbA와 CyO-TbA는 Tb¹ 유전자가 삽입된 X염색체와 2번 염색체 밸런서를 나타내며, 이들은 “짧고 뚱뚱한” 특징적인 체형이 애벌레 및 번데기 단계에서 육안으로 구별 가능합니다.

생물은 생존과 종족 번식을 위해 외부 환경에 적절히 반응하며 특히 위험한 독성물질을 피하고 에너지원을 효율적으로 섭취하는 능력은 생존에 핵심적인 역할을 합니다. 자연에는 섭취 시 독성을 유발할 수 있는 물질이 다수 존재하며 이에 따라 동물들은 먹이의 성분을 정교하게 평가하고 선별하는 감각 체계와 행동 전략을 발달시켜 왔습니다.

초파리는 이러한 감각적 의사결정을 연구하는 데 이상적인 모델 생물로 특히 섭식 행동에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있습니다. 다양한 실험 기법 중 Capillary Feeder (CAFÉ) assay는 초파리의 실제 먹이 섭취량을 정량적으로 측정할 수 있는 대표적인 방법으로 유전적 변이나 환경적 요인이 섭식에 미치는 영향을 평가하는 데 널리 사용되어 왔습니다 (그림 1 왼쪽).

특히 hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) 채널을 암호화하는 Ih 유전자가 결손된 Ih-deficient mutant는 대표적인 형질전환체 모델 중 하나로, Ihf03355 돌연변이는 Pbac{WH}f03355라는 piggyBac 전이인자의 삽입으로 Ih-TG4.0은 Mi{Trojan-GAL4.0}Ih[MI04168-TG4.0]라는 Minos 기반 Trojan-GAL4 cassette 삽입으로 제작되었습니다. 정상적인 Ih는 신경세포의 휴지막 전위를 조절하고 감각 뉴런의 흥분성을 안정화하는 기능을 담당하지만 이러한 돌연변이체에서는 단맛 식이 노출 시 감각 신호 변조 능력이 손상되고 쓴맛 회피 행동이 저하되는 등 섭식 조절 이상이 보고되어 있습니다 (그림 1 오른쪽).

이와 함께 별도의 염색체에 Ih 유전자를 삽입한 형질전환체 제작하여 Ih 돌연변이체와 교배함으로써 Ih 기능 상실로 인한 섭식 행동 이상이 회복되었으며 이를 통해 관찰된 표현형이 Ih 유전자 결손에 의해 직접적으로 발생함을 입증하였습니다.

그림 1. CAFÉ assay를 이용한 단맛 우세 현상 분석.

초파리에게 쓴맛 물질 (caffeine)만 포함된 용액과 caffeine에 설탕 (sucrose)이 혼합된 용액을 동시에 제공하여 선호 행동을 CAFÉ assay를 통해 평가하였습니다. 그 결과, 야생형 (WT) 초파리는 쓴맛 속에 있는 단맛을 인식하고 해당 용액을 선호하는 수치를 보여주는 선호 지수 (preference index)가 높지만 Ih 기능상실 돌연변이의 경우 선호지수가 유의하게 감소하였습니다. 이러한 섭식 이상 행동은 다른 염색체에 Ih 유전자를 삽입함으로써({Ih}) 회복되었음을 보여줍니다.

 초파리는 단순한 생물이지만 유전자 연구에서 놀랍도록 강력한 모델 생물로 알려져 있습니다. 그렇다면 이 작은 곤충의 유전자는 과연 인간과 얼마나 닮았을까요? 놀랍게도 초파리와 인간의 유전적 유사성은 매우 높습니다. 초파리의 전체 유전자 중 약 60%는 인간과 유사한 서열 또는 기능을 가지며 특히 암 관련 유전자에서는 매우 높은 유사성을 보입니다. 유전적 유사성 뿐만 아니라 해부학적 구조도 비슷한데 신경계, 심장, 식도, 장, 생식선, 지방 등과 같이 인간이 가지고 있는 조직 및 기관과 구조적 및 기능적 유사한 면을 가져 치료제 발굴에 적극적으로 사용되는 모델 생물이기도 합니다  (그림 1A).

