1. 뇌내 투여를 위한 도구를 멸균하여 준비하고 투여부위인 두개부를 제모합니다. 
2. 통증 경감을 위해 마취를 실시하고 충분히 마취가 되었다고 판단되면 stereotaxic apparatus에 두부를 고정시킵니다. 마취 후에는 가능하면 열판을 제공하여 체온을 유지할 수 있도록 합니다.
3. 투여부위 소독을 실시합니다.
4. 두개부의 표피를 세로로 절개하여 두개골을 노출시킨 후, 멸균 면봉을 이용하여 골막을 제거합니다.
5. 해부학적 지표(예: 브레그마)를 기준으로 하여 stereotaxic 장비를 약물을 주입하고자 하는 부위에 맞게 manipulator X, Y를 조정합니다. 그 후 주입 부위에 골절기를 사용하여 두개골을 직접 천공하고 매우 얇은 골층만 남았을 때 또는 두개골 전체를 관통했을 때 천공을 멈춥니다. (드릴이 경막을 뚫지 않도록 주의)
6. 멸균된 바늘(27G)을 두개골 표면에 평행하게 눕혀 경막을 절개한 후 바늘 끝 부분을 위치시킵니다. Manipulator Z를 조정하여 경막을 통해 뇌 조직 내 원하는 깊이까지 천천히 내려 투여 준비를 마칩니다. 
7. Injector(50-100 nL/min)를 사용하여 일정한 속도로 약물을 투여합니다. 투여 완료 후 투여량이 50 nL를 초과한 경우, 역류의 위험을 줄이기 위해 바늘을 최대 5분 동안 유지합니다.
8. 바늘을 제거하고 멸균된 면봉을 이용하여 출혈을 닦아낸 후 피부를 봉합하거나 클립 또는 조직 접착제를 이용하여 절개 부위를 봉합 합니다. 봉합 부위를 소독하고 동물이 회복할 때까지 관찰합니다.

그림 1. 뇌내 투여시 필요한 도구

그림 2. Stereotaxic 수술 개요도

* 그림출처: Park JH et al. STAR Protoc. 2022;3(3):101607.

그림 3. Stereotaxic 장치의 실제 장착 모습

* 그림출처: Mathon B et al. Neurosci Bull. 2015;31(6):685-696.

1. 마취된 랫드의 등이 바닥을 향하도록 양와위 자세로 눕힙니다. 랫드 당 하나의 다리만 사용할 수 있습니다. 
2. 슬개골 부위를 면도한 뒤 면도 부위를 4% 클로르헥시딘 용액 또는 베타딘으로 1차 소독하여 유분과 단백질을 제거합니다.  
3. 면도 부위를 2% 클로르헥시딘과 70% 알코올 또는 10% 포비돈요오딘과 70% 알코올을 이용하여 번걸아가며 2번 연속으로 닦아냅니다. 
4. 멸균된 2'x 2' 거즈 중앙에 구멍을 뚫고 소독한 무릎 위에 얹습니다. 
5. 포셉을 이용하여 피부를 잡고 피부에 2mm의 작은 수평 절개창을 만듭니다. 
6. 경골에 부드러운 압력을 가하여 무릎을 구부립니다. 
7. 슬개건의 중간 지점을 통해 대퇴골 골수강에 22G 바늘을 삽입하여 최대 200μL 를 투여합니다. 주입 속도가 빠르거나 주입량이 많으면 누출이 발생하거나 근육이나 피부층의 붓기가 관찰될 수 있습니다. 이 때는 실패한 것으로 간주합니다. 
8. 절개 부위의 혈액을 거즈나 면봉으로 부드럽게 닦아내고 절개부위에 조직 접착제를 바릅니다. 
9. 마취에서 회복하여 보행이 가능해지면 사육 케이지로 돌려보냅니다. 
 

* 랫드는 투여 후 6시간 동안 모니터링 해야하고 최소 2일동안은 매일 동물상태를 모니터링해야 합니다. 투여받은 동물이 불규칙한 걸음걸이 등 보행장애가 있다면 수의사와 상의해야 합니다. 
 

