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지식 FAQ

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유전자변형마우스(GEM)를 제작하는 주요 방법에는 어떤 것들이 있나요? 마우스/랫드 형질전환
유전자변형마우스는 유전자 조작 기술을 이용해 특정 유전자의 기능을 분석하거나 질병 모델 제작을 위해 만들어진 모델입니다. 제작 방법은 연구의 목적에 따라 Knock-out(KO), knock-in(KI), Transgenic(Tg)로 나눌 수 있습니다.

KO 마우스는 특정 유전자를 제거하거나 불활성화 시켜 해당 유전자의 기능이 소실된 모델입니다. 제작에는 배아줄기세포(ES cell) 타겟팅 기법 또는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술이 사용됩니다. 이러한 KO 마우스는 유전자 기능을 분석하는데 유용하며, 암, 대사질환, 면역 이상 등 유전자 결핍에 따른 생리적 변화를 연구하는데 활용할 수 있습니다.

(그림출처) Doyle et al. Transgenic Res (2012)

KI 마우스는 특정 유전자를 유전체 내의 표적 위치에 삽입하여 해당 유전자의 기능이 발현되도록 제작된 모델입니다. 제작에는 배아줄기세포 타겟팅 기술 또는 CRISPR-Cas9 기술이 활용됩니다. KI 마우스는 질환 관련 변이를 반영하거나 리포터 유전자를 삽입하는 등 유전자의 기능 변형을 연구하는데 적합하며, 유전성 질환 모델, 약물 타겟 분석, 유전자 발현 조절 연구 등에 활용됩니다.

(그림출처) Doyle et al. Transgenic Res (2012)

Tg 마우스(형질전환마우스)는 외래 유전자를 수정란의 전핵에 주입하여 유전체 내에 무작위로 삽입하여 제작한 모델입니다. 이 방법은 비교적 빠르고 효율적으로 제작이 가능하지만, 삽입 위치에 따라 유전자 발현 수준이 달라질 수 있습니다. 특정 유전자의 과발현 모델을 구축하거나 조직 특이적 발현을 유도하는데 적합하며, 유전자 기능 분석, 발현 조절 연구, 질병 유발 단백질의 생리적 영향 평가 연구 등에 활용할 수 있습니다.

(그림출처) Doyle et al. Transgenic Res (2012)
유사질문
유전자변형마우스 제작 방법에는 어떤 기술들이 사용되며 각 모델은 어떤 연구에 활용할 수 있나요?

KO, KI, Tg 마우스는 어떻게 다른 건가요?
References
1)Alfred Doyle, Michael P McGary, Nancy A Lee, James J Lee. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res 2012 April;21(2):327-349

2)Young Hoon Sung, Young Jin, Seokjoong Kim, Han Woong Lee. Generation of knockout mice using engineered nucleases. Methods 2014 Aug 15;69(1):85-93

3)Jeffry D Sander, J Keith Joung. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 2014 Apr;32(4):347-5
유전자변형마우스 GEM Knock-out Knock-in Transgenic
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형질전환 모델 동물의 유전자 발현을 정확하게 정량화하는 방법은 무엇인가요? 기타 형질전환

– 형질전환 모델 동물에서 표현형(phenotype) 변화를 정량적으로 평가하는 방법은 3가지가 있습니다.

1) 분자 수준 분석 (Molecular phenotyping)

방법	측정 대상	특징
qPCR, ddPCR	mRNA 발현량	민감도 높음, 정량 정확
Western blot, ELISA	단백질 발현량	번역 수준에서의 효과 확인
RNA-seq, scRNA-seq	전사체 수준 변화	고해상도 분자 표현형
ChIP-seq, ATAC-seq	유전자 조절변화	epigenetic 영향 확인

2) 세포/조직 수준 분석

방법	목적	비고
면역조직화학 (IHC)	조직 내 발현 위치, 강도 확인	정성+정량 (ImageJ로 quantification)
Flow cytometry	특정 세포 집단의 변화	표지자 단백질의 발현 분석
FACS-sorting 후 qPCR/Western	세포군 단위 기능 정량화	고정밀도 분석 가능
In vivo imaging (IVIS, PET)	실시간 발현 변화 시각화	비침습적 정량화 가능

3) 형질전환 위치와 복제수 분석

방법	설명
Southern blot	삽입 위치와 copy number 확인
qPCR/RT-qPCR	삽입 유전자의 발현 수준 정량
Digital PCR (ddPCR)	absolute copy number 분석
WGS/NGS	전체 삽입 위치/재배열 분석 가능

유사질문

형질전환 동물에서 유전자의 효과를 객관적으로 평가하려면 어떤 지표나 방법을 써야 하나요?
유전자 발현에 대한 결과를 신뢰할 수 있게 정량화하려면 어떤 실험을 해야 하나요?

