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  • 내가 관리하고 있는 유전자변형 마우스 중에서 교배용 마우스를 선택해야 한다면 어떤 마우스를 선택하는 것이 좋을까요? 마우스/랫드 형질전환

    [교배 마우스 선별기준]

    - 교배용 마우스는 필요한 유전자변형 형질을 가지고 있는 마우스 중에서 외관상 건강하고 질병이 없으며 암수 개체 크기 차가 크지 않고 체중이 적정한 마우스를 선택하는 것이 좋습니다.
    - 교배용 마우스는 6~8주령 마우스가 적합하며 교배용 마우스를 선택하기 전 신체 검사를 실시하여 털이 뽑히거나 왜소하거나 물린 흔적이 있는 개체, 수두증, 부정교합 등 선천적인 기형이 있거나 음경 포피에 상처가 있는 개체는 제외합니다.
    - 산자 수가 많은 마우스 중에서 교배 마우스를 선택하는 것보다 적정 수준의 산자 중에서 교배용 마우스를 선발하는 것이 좋은데 그 이유는 어미의 모유량이나 영양 성분이 산자 수에 따라 증가하는 것이 아니기 때문에 충분한 모유를 섭취한 개체를 선택하는 것이 좋습니다.
     

    [신체 검진을 통해 교배용 마우스에서 제외해야 할 마우스 기형 사례]

     

    * 그림출처 : Guidebook on Mouse and Rat colony Management, Charles River Laboratory, 2015.

    유사질문
    • 마우스에서 임신이 어려운 선천적 기형 증상이 있을까요?
    References
      1) Charles River Laboratories. Guidebook on Mouse and Rat Colony Management. Charles River Laboratories; 2015.
      2) The Jackson Laboratory. Handbook on Genetically Standardized Mice. 6th ed. The Jackson Laboratory; 2009.
      3) AALAS Learning Library. Colony Management 1: Breeding and Recordkeeping. Accessed July 9, 2025. https://www.aalaslearninglibrary.org/
    Breeder 기형 Vaginal Septum Imperforate Vagina Preputial Injury
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  • 종양이 발생해서 수명이 짧은 유전자변형 마우스의 교배 케이지는 어떻게 관리해야 할까요? 마우스/랫드 형질전환
    - 마우스의 수명은 1.5 ~ 2년이며 임신하고 새끼를 출산할 수 있는 연령은 보통 수컷은 10~12개월까지, 암컷의 경우 6~8개월까지 가능합니다. 하지만 종양이 발생하거나 루게릭병, 헌팅턴병 등의 특징을 나타나는 유전자변형 마우스의 경우 일반 마우스에 비해 수명이 짧거나 어린 나이에 표현형이 나타납니다. 이런 라인들의 경우 라인별 특징에 따른 교배 전략 수립이 필요한데, 종양이 발생하거나 표현형이 발현되는 것으로 알려진 연령 전에 교배 마우스를 교체하거나 육아 능력이 떨어지는 마우스의 경우 수술적 기법을 활용하여 유전자변형 마우스의 난소를 다른 마우스로 이식하고 교배하는 것을 권장하는 경우도 있습니다. 유전자변형 마우스 도입 전 해당 라인에 대한 특징과 권장하는 교배 방법을 미리 숙지해두는 것이 필요합니다.
     
    이외 수명이 짧거나 표현형 관련 문제가 있는 마우스는 Sperm/Embryo Freezing을 통해 해당 라인을 보존하고 필요할 때 복원하는 방법을 사용하는 것이 좋으며 호모형에서 조기 사망하거나 표현형이 발현되어 문제가 되는 라인은 생존성과 번식 능력을 보존하기 위해 Heterozygous 상태로 유지하는 것이 권장됩니다.

     

     

    [교배 마우스 관리에 주의가 필요한 사례 1, (Tumor development : B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J)]

    - 위 마우스는 Trp53 유전자 기능을 잃어 어린 나이에 종양이 발생하는 마우스입니다.  Homozygous 마우스의 경우 대부분 3~6개월 사이 종양 (주로 림프종과 육종)이 발생하는데 특히, 암컷은 수컷에 비해 이유 시기까지 생존율이 현저히 낮다고 알려져 있습니다.  Heterozygous 마우스는 약 10개월경에 종양이 발생합니다.
     
    - 권장 교배 방법은 Heterozygous Female x Homozygous Male이며 Homozygous 암컷의 낮은 생존율과 종양 발생 시기를 고려한 방법입니다.
     

    [교배 마우스 관리에 주의가 필요한 사례 2 (ALS : B6.Cg-Tg(Prnp-TARDBP*A315T)95Balo/J)]

    - 위 마우스는 ALS(루게릭병)이나 유비퀴틴 응집체가 동반된 전측두엽 피질 변성증(FTLD)과 같은 신경근육계 또는 신경퇴행성 질병을 연구하기 유용한 마우스로 Hemizygous 마우스를 구매할 수 있습니다. Hemizygous 수컷의 경우 암컷에 비해 더 짧은 수명을 가지며 약  3.5개월 생존하는데 결장 장신경총 신경이 점진적으로 퇴행되고 이것이 위장 운동 저하로 이어져 폐사에 이르게 됩니다. Hemizygous 암컷의 경우 수명이 5-6개월 정도로 폐사 전 잘 걷지 못하고 다리를 끌거나 체중이 감소하고 의식이 저하되는 것을 관찰할 수 있습니다.                                
     