1. 마취된 마우스의 등이 바닥을 향하도록 양와위 자세로 눕힙니다. 마우스 당 하나의 다리만 사용할 수 있습니다. 
2. 슬개골 부위를 면도한 뒤 면도 부위를 4% 클로르헥시딘 용액 또는 베타딘으로 1차 소독하여 유분과 단백질을 제거합니다.  
3. 면도 부위를 2% 클로르헥시딘과 70% 알코올 또는 10% 포비돈 요오딘과 70% 알코올을 이용하여 번갈아가며 2번 연속으로 닦아냅니다. 
4. 멸균된 2'x 2' 거즈 중앙에 구멍을 뚫고 소독한 무릎 위에 얹습니다. 포셉을 이용하여 피부를 잡고 피부에 1~2mm의 작은 수평 절개창을 만듭니다. 
5. 경골에 부드러운 압력을 가하여 무릎을 구부립니다. 무릎의 구부러짐은 그림 1과 같이 한쪽 손의 엄지와 검지를 이용하여 대퇴골을 바닥면과 90° 수직을 이루도록 배치한 뒤 반대쪽 손의 손가락으로 경골을 구부리거나, 그림 2 또는 3과 같이 대퇴골과 경골이 90° 를 이루도록 하여 유도할 수 있습니다. 
6. 25G 바늘을 사용하여 슬개건의 중간 지점을 통해 대퇴골 골수강에 삽입합니다. 약간의 압력을 가하면서 바늘을 약간 회전하듯이 비틀어 움직이면 물질을 주입할 수 있는 충분한 공간이 확보됩니다. 바늘 각도는 대퇴골 방향과 일치해야 합니다. 각도가 바르지 않으면 바늘이 뼈를 뚫고 근육으로 들어가거나 뼈가 깨질 수 있습니다.
7. 바늘을 회전시키면서 대퇴골의 2/3지점까지 삽입했다가 바늘을 다시 천천히 빼냅니다. 이 때 다리가 움직이지 않도록 주의합니다. 
8. 주입하려는 물질이 들어 있는 주사기와 30G 바늘을 이용하여, 25G 바늘을 빼낸 자리로 물질을 천천히 주입합니다. 최대 투여량은 30μL 입니다. 25G의 바늘을 삽입한 상태에서 해밀턴 주사기를 사용하여 물질을 주입할 수도 있습니다. 
9. 주입 속도가 빠르거나 주입량이 많으면 그림 4와 같이 누출이 발생하거나, 근육이나 피부층의 붓기가 관찰 될 수 있습니다. 이때는 실패한 것으로 간주합니다. 
10. 절개 부위의 혈액을 거즈나 면봉으로 부드럽게 닦아내고 절개부위에 조직 접착제를 바릅니다. 
11. 마취에서 회복하여 보행이 가능해지면 사육 케이지로 돌려보냅니다. 
12. 마우스는 회복 후 6시간 동안 모니터링해야 하고 최소 2일동안은 매일 동물상태를 모니터링해야 합니다. 
13. 동물이 불규칙한 걸음걸이 등 보행 장애가 있다면 수의사와 상의해야 합니다. 

* 그림출처

 - 그림 1: University Animal Care Committee Standard Operating Procedure SOP 7.26 - Intrafemoral Injections in Mice. 2019.

 - 그림 2-4: Animal Ethics Committee – Standard Operating Procedure: LAB_040 Injections – Intra-femoral in Mice. 2022.

[Retro-orbital Injection의 유용성]
Adult 및 neonatal rat에서 어려운 미정맥 주사 대신 쉽고 빠르게 재현 가능한 투여 방법입니다. 단, neonatal rat에서 생후 2일 이상 되었을 때는 피부가 어두워지고 정맥이 보이지 않게 되어 투여가 어렵습니다. 

[Adult 랫드에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 27G(Gauge)정도의 작은 바늘로 최대 0.15 ml 투여 가능합니다.
2. 호흡마취 하고 횡와위자세로 눕힌 후 점안마취제인 proparacaine을 점안하고 최소 30초 동안 둡니다 (그림 1). 
3. 안구가 조금 튀어나오도록 보정합니다.
4. 눈 표면을 손상시키지 않도록 아래로 비스듬히 바늘을 내안각 (medial canthus)쪽으로 45° 각도로 삽입합니다. 이 때 안구와 안와 뼈 사이로 삽입합니다 (그림 2). 
5. 바늘 끝이 눈 밑부분에 올 때까지 안구 가장자리를 따라 바늘을 접근합니다.
6. 흡인 없이 부드럽게 주사하고 바늘을 천천히 뺍니다.