References

1) Lloyd KCK. Commentary: The International Mouse Phenotyping Consortium: high-throughput in vivo functional annotation of the mammalian genome. Mamm Genome. 2024;35(4):537–543. doi:10.1007/s00335-024-10068-x. PMID: 39254744; PMCID: PMC11522054

2) Meehan TF, Conte N, West DB, et al. Disease model discovery from 3,328 gene knockouts by The International Mouse Phenotyping Consortium. Nat Genet. 2017;49(8):1231-1238. doi:10.1038/ng.3901. PMID: 28650483; PMCID: PMC5546242

형질전환 phenotyping 정량화

Mosaicism과 Chimerism의 차이는 무엇이며, 해결하기 위한 전략은 무엇일까요? 마우스/랫드 형질전환

Mosaicism과 Chimerism의 차이는 아래 도표와 같습니다.

구분	Mosaicism (모자이크)	Chimerism (키메라)
정의	동일한 수정란에서 발생했지만, 분열 중 유전적 변화로 서로 다른 세포들이 존재	서로 다른 수정란에서 유래한 세포들이 하나의 개체로 결합
유전적 출처	단일 수정란 → 발생 중 돌연변이 등으로 분기	두 개 이상의 수정란 또는 배아가 합쳐짐
발생 예	형질전환 마우스 제작 시, 유전자 삽입이 일부 세포에만 발생	배아 융합 실험, 줄기세포 주입 시
형질전환 동물과의 연관성	CRISPR, DNA 주입 후 일부 세포만 형질전환 → 흔한 문제	ES cell-based gene targeting 후 blastocyst injection 시 발생
진단법	PCR, NGS, reporter assay로 조직 간 유전자 발현 비교	coat color chimerism, genotype 분석 등

- 해결전략

1) Mosaicism 해결전략: (a) 1-cell stage에서 주입 진행
(b) CRISPR/Cas9+RNP 또는 ssODN 동시 전달
(c) F1 세대 선별
(d) high-fidelity Cas9 또는 base editor 사용

2) Chimerism 해결 전략: (a) Blastocyst injection 후 germline 전이 확인

(b) 100% ES cell 유래 개체 확보 시까지 backcross 진행

유사질문

수정란 주입 후 생기는 Mosaicism 문제는 어떤 방식으로 해결할 수 있나요?
형질전환 실험에서 Mosaicism 와 Chimerism은 어떤 문제를 일으킬 수 있으며, 이를 피하려면 어떻게 해야 하나요?

References

1) Nagel MK, Vogel K, Isono E. Transient Expression of ESCRT Components in Arabidopsis Root Cell Suspension Culture-Derived Protoplasts. Methods Mol Biol. 2019;1998:163-174. doi: 10.1007/978-1-4939-9492-2_12. PMID: 31250301.

형질전환 Mosaicism Chimerism

형질전환 제작을 한 F0세대에서는 형질발현이 잘되나, 자손세대(F1~) 이후부터는 발현이 약한데 왜 그럴까요? 마우스/랫드 형질전환
- 형질전환 동물 제작에서 F0 세대에서는 형질발현이 잘되다가, F1 세대부터 발현이 약해지는 현상은 자주 관찰되는 현상으로 가능한 원인과 트러블 슈팅은 아래 5가지 정도가 있습니다.

1) F0 세대가 모자이크(Mosaic)

- F0 세대는 수정란 주입 단계에서 형질전환된 개체로, 일부 세포에만 형질전환이 일어난 ‘모자이크’ 상태일 수 있습니다. 즉, 발현이 강했던 조직은 유전자 삽입된 세포에서 유래했지만, 생식세포에는 삽입이 안 된 경우가 있을 수 있습니다.

