Knock-in 기술은 대부분 HDR(Homology-Directed Repair)에 기반한 기술로, Knock-in 하려는 삽입  DNA 서열의 양쪽 끝에 타겟 DNA 서열을 연결하여 HDR 반응에 의한 DNA 가닥이 대체되어 유도됩니다. 하지만, 제노프스 배아는 HDR 효율이 매우 낮고, 주로 NHEJ(Non-Homologous End-Joining)  방법으로 DNA break가 교정되어 정확한 Knock-in 효율이 매우 낮습니다. 또한,  1-cell stage가 아닌 2~4-cell stage에서 주입하는 경우가 많아 유전자 삽입의 모자이크 발생하고, 매우 낮은 효율로 발생하여 생식세포로의 유전자 삽입 역시 어렵습니다.

하지만 아래와 같은 방법으로 Knock-in을 성공적으로 수행한 연구결과가 보고되었습니다.

제노프스에서 유전자 과발현은 주로 미세주입(microinjection) 통해 이루어집니다. 사용 목적에 따라서 2세포~8세포기 배아의 할구에 합성된 mRNA를 양을 다르게 해서 주입하거나, CMV 프로모터에 의해 조절되는 plasmd를 직접 주입합니다. DNA 벡터는 pCS2, pCS107, pCS108 등 다양한 종류의 CMV 프로모터 기반 플라스미드를 사용합니다.

위 방법은 초기 배아 발생 과정에서 유용한 방법이나, 배아발생기 이후에 올챙이 조직, 또는 성체 조직에 전기천공법 (electrophorarion), LNP 등의 Lipofection 용액과 함께 DNA를 원하는 조직에 직접 주입하여 모자이크 패턴의 과발현 기법을 사용하기도 합니다.

미세천공 기법은 TSS20 OVODYNE electroporator, Intracel 기기가 사용된 적이 있으며, 전극은 직접 제작하거나 사용 목적에 맞는 전극을 구매하여 사용합니다.

Lipofection 기법은 세포의 transfection에 사용되는 대부분의  lipid-based transfection 용액이 사용 가능합니다.

마우스의 C/loxP 시스템과 같은 세포타입 특이적인 유전자의 프로모터를 이용한 조직 특이적 발현 조절은 아직 범용적으로 사용되지 않고 있습니다. 하지만 발생단계 배아의 초기 난할 과정에서 할구의 운명지도 (Fate map)가 비교적 자세이 알려져 있어서, 배아의 할구에 mRNA 또는 morpholino를 미세주입 (microinjection)을 통해 유전자의 발현을 초기 배아 조직 단위로 조절할 수 있습니다. 제노프스 데이터베이스인 Xenbase 32세포기의 운명지도를 확인할 수 있습니다.

대표적인 예는 아래와 같습니다.

또한, 일부 조직에서 조직특이적인 유전자의 프로모터를 사용하여 조직 특이적으로 유전자의 발현을 유도한 연구가 있습니다. 예는 아래와 같습니다.

결론적으로, 제노프스에서도 조직특이적인 유전자 조절이 가능하지만, Cre/loxP 시스템과 같은 정밀 조절은 어려우며, Fate map을 이용한 할구 특이적 미세주입, 프로모터를 사용한 조직 특이적 발현등을 사용합니다.

Morpholino의 부작용은 Zebrafish를 사용에서 최초로 보고되었으며, 부작용의 주요 원인으로는 비특이적인 오프타겟 효과, MO 자체 독성 등으로 요약됩니다.

Xenopus를 사용한 MO 부작용으로는 선천적 면역반응 (innate immune response) 을 유발함이 보고되어 있습니다. 이 연구에서는 MO 주입에 의해 광범위한 선천적 면역반을 유전자의 발현을 증가시키고 또한 여러 유전자의 mis-splicing을 유도할 수 있음이 보고되었습니다.

그러나, 이후 발표된 광범위하고 체계적인 연구에서는 기존의 연구들이 적절한 실험 대조군을 사용하지 않거나, 실험적 검증이 부족한 데이터들을 포함하고 있기 때문이며, 또다른 연구에서는 MO를 사용한 Xenopus 연구의 광범위한  RNA-seq 데이터들을 분석하여 선천적 면역반응 유전자의 변화를 분석한 결과, 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 주장하고 있습니다.

이러한 오류들을 줄이기 위해 아래와 같은 적절한 MO 사용방법이 제시되었습니다.

  • 실험 결과를 해석함에 있어서 신중하게 해석할 것

MO는 발생학 연구에 있어서 여전히 대체 불가능한 장점들을 보유하고 있습니다.

결론적으로, MO의 부작용을 우려하여 사용을 자제하는 것보다 적절한 대조군과 실험 환경에서 목적에 맞게 사용하는 것이 권장됩니다.

제노프스(Xenopus) 배아는 발생 속도가 빠르고 투명하여, 특정 시기(stage)나 조직에서 유전자의 기능을 정밀하게 조절하기에 좋은 모델입니다.

그러나 조기 발현이나 억제로 인한 비특이적 결함 때문에 후기 기능을 분석하기 어려운 경우가 많습니다. 이를 해결하기 위해 빛(자외선)을 이용해 유전자 발현을 시간적으로 제어하는 photo-morpholino (photo-MO)기술을 사용할 수 있습니다.

Photo-MO는 표적 mRNA에 결합해 번역을 억제하는 morpholino(antisense oligonucleotide)의 변형체로, 염기 중간에 빛 민감성 결합부(light-sensitive subunit)를 포함합니다.