그림 1. Adult Rat에서 점안 마취 예시 사진

* 그림출처: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

그림 2. Adult Rat에서 Retro-orbital Injection 예시 사진

* 그림출처: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

[Neonatal Rat에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 29-31G 바늘로 g당 최대 5μL를 투여 가능합니다.
2. 오른손잡이의 경우, 평평한 표면에 좌측 횡와위자세로 눕히고 호흡마취 합니다 (단, 호흡마취 장비가 눈꺼풀과 눈물관 부위를 가려서는 안됨).
3. Paw withdrawal reflex를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 
4. 머리 아래에 광원을 사용하여 정맥동을 쉽게 볼 수 있도록 하고 바늘을 eye socket(내안각: Medial Canthus와 동일)에 바늘사면을 아래로 향하게 하여 40°의 각도로 삽입합니다 (그림 3). 
5. 바늘의 1/3을 eye orbit 뒤쪽에 위치한 retro-orbital sinus 부위로 2mm정도 밀어 넣습니다.
6. 흡인 없이 부드럽게 주사하고 역류를 방지하게 위해 잠시 기다렸다가 바늘을 천천히 뺍니다.
7. 투명한 용액을 주사 하였을 때는 정맥이 잠시 투명해져야 합니다. 만약 주사 후 눈이 부어 오르면 바늘이 정맥에 삽입되지 않았음을 의미합니다. Neonatal 두개골은 매우 부드러워서 바늘이 두개골을 뚫으면 용액이 수막이나 뇌실질에 들어갈 수 있습니다.
8. 랫드를 보온 장치에 올려놓아 체온을 유지하면서 회복시킵니다.
9. 어미에게 새끼를 돌려보내기전에 통증 반응이 있는지 확인합니다. 
10. 오염을 피하기 위하여 각 동물마다 새로운 멸균 주사기를 사용합니다.

그림 3. Neonatal Rat에서 Retro-orbital Injection 예시 사진

* 그림출처: Rocha-Ferreira E et al. J Vis Exp. 2024;(204):10.3791/65386.

[Retro-orbital Injection의 유용성]
Adult 및 neonatal mouse에서 어려운 미정맥 주사 대신 쉽고 빠르게 재현 가능한 투여 방법입니다. 또한 미정맥 주사보다 스트레스가 덜 할 수 있습니다.

[Adult Mouse에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 27.5G(Gauge) 이하, 0.5cm 바늘 길이의 인슐린 주사기 또는 27G이하, 0.5cm 바늘 길이의 Tuberculin 주사기를 준비합니다.
2. 오른손잡이로 예를 들면 마우스를 마취 후 좌측 측와위로 눕히고 눈의 등쪽과 배쪽 피부에 가벼운 압력을 가하여 마우스의 안구를 돌출 시킵니다. 이 때 호흡에 방해되도록 강하게 압박하지는 않습니다 (그림 1). 
3. 진통을 위하여 0.5% proparacaine을 점안하고 바늘을 30°의 각도로 바늘사면을 아래로 향하게 하여 내안각(Medial Canthus)쪽으로 삽입합니다 (그림 2). 
4. 안구 가장자리를 따라 아래로 진행하여 눈의 바닥에 도달할 때까지 진행합니다. 주사 전 흡인하지 않고 부드럽게 투여합니다. 
5. 부드럽고 천천히 바늘을 뺍니다. 이 때 출혈이 거의 없거나 전혀 없어야 합니다.

그림 1. Retro-orbital Injection 투여 예시 

* 그림출처: Yardeni T et al. Lab Anim (NY). 2011;40(5):155-160.

그림 2. Retro-orbital Injection 투여 모식도

* 그림출처: Yardeni T et al. Lab Anim (NY). 2011;40(5):155-160.