- 트러블슈팅: (a) F1 세대를 여러 마리 분석하여 다양한 라인을 선별
(b) 유전자 삽입 위치와 복제수 확인 (PCR, qPCR, Southern blot)
(c) 발현 수준에 따라 F1 라인을 비교하고 고발현 라인을 선별

2) 게놈 내 삽입 위치(Position Effect)에 따른 발현 차이

-유전자가 삽입된 게놈의 위치에 따라 주변 염색질 환경(heterochromatin/euchromatin)에 의해 유전자 발현이 영향을 받을 수 있습니다. F0 세대는 다수의 세포에서 삽입된 복수의 위치에서 발현되나, F1 세대는 그 중 하나의 삽입 위치만 유전될 수 있어 전반적인 발현량이 낮아질 수 있습니다.

-트러블슈팅: (a) insulator (예: HS4) 시퀀스를 플라스미드에 삽입해 위치 효과 완화
(b) Safe harbor locus (예: Rosa26)에 knock-in하여 발현 안정화
(c) 다수의 F1 라인 중 높은 발현 라인을 선별하여 유지

3) 유전자의 부분적 또는 변형된 삽입

- F0 세대에서 일부 세포는 완전한 유전자를 삽입했지만, 생식세포에 유전된 유전자는 부분적으로 잘린 형태일 수 있습니다.이 경우 F1 세대에서는 발현이 약하거나 결실되어 발현이 안 될 수도 있습니다.

- 트러블슈팅: (a) PCR 또는 long-range PCR로 삽입 유전자 구조 확인
(b) Southern blot으로 삽입체 크기 및 복제수 확인

4) 에피제네틱 억제(Epigenetic Silencing)

- 외부 유전자는 세대가 지나면서 메틸화나 히스톤 변형에 의해 발현이 억제될 수 있습니다.

- 트러블슈팅: (a) DNA 메틸화 분석 (bisulfite sequencing) 수행
(b) 강한/조직 특이적 promoter (e.g., CAG, EF1α, CMV) 사용
(c) inducible system (예: Tet-On/Off)을 활용하여 발현 조절

5) 다중 삽입(Multiple Copy Insertion)에 따른 유전자 침묵

- F0 세대에서 유전자가 고복제수로 삽입되면 발현량이 높지만, F1 세대에서는 복제수 감소 또는 repeat-induced gene silencing (RIGS) 현상으로 인해 발현이 급격히 떨어질 수 있습니다.

- 트러블슈팅: (a) qPCR로 복제수 정량
(b) single-copy knock-in으로 대체하여 안정적 발현 유지
유사질문
형질전환 생쥐에서 세대를 거치면서 유전자 발현이 억제되는 이유는 무엇인가요?

F0에서는 GFP 발현이 보이는데, F1부터는 관찰되지 않는 이유가 무엇인가요?
References
1) Haruyama N, Cho A, Kulkarni AB. Overview: engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009 Mar;Chapter 19:Unit 19.10. doi: 10.1002/0471143030.cb1910s42. PMID: 19283728; PMCID: PMC2743315

2) Heard E, Martienssen RA. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 2014 Mar 27;157(1):95-109. doi: 10.1016/j.cell.2014.02.045. PMID: 24679529; PMCID: PMC4020004
형질전환 형질발현 Epigenetic silencing
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잘 알려져 있는(Well validated, 검증된) 형질전환동물이 아니라 자체 제작한 형질동물로도 임상 허가를 위한 효력 질환모델로 인정을 받을 수 있을까요? 마우스/랫드 형질전환
- 마우스는 유전자 조작, 질병 모델링, 그리고 전임상 시험을 위한 최고의 실험동물로 활용되고 있지만, 많은 전임상 연구에서 재현성이 부족하다는 점이 점점 우려되고 있습니다. 미국 국립보건원(NIH)은 전임상 단계에서의 데이터 재현성을 보장하기 위해 더욱 엄격하게 설계된 연구를 요구하고 있고, 따라서 신중하고 견고한 통계 분석, 데이터 보고의 투명성, 그리고 자료 공유가 필요합니다. 이를 바탕으로 기본적으로는 검증된 상업화 마우스를 활용하는 것이 재현성을 높이는 데 중요한 요소입니다.