이 결합부는 365 nm 자외선을 받으면 절단되어 두 조각으로 나뉘며, 결합력이 약화되어 표적 mRNA로부터 떨어지게 됩니다. 그 결과 mRNA의 번역이 허용되어 유전자 발현이 켜집니다 (UV-ON 시스템).

(1) UV-ON 시스템 (Photo-Antisense MO)

Antisense 방향의 photo-cleavable morpholino는 일반 morpholino와 동일하게 mRNA의 번역을 차단하지만, 자외선 조사 후 절단되면 억제가 해제되어 유전자 발현이 시작됩니다.

이 방식은 in vitro 전사된 mRNA와 photo-antisense MO를 미리 혼합(pre-hybridization)하여 배아에 미세주사한 후, 원하는 발생 단계에서 자외선을 조사함으로써 특정 시점(stage 8, 22 등)에 유전자 발현을 켜는(ON) 효과를 얻을 수 있습니다.

(2) UV-OFF 시스템 (Sense-Photo MO)

반대로 sense-photo morpholino (S-photo-MO) 를 이용하면 UV-OFF 시스템도 구현할 수 있습니다. 이 경우, 일반 morpholino(MO)가 표적 유전자를 억제하는데, sense-photo-MO가 그 MO와 상보적으로 결합하여 그 활성을 임시로 차단합니다.

자외선을 비추면 sense-photo-MO가 절단되어 일반 MO가 다시 활성화되므로, 빛으로 유전자 기능을 끄는(OFF) 조절이 가능합니다.

antisense-photo-MO → UV 조사 시 유전자 발현 ON

sense-photo-MO + regular MO → UV 조사 시 유전자 발현 OFF

이 두 가지 조합을 통해 연구자는 빛으로 유전자 기능을 시기별로 켜거나 끌 수 있으며, 특정 세포나 조직에만 광원을 제한적으로 조사하면 공간적(spatial) 조절도 가능합니다.

이 기술은 optogenetics와 마찬가지로 광자극을 이용한 정밀한 시간·공간적 제어를 가능하게 하지만, 단백질 수준이 아니라 mRNA 번역 단계에서 작동한다는 점이 다릅니다. 따라서 전사인자나 효소의 조기 발현이 전체 발생에 영향을 주는 경우에도, 이 시스템을 사용하면 후기 단계의 유전자 기능을 선택적으로 분석할 수 있습니다.

Extrachromosomal array를 염색체에 삽입한 것을 integrated line이라고 부르는데, integrated line을 얻으면 매 세대마다 형질전환종을 고르지 않아도 Mendelian genetics에 따라 transgene이 다음 세대로 100% 전달되는 장점이 있습니다.

삽입하는 방법은 UV나 감마선 irradiation 등으로 염색체 DNA에 double strand break를 만들면 repair 과정에서 가끔 transgene이 삽입되는 경우가 있는데 이 것이 일어난 선충을 찾으면 됩니다.

이는 발생할 확률이 적은 편에 해당하므로 UV-irradiation 후 나오는 F1을 충분히 확보하여 다음 세대로 transgene이 전달되는 양상을 관찰하면서 integrated strain을 찾아야 합니다.

주입된 DNA는 선충의 생식세포 전구체에 유입되어 그 다음 세대(F1)에 co-injection marker 표현형이 나타나는데, 이 중 5-10%만 F2 세대로 transgene이 전달됩니다.

F2 이후로부터는 더 안정적으로 transgene이 다음 세대로 전달되므로 F2 이후의 선충들을 사용하면 됩니다.

Expression plasmid는 일반적으로 프로모터::유전자::3’UTR(비번역 영역) 구조로 설계합니다.

예쁜꼬마선충의 경우 보통 pPD95.75와 같은 C. elegans expression vector를 기본 골격으로 사용하며 Addgene에서 구입할 수 있습니다.

DNA 주입은 선충의 생식세포 전구체가 있는 gonad syncytium에 주입하게 됩니다.

이 곳은 세포막이 완전히 닫히지 않은 생식세포 전구체들이 모여있어서 DNA가 세포 안으로 들어가기 용이합니다. Gonad syncytium은 길게 늘어져서 양쪽으로 접혀있는 gonad(생식선)에서 distal부분에 있고 벌집과 같이 핵이 표면에 고르게 분포되어 있는 모양으로 식별합니다.

제대로 주입이 되었으면 용액이 생식선을 따라 퍼지며 생식선이 부푸는 모습을 관찰할 수 있습니다.

미세주입 바늘은 borosilicate glass capillary(유리 모세관)를 needle puller 장비를 이용하여 만듭니다. Needle puller 장비는 열로 유리관 한 가운데를 가열하면서 양쪽으로 당겨 가느다란 바늘을 두 개 뽑아내는 장치입니다.

이러한 needle puller 장비로는 Sutter Instruments P-87이나 P-97, 또는 Narashige사에서 나오는 제품이 있습니다. Sutter Instrument는 전기생리학 실험에 사용하는 microelectrode를 만드는 장비로서 당기는 힘이나 속도를 미세하게 조절할 수 있다는 장점이 있습니다.

Narashige사 제품은 중력으로 당겨 바늘을 만드는 원리로서, 장비가 더 저렴하고 사용법이 간단하다는 장점이 있으나 Sutter Instrument 제품만큼의 미세한 힘조절은 불가능하다는 단점이 있습니다. 자세한 제품 정보나 세팅 등은 reference를 참고하시길 바랍니다.