[Neonatal Mouse에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 생후 1-2일령 마우스에 이 투여 방법을 사용할 수 있습니다.
2. 보온 장치와 부드러운 거즈가 포함된 nesting이 있는 작은 용기에 neonatal mouse를 넣고 거즈 패드를 덮어 더 따뜻하게 해 줍니다.
3. 31G, 0.3125 inch 바늘길이의 0.3ml 인슐린 주사기를 사용합니다.
4. 마취는 하지 않고, 해부현미경(8-10배 확대면 충분)을 사용합니다.
5. Adult mouse와 마찬가지로 오른손잡이라면 neonatal mouse를 좌측 측와위로 눕히고 엄지와 검지손가락 끝으로 머리를 고정합니다. 호흡을 방해하지 않도록 너무 강하게 압박하지 않습니다. Neonatal mouse의 나머지 몸은 엄지와 검지손가락사이에 자리잡습니다 (그림 3). 
6. 멸균식염수와 면봉을 사용하여 눈위를 부드럽게 닦고(너무 적시면 저체온증의 위험이 있음) 바늘 사면을 아래로 향하게 하여 3시 위치에서 내안각(Medial Canthus)이 될 부위인 eye socket에 약 30°의 각도로 삽입합니다 (그림 3).
7. 부드럽게 투여를 하고 천천히 바늘을 빼내고 neonatal mouse를 보온이 되는 다른 용기에 놓습니다.

그림 3. Neonatal mouse에 대한 Retro-orbital Injection 투여 예시

* 그림출처: Yardeni T et al. Lab Anim (NY). 2011;40(5):155-160.

[절차]
비강내 투여를 실시할 경우 동물을 마취한 후 비강부위가 잘 보일수 있게 적절한 보정을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 투여시 동물의 비강 크기에 맞는 적절한 피펫과 팁이 필요합니다.

한 손으로 두부를 감싸듯이 보정하여 코끝이 하늘을 향하도록(약 45º) 하고, 투여를 용이하게 하기 위하여 투여 되는 한쪽 외비강을 비스듬히 위치합니다. 투여되는 외비강에 피펫을 이용하여 조심스럽게  한 방울 씩 떨어트려 들숨에 흡입할 수 있도록 합니다. 마취에서 회복하기 전 동물이 정상적으로 호흡하는지 관찰합니다.

* 그림출처: Krishnan JKS et al. J Neurosci Methods. 2017;286:16-21.

[주의사항]
랫드에서 권장하는 비강투여 약물의 최대 투여액량(Volume)은 0.1mL 입니다. 약물이 도달할 표적 부위에 따라 투여액량을 결정합니다. 상부호흡기계 또는 중추신경계가 표적인 경우 적은 양(~5μL), 하부 호흡기계가 표적인 경우에는 더 많은 양(예: 30~50μL)을 투여합니다.

[절차]
비강내 투여를 실시할 경우 동물을 마취한 후 비강부위가 잘 보일수 있게 적절한 보정을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 투여시 동물의 비강 크기에 맞는 적절한 피펫과 팁이 필요합니다. 

한 손으로 두부를 감싸듯이 보정하여 코끝이 하늘을 향하도록(약 45º) 하고, 투여를 용이하게 하기 위하여 투여되는 한쪽 외비강을 비스듬히 위치합니다. 투여되는 외비강에 피펫을 이용하여 조심스럽게  한 방울 씩 떨어트려 들숨에 흡입할 수 있도록 합니다. 마취에서 회복하기 전 동물이 정상적으로 호흡하는지 관찰합니다.

* 그림출처: Eyme KM et al. STAR Protoc. 2021;2(1):100290.

[주의사항]
성체 마우스에서 권장하는 비강투여 약물의 최대 투여액량(Volume)은 <0.05mL 입니다. 약물이 도달할 표적 부위에 따라 투여액량을 결정합니다. 상부호흡기계 또는 중추신경계가 표적인 경우 적은 투여액량(~5μL), 하부 호흡기계가 표적인 경우에는 더 많은 투여액량(예, 30~50μL)을 투여합니다.
 

[척수강 내 투여(Intrathecal Injection) 이란?]
중추신경계에 치료제를 전달하는 것은 혈액-뇌 장벽(BBB)과 혈액-척수 장벽때문에 어렵습니다. 이를 극복하기 위해 척수강 내 경로를 활용합니다. 척수관(Spinal Canal) 이나 거미막하 공간(Subarachnoid Space)을 통해 뇌척수액에 도달하도록 하는 투여방법입니다. 이 투여방법은 마취, 화학 요법, 통증 관리, 약물 전달에 활용할 수 있습니다.

* 그림출처: Rahman MM et al. Biomedicines. 2023;11(5):1413.

[방법]
1. 마취한 랫드의 요천추부위에 제모를 한 후 클로로헥시딘과 70% 알코올로 3회 소독합니다. 
2. 그림처럼 흉골을 바닥에 대고 엎드린 자세로 뒷다리를 복부 아래로 가져와 요천추 부위를 아치형으로 만듭니다.