 대표적인 초파리 기반 암 연구 모델 중 하나는 인간 RET 유전자를 발현한 형질전환체입니다. RET는 세포 증식과 분화에 관여하는 수용체 타이로신 키나아제로 활성화 돌연변이(예: MEN2A, MEN2B, RET/PTC 재배열)는 다양한 종양을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 이를 모사하기 위해 연구자들은 Gal4/UAS 시스템을 이용하여 초파리의 눈 조직에서 돌연변이형 RET (dRet)을 발현시켰으며 그 결과 극심한 안구 과증식과 조직 이상이 나타났습니다 (그림 2). 이러한 형질전환체는 인간 암 유전자의 발암 기전을 생체 수준에서 재현했으며 약물 저해제 (ZD6474)의 효능을 신속하게 평가하였습니다. 실제로 RET 저해제인 ZD6474 처리 시 돌연변이 RET로 인한 안구의 비정상적 발달이 현저히 억제되는 것이 관찰되어 초파리 모델이 암 유전자 기능 연구와 약물 스크리닝 모두에 유용함을 보여주었습니다.

그림1. 초파리와 인간 장기의 구조 및 기능적 유사성. 초파리는 뇌, 지방체, 장기 등 주요 기관이 인간과 기능적으로 유사하여 암과 대사질환 연구에 적합한 모델 생물체임. 이러한 유사성은 인간 질환을 모사하는 다양한 파리 모델 구축을 가능하게 합니다.

그림 2. 초파리 형질전환체를 이용한 RET 변이 암 모델

NTR/MTZ cell ablation 시스템은 세포 특이적 손상을 위해 제작된 형질전환 시스템으로, 1991년 Bryant and Deluca에 의해서 엔테로박터 클로카에(Enterobacter cloacae)라는 막대 모양의 그람음성간균의 NTR(nitroreductase)을 발견하면서 NTR이 다른 동물에는 발현하지 않고 박테리아 계통에 발현되는 점을 발견하였다. 이러한 점을 활용하여 Nitroreductase(NTR)는 전구약물인 메트로니다졸(metronidazole, MTZ)을 환원시켜 독성 물질을 생성하는 효소로, 특정 세포를 사멸시키는 데 사용됩니다1.

NTR/MTZ cell ablation 시스템의 장점은 특정한 세포를 유전적인 모델을 활용하여 세포 특이적인 손상을 유도할 수 있고, 이를 바탕으로 특정세포가 손상되었을 때 재생이 어떻게 일어나는 지를 연구할 수 있는 장점이 있습니다.

최근 간에 존재하는 간세포 특이적으로 NTR을 발현시키는 형질전환개체를 제작하여 간세포 특이적인 손상을 유도하고 간이 어떠한 세포의 기원으로 재생이 되는가를 연구를 진행하였고 간 세포의 심각한 손상이 유도되면 간세포 유래의 간 재생이 이루어지는 것이 아니고 주변에 존재하는 담낭세포 기원의 간 재생이 이루어지는 점을 발견하였다2,3. 이외에도 현재는 NTR/MTZ cell ablation 시스템을 활용하여 다양한 세포들 특이적인 손상을 유도하고 재생이 어떻게 이루어지는가에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다4.

QF/QUAS 시스템은 조건적 유전자발현을 위해 제작된 형질전환 시스템으로, 붉은 곰팡이 Neurospora crassa 의 quinic acid를 감지하는 유전자발현조절시스템에서 기원하였습니다. 조직 또는 세포특이적인 프로모터에 의해 조절되는 전사활성화 인자인 QF를 보유한 형질전환체와 QUAS에 의해 발현되는 타겟유전자 (gene of interest)를 가진 형질전환체의 교배를 통해 QF가 QUAS에 결합함으로써 최종적으로 원하는 유전자의 시공간적 특이적 발현을 조절할 수 있습니다1.

 최근 기존의 QF/QUAS를 개량한 QF3/QUAS (또는 IQ-switch, EQ-on) 시스템은 기존 QF/QUAS의 독성을 유의미하게 감소시켰으며, QUAS의 반복횟수에 따라 타겟유전자 발현정도를 결정할 수 있습니다3. 또한 유사한 용도로 기존에 널리 사용되어온 Gal4/UAS 시스템의 제브라피쉬 모델에서의 최대 약점인 유전자 침묵 (gene silencing)이 발생하지 않는 것으로 보고되었습니다2,3.

QF3/QUAS 시스템은 제브라피쉬 모델에서 시공간적 (spatio-temporal) 유전자 발현을 위해 매우 효과적으로 활용될 수 있으며, 더 나아가 CRISPR 유전자가위 기술과 같은 기존의 유전자조절기술과 결합하여 유전자 발현제어를 위한 다재다능한 연구기법으로 확장될 수 있는 높은 가능성을 보여줍니다3.