- 자체 제작한 인간면역화 마우스는 면역 기능이 결핍된 마우스에 인간의 세포, 유전자, 조직 등을 이식하여 인간과 유사한 생리학적인 특성이 발현되도록 한 실험동물이며, 면역세포치료제나 항체의약품을 대상으로 한 비임상시험에 유용합니다. 바이오 의약품 중 인간의 면역체계를 기반으로 기전이 발현하는 종류는 동물과 사람의 생리체계가 다른 이유로 그동안 비임상시험에서 정확한 성능을 평가하기 어려웠습니다. 그러나 인간화마우스를 사용하면 비임상시험에서 사람의 면역체계에 준하는 데이터를 얻을 수 있을 것으로 기대하고 있습니다.

- 최근 미국 FDA는 4세대 항암제로 분류하는 CAR-T (Chimeric antigen receptor-T cell therapeutics)독성 시험에 자체 제작한 인간면역화 마우스인 Hu-mice 사용으로 비임상 허가사례(2017년)가 있으며, 그 활용도는 증가될 것으로 예상됩니다.

- 결론적으로, 자체 제작한 형질전환동물도 모델의 과학적 정당성 입증, 형태생리 및 표현형 데이터 확보, 기존 약물에 대한 반응성 검증, 기존 모델과 비교 및 재현성 확보 과정 등을 통해 과학적 정당성이 확보된다면 질환모델로 인정받을 수 있습니다.
유사질문
희귀질환의 비임상 효력 모델이 없는 경우, 신규 제작된 마우스를 이용시 허가국에서 의약품 비임상효력결과로 인정받기 위해 고려해야 할 사항은 무엇일까요?
References
1) Zuberi A, Lutz C. Mouse Models for Drug Discovery. Can New Tools and Technology Improve Translational Power?. ILAR J. 2016;57(2):178-185. doi:10.1093/ilar/ilw021

2) Roy MV. Animal models in translational medicine: Validation and prediction. European Journal of Molecular & Clinical Medicine. 2014; doi:10.1016/J.NHTM.2014.08.001

3) Wen H, Qu Z, Yan Y, et al. Preclinical safety evaluation of chimeric antigen receptor-modified T cells against CD19 in NSG mice. Ann Transl Med. 2019;7(23):735. doi:10.21037/atm.2019.12.03
형질전환 유전자 조작 비임상 효력 효능 commercialized mouse
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유전자조작마우스의 수명은 일반마우스의 수명과 비교할 때 얼마나 차이가 있나요? 마우스/랫드 형질전환
- 자연 야생 마우스는 평균 3~4개월, 최대 18개월까지 사는 것으로 알려져 있으나, 잘 관리된 SPF 환경에서 C57BL/6 마우스는 평균 26~30개월을 살 수 있으며 이는 노화 연구에 가장 흔히 사용되는 포유류 모델입니다.

- 노화연구를 하여 코헨 연구팀은 SIRT6 유전자가 정상보다 높은 수준의 단백질을 생성하도록 쥐를 유전자 변형시켰으며 그 결과, 유전자 변형 쥐는 야생 쥐보다 기대 수명이 23% 더 길었을 뿐만 아니라 건강 상태도 더 오래 유지하는 것으로 나타났습니다. 이밖에 유전자 편집 기술을 통해 수명 연장이 된 사례가 있으며 이는 계속적으로 연구 중에 있습니다.

- 유전자 조작에 의해 마우스 수명이 감소할 수도 있습니다. 특히, 특정 유전자가 결실된 경우, 생존에 필수적인 유전자일 경우 생후 수일 내 폐사 할 수 있습니다. 그 예로는 노화촉진 마우스(Senescence Accelerated Mouse, SAMP) 계통과 특정 질환 모델 (예: 조로증, 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS 등) 마우스입니다.

- 따라서 어떤 유전자를 어떻게 조작했는지에 따라 수명이 매우 다르게 나타날 수 있습니다.
유사질문
형질전환동물 마우스와 정상동물의 수명 차이는 있나요?
References
1) Ladiges W, Van Remmen H, Strong R, et al. Lifespan extension in genetically modified mice. Aging Cell. 2009;8(4):346-352. doi:10.1111/j.1474-9726.2009.00491.x

2) Editing one gene extends mouse life expectancy by 23%. Freethink. Published June 4, 2021. Accessed July 10, 2025. https://www.freethink.com/health/gene-editing-life-expectancy
형질전환 유전자 조작 수명 노화
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당뇨 비임상 모델이 임상질환을 대변할 수 있는 특성이 무엇이 있나요? 마우스/랫드 형질전환

- 당뇨병은 췌장 호르몬인 인슐린의 분비 및 작용 결함으로 인한 만성 고혈당 질환입니다. 2가지 유형이 있는데, 제1형 당뇨병은 인슐린을 생성하는 췌장 베타 세포의 자가면역적 파괴로 인해 발생하며, 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 베타 세포의 보상 기능 장애로 인해 발생합니다.