* 그림출처: Thomas A et al. PLoS One. 2016;11(10):e0163909.

3. 25G 피하주사바늘과(Hypodermic Needle) 인슐린 주사기 (0.5ml)를 이용하여 마지막 요추(L6)와 첫번째 천추(S) 사이에 15-30°로 투여합니다. (그림에서 Cx: coccygeal vertebrae, L5: fifth lumbar verterbrae, L6: sixth lumbar vertebrae, S: sacrum. *: injection site (L6-S1))
4. 투여 전 주사바늘 허브(Needle Hub)에 뇌척수액이 존재하거나 투여 중 꼬리가 꿈틀거리면 성공적으로 투여가 되었다는 징후입니다. 
5. 이러한 징후가 나타나지 않거나 주사 전 바늘 허브에 혈액이 보이면 바늘을 빼고 다른 멸균 바늘을 사용하여 다시 수행합니다.  

[랫드 종류에 따른 투여 위치와 용량]
랫드에 따라 문헌에서는 투여치와 투여량이 다릅니다. 아래의 표를 참고하여 활용하시기 바랍니다. 

[방법] 

1. 마취된 마우스의 꼬리 밑에서 시작하여 약 3x3cm 범위로 털을 면도합니다. 
2. 면도한 부위를 5–10% 포비돈-아이오딘 용액으로 소독한 후, 70% 에탄올로 닦아냅니다. 이 과정을 3번 반복합니다.
3. 마우스의 복부 아래에 15mL cornical tube를 놓아 주사 바늘이 경막 내 공간에 접근할 수 있도록 척추간 인대(Interspinous Ligament)의 넓은 영역을 노출될 수 있도록 합니다 (그림 1B).
4. 근육과 엉덩이뼈의 경계에서 형성된 두 개의 홈을 찾아 장골능(Iliac Crest)을 찾습니다. 장골능(Iliac Crest)에 가장 돌출된 척수 돌기를 식별하여 L6 위치를 찾습니다. 이 위치가 척수가 끝나는 부위이기 때문에 투여 시 척수 손상이 가능성이 적습니다. 
5. 해밀턴 주사기에 투여물질(5–10μL)을 준비하여 주입합니다. 동일한 주사기를 여러 동물에 사용할 수 있지만 교차 오염을 방지하기 위해 투여물질별로 하나의 주사기만 사용해야 합니다. 
6. 그림 1C처럼 엉덩이 위쪽을 꼬집어 잡듯이 잡고(Pinching) 꼬리가 보일 수 있도록 합니다. 
7. 주사 바늘을 L5와 L6 척추 사이의 홈에 약 30° 각도로 삽입하여 깊이 약 0.5cm 정도까지 넣습니다 (그림 1D). 
8. 주사 바늘이 경막 내 공간에 성공적으로 들어가면 쥐의 꼬리가 움직이거나 "튀는" 반응이 관찰됩니다. 
9. 꼬리의 움직임을 관찰한 후, 투여물질을 천천히 지속적으로 주사합니다. 바늘을 조심스럽게 제거하고 주사 부위에 역류가 있는지 확인합니다.

그림 1. Intrathecal Injection 방법

* 그림 출처: Kennedy Z et al. Methods Mol Biol. 2022;2434:345-353.

[마우스에 따른 투여 위치와 용량]

마우스에 따라 문헌에서는 투여치와 투여량이 다릅니다. 아래의 표를 참고하여 활용하시기 바랍니다. 

* 표 출처: Rahman MM et al. Biomedicines. 2023;11(5):1413.

기도 내 투여는 랫드가 마취된 상태에서 몸부림이나 재채기 등의 반사를 최소화하여 진행합니다.

1. 랫드를 주사마취하여 기도 투여 보정 장치에 안전하게 위치시킨다.
2. 보정 장치 와이어에 위쪽 앞니를 걸고 포셉으로 혀를 부드럽게 견인하여 기도를 확보한다.
3. 광원을 이용하여 랫드의 인후두 부위를 비춰서 해부학적 구조물을 확인한다.
4. 광원을 통해 성대 사이에 기도 개구부를 찾아서 카테터를 조심해서 주입한다.
5. 주입된 카테터를 통해 pipette tip 또는 주사기를 연결해 약물을 주사한다.
6. 약물 주입 후 카테터를 제거하고 랫드를 cage로 옮겨서 마취에서 회복되는지 확인한다.