- 일반적으로 동물 모델연구 중 제1형 당뇨병 동물 모델은 자발적으로 자가면역 당뇨병이 발생하는 동물부터 췌장 베타 세포의 화학적 절제한 모델이 있으며 제2형 당뇨병은 다양한 정도의 인슐린 저항성과 베타 세포 기능 부전을 보이는 형질전환 및 녹아웃 마우스 모델이 있습니다. 당뇨병의 다양한 임상적 특징이나 관련 표현형을 나타내어 각 모델의 장점 및 한계점이 널리 알려져 있습니다.

- 여러 모델을 활용하여 당뇨병 신약 연구를 선택적으로 활용을 해야 하며, 2종 이상의 모델을 활용해야 합니다. 또한, 당뇨 합병증 모델 동물에 대한 종류는 아래 자료를 참고해 주세요.

임상적인 당뇨 합병증	동물 모델	특징
당뇨병성 신경병증 (Diabetic neuropathy)	STZ induced rat model	운동 기능 장애가 있는 경우 비골신경과 축삭의 섬유 크기가 미엘린 덮개보다 작음
	C57BL/KS (db/db) mice	감각신경전도속도 감소 및 표피내신경섬유 밀도(IENF) 감소
	Ischemic reperfusion injury model	혈청 IL-10 수치 감소, 신경 전도 속도 감소, 신경 섬유 밀도 감소
당뇨병성 신병증 (Diabetic nephropathy)	NOD mice	확대된 사구체와 사구체간질경화증
	C57BL/6	알부민뇨 및 신장 기능 저하
	GK rat	사구체 비대를 초래하는 사구체 비후
	Zucker diabetic fatty rat	사구체경화증, 세뇨관간질섬유증 및 신장비대
	Zebra fish	CIN85/RukL의 과발현으로 인한 부종
당뇨병성 망막병증 (Diabetic retinopathy)	Alloxan induced model	무세포 모세혈관 증가를 동반한 미세동맥류
	Akita mice	아마크린 세포와 신경절 세포의 수 감소
	db/db mouse	망막이 두꺼워지면 망막 신경절 세포의 수 감소
	Surgical model	망막의 증식성 및 수축성 세포막 형성
	Zebra fish	망막의 퇴화 및 얇아짐
당뇨병성 심근병증 (Diabetic cardiomyopathy)	Alloxan induced model	산화 스트레스를 유발하는 고급 당화 최종 생성물 형성
	BB rats	칼슘 감소 – ATPase 활동 및 심장 수축력 자극
	OLETF rats	좌심실 이완 기능의 변화
	STZ induced model	심근 손상을 유발하는 섬유화 및 세포사멸
	GK rats	고혈당증, 고지혈증 및 심장세포 사멸

유사질문

당뇨 합병증 질환 연구시 관련된 비임상모델의 종류가 궁금해요

References

1) Chatzigeorgiou A, Halapas A, Kalafatakis K, Kamper E. The use of animal models in the study of diabetes mellitus. In Vivo. 2009;23(2):245-258

2) King AJ. The use of animal models in diabetes research. Br J Pharmacol. 2012;166(3):877-894. doi:10.1111/j.1476-5381.2012.01911.x

형질전환 유전자 조작 임상증상 당뇨 합병증

Genotyping을 위한 샘플 채취 시, 비침습적인 방법은 없나요? 마우스/랫드 형질전환

- 이상적인 유전자형 분석 방법은 신뢰할 수 있고, 빠르며, 저렴하고, 반복하기 쉬우며, 비침습적이어야 합니다. 실험동물에게 고통과 스트레스를 최소화하는 것은 동물복지뿐만 아니라 실험 결과의 신뢰성을 위해서도 매우 중요합니다.

- 기존에는 유전자형 분석을 위해 꼬리나 귀 조직을 절단하거나, 혈액 또는 발가락을 절단하여 DNA를 추출해 왔습니다. 이 방법들은 높은 농도의 DNA를 얻을 수 있지만, 매우 침습적이며 동물 복지에 부정적인 영향을 줍니다.

- 대안 방법에는 털, 구강 또는 항문 면봉, 타액, 대변 펠릿 등을 통한 DNA 채취가 있으며 이 중 대변 펠릿은 마우스를 억제하거나 고정할 필요가 없기 때문에 가장 비침습적인 방법으로 평가받고 있습니다.

- 대변에서 DNA를 추출하는 원리는 “장에서 탈락된 결장 상피세포(colonocytes)”를 이용하는 것입니다. 결장세포는 3~4일 주기로 재생되므로, 대변에는 일정량의 세포가 포함됩니다.

- 마우스로부터 대변을 수집하는 방법에는 마우스를 고정하여 수집하거나, 깨끗한 케이지에 넣는 방식, 또는 이미 배설된 대변을 수집하는 방식 등이 있습니다.

- 이 방법은 비침습적이고 반복 가능하며 스트레스를 최소화할 수 있다는 장점이 있지만 단점도 존재합니다. 우선, 시간과 비용(키트 사용 필요)이 더 소요될 수 있습니다. 또한 분변에는 PCR 억제물질과 오염물질들이 포함되어 있는 것으로 알려져 있습니다. 집단 사육 시 서로의 털이나 대변을 섭취하여 다른 마우스로부터 유래된 DNA에 의해 오염되거나 거짓 양성 결과가 발생할 가능성도 존재합니다. 또한 이유 전(pre-weaning) 마우스에서는 불가능하다는 보고도 있습니다.

- 결론적으로, 대변을 이용한 비침습적 유전자형 분석은 동물 복지를 고려한 유용한 대안이 될 수 있으나, 실험 조건과 대상 동물의 특성에 따라 적절한 방법을 신중히 선택해야 합니다.

※ 참고. Genotyping용 샘플 채취방법별 장단점 비교

샘플 종류

장점 (Advantages)

단점 (Disadvantages)

꼬리 (Tail)

- 높은 DNA 수율

- 이유 전에도 수행 가능

- 침습적

- 절단 필요, 마취 요구

- 조직처리 과정이 길다

- 반복 불가

- PCR 억제물포함

발가락 (Toe)

- 식별용으로도 사용 가능

- 생후 6일부터 수행 가능

- 침습적이며 고통을 유발

- 조직처리 과정이 길다

- 생후 14일 이후에는 부적합

귀 (Ear)

- 식별용으로도 사용 가능

- 침습적

- 생후 2주 미만에는 부적합

혈액 (Blood)

- 저장 용이

- 반복 가능

- 빠른 DNA 추출 가능

- 침습적

- 출혈성질환 있는 마우스에 부적합

- 낮은 DNA 수율

- 생후 2주 미만에는 부적합

털 (Hair)

- 최소 침습적

- 빠른 채취 및 분석

- 반복 가능

- 마우스 고정 필요

- 샘플 간 교차 오염 가능성

- 낮은 DNA 수율

타액 (Saliva)

- 최소 침습적

- 반복 가능

- 모든 연령에 적합

- 마우스 고정 필요

- 낮은 DNA 수율

- 어린 마우스에는 nested PCR 필요

구강 세포 (Buccal cells)

- 최소 침습적

- 빠른 추출

- 반복 가능

- 마우스 고정 필요

- 구강 손상 위험

- 낮은 DNA 수율

직장 세포 (Rectal cells)

- 최소 침습적

- 반복 가능

- 마우스 고정 필요

- 직장 점막 손상 위험

분변 (Feces)

- 비침습적

- 마우스 고정 불필요

- 빠른 채취

- 반복 가능

- PCR 억제물 존재

- 낮은 유전체 DNA 수율

- 생후 3주 미만에는 부적합

유사질문

꼬리 조직 외에 다른 대안 조직은 없나요?
분변샘플로 genotyping이 가능한가요?

References

1) Symonds EL. Fecal DNA Genotyping: A Non‑invasive Approach to Characterize Mouse Models for Nutrigenomics Cancer Chemoprevention Studies. Curr Pharmacogenomics Personalized Med. 2013;11(1):[e151–e159]

형질전환 Genotyping 분변 비침습적

Off-target이 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환
1) Off-target 효과란 무엇인가요?

- Off-target 효과란 유전자 편집 도구(예: CRISPR-Cas9)가 목표한 DNA 서열이 아닌 부위에 결합하여 의도치 않게 DNA를 절단하거나 변형시키는 현상입니다.

- 오프타겟 유전체 편집은 원치 않는 DNA 손상, 면역 반응, 세포 독성, 종양 유전자 활성화 등의 유해한 결과로 이어질 수 있습니다. 그리고 유전자 기능에 관한 과학적 발견에 대해 의문을 제기할 수도 있습니다.

(그림출처) Biologics: Targets and Therapy January 2024 18:21-28

2) Off-target 효과를 줄이기 위한 방법으로 아래와 같은 전략이 있습니다.
유사질문
Off-target 효과가 왜 문제가 되나요?

형질전환 동물을 만들 때, 목표한 유전자 외 다른 유전자가 변형될 가능성도 있나요?
References
1) Asmamaw Mengstie M, Teshome Azezew M, Asmamaw Dejenie T, Teshome AA, Tadele Admasu F, Behaile Teklemariam A, Tilahun Mulu A, Mekonnen Agidew M, Adugna DG, Geremew H, Abebe EC. Recent Advancements in Reducing the Off-Target Effect of CRISPR-Cas9 Genome Editing. Biologics. 2024 Jan 18;18:21-28. doi: 10.2147/BTT.S429411. PMID: 38260716; PMCID: PMC10802171.
형질전환 Off-target 오프타겟 효과 비의도적 돌연변이
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특정 조직에서만 유전자를 없애고 싶은데 어떻게 하나요? 마우스/랫드 형질전환
특정 조직에서만 유전자를 제거하고자 할 때는 조직 특이적 cre 마우스를 이용하면 됩니다.

이 시스템은 cre 효소가 loxP 서열 사이에 있는 DNA를 절제하는 방식으로 작동하며, 특정 조직에서만 cre를 발현하도록 설계된 조직 특이적 cre 마우스를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 간에서는 Albumin-cre, T세포에서는 CD4-cre, 근육에서는 ACTA-cre 등을 사용할 수 있습니다. (조직 특이적 cre 마우스 종류 참고: Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147-159.)

제거를 원하는 유전자(Gene X)에 loxP site가 삽입된 “floxed mouse”를 간 특이적 cre 발현 마우스(Alb cre)와 교배하면, cre를 가지고 있고 GeneX에 대해 heterozygous floxed 상태인 마우스를 얻을 수 있습니다. 이 마우스를 다시 homozygous floxed mouse와 교배를 시키면 간에서 GeneX가 모두 제거된 실험 마우스를 얻을 수 있습니다.

(그림출처) https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2011/september/cre-lox-breeding

만약 Cre 발현이 실제로 조직 특이적으로 잘 작동되는지 확인하려면 reporter 마우스 (Rosa26-LSL-tdTomato, Rosa26-LSL-EYFP, ROSA26-LacZ reporter 등)와 교배해 형광 단백질 발현을 통해 확인 할 수 있습니다.

Reporter 마우스를 Cre 마우스와 교배하면, Cre가 발현된 조직에서만 loxP 사이의 STOP cassette이 제거되어 형광 단백질(예: tdTomato, EYFP)이나 β-galactosidase(LacZ)가 발현됩니다. 형광 단백질 발현은 형광현미경 관찰을 통해 확인하거나 β-galactosidase를 염색해서 조직학적으로 확인할 수 있습니다.

* 그림: 장 상피에서 Villin cre 발현여부를 X-gal 염색으로 확인 (X-gal 염색: β-galactosidase와 반응하여 푸른색을 띠는 염색약)

(그림출처) el Marjou F, Janssen KP, Chang BH, et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 2004;39(3):186-193.
유사질문
Cre가 원하는 조직에서만 발현되었는지 어떻게 알 수 있나요?

Cre/loxP 시스템이 제대로 작동했는지 어떻게 확인하나요?
References
1) Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147-159.

2) 김정은, Cre 발현유도 시스템을 이용한 유전자 기능 연구, 대한내분비학회지. 2006

3) The Jackson Laboratory. Cre Lox Breeding for Beginners. Part 1. Accessed July 11, 2025

4) el Marjou F, Janssen KP, Chang BH, et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 2004;39(3):186-193.
형질전환 Cre/loxP 유전자제거 KO
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