    - 권장 교배 방법은 Hemizygote x Noncarrier (Colony 중 Wild type or C57BL/6J inbred mice)이며 암수 마우스별 표현형 발현 시기 전 교배용 마우스를 교체하는 것이 필요합니다.
     

    [교배 마우스 관리에 주의가 필요한 사례 3 (Huntington Disease : B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J)]

    - 위 마우스는 인간 헌팅턴병 유전자의 일부를 포함하고 있어 헌팅턴병(HD)의 여러 특징을 모방하는 진행성 신경학적 표현형을 가진 마우스로 Hemizygous 마우스를 구매할 수 있습니다. Hemizygous 암컷의 경우 번식력은 있지만 질병으로 새끼를 돌볼 수 없기에 Hemizygous Female 난소를 건강한 암컷 B6CBAF1에게 이식(Ovarian transplant)하여 교배하는 방법을 권장하며 Hemizygous 수컷의 경우 3~4주 정도에만 교배가 가능하기에 짧은 교배 기간동안 임신을 많이 할 수 있도록 여러 마리 암컷과 동시에 교배하는 방법이 필요합니다.
     
    - 권장 교배 방법은 Ovarian transplant hemizygote female x B6CBAF1/J male이며 B6CBAF1 female X Hemizygous HD62 male (수1: 암2 교배)를 통해서도 교배할 수 있습니다. Hemizygous 암컷의 육아능력과 Hemizygous 수컷의 짧은 교배 가능 기간을 고려한 교배 방법입니다.
    유사질문
    • 루게릭병, 헌팅턴병을 연구할 수 있는 유전자변형 마우스는 표현형 문제로 수명이 짧거나 새끼를 잘 돌보지 못하는데 어떻게 관리해야 할까요?
    References
      1) The Jackson Laboratory. B6.129S2-Trp53<tm1Tyj>/J. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/strain/002101
      2) The Jackson Laboratory. B6.Cg-Tg(Prnp-TARDBP*A315T)95Balo/J. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/strain/010700
      3) The Jackson Laboratory. B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/strain/002810
      4) The Jackson Laboratory. Handbook on Genetically Standardized Mice. 6th ed. The Jackson Laboratory; 2009.
    Breeding Tumor ALS Huntington Disease 생식능력
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  • 형질전환 마우스 colony를 유지하는 과정에서 유전형 분석 결과가 반복적으로 예상과 다르게 나타나는 이유는 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환

    형질전환 마우스 colony를 유지하는 과정에서 유전형 분석 결과가 반복적으로 예상과 다르게 나타나는 현상의 원인은 크게 생물학적, 기술적, 관리적 측면으로 구분할 수 있으며, 각 요인을 이해하고 적절하게 대처하는 것이 colony의 유전적 안정성을 유지하는 데 필수적입니다.

     
     1) 생물학적 요인: Genetic Drift(유전적 부동), Epigenetic Silencing(후성유전적 침묵)
     
    형질전환 마우스 colony를 여러 세대에 걸쳐 유지할 경우, 유전자 구성이 점차 달라지는 Genetic drift가 발생할 수 있습니다. 이는 마우스의 표현형 또는 유전형 분석 결과가 실험실 간 또는 시간 경과에 따라 달라지는 주요 원인 중 하나입니다. Genetic drift는 특히 면역체계와 같은 영역을 연구할 때 표현형에 심각한 차이를 초래할 수 있습니다. Genetic drift를 늦추기 위해서 공급업체들은 마우스 배아를 동결보존하고, 이를 사용하여 기초 colony를 몇 세대마다 교체합니다.

    또한, 형질전환 마우스에서는 transgene이 염색체에 안정적으로 삽입되었더라도 세대를 거치며 점차 발현이 감소하거나 완전히 사라지는 epigenetic silencing 현상이 발생할 수 있습니다. 이는 transgene 삽입 위치의 크로마틴 구조 변화, DNA methylation(DNA 메틸화), histone modification(히스톤 변형) 등에 의해 유도됩니다. 시간이 지남에 따라 silencing은 유전자 발현이 없는 세포 비율 증가의 형태로 나타나며, ON/OFF 상태의 이분화된 분포로 관찰되기도 합니다.

    특히 유전자 회로에서 여러 transgene의 연속적 발현이 필수인 경우, 하나의 유전자라도 silencing되면 전체 회로 기능이 중단될 수 있습니다. 더 나아가, silencing은 인접한 유전자로 전파되어 누적적으로 발현 억제를 일으킬 수 있으며, 이는 실험의 재현성과 유효성에 중대한 영향을 줄 수 있습니다.

     
     2) 기술적 요인: Cre-lox 기반 재조합
     
    일반적으로 Cre 재조합효소는 성체의 특정 세포에서만 발현되도록 설계되지만, 배아 발달 초기 단계 또는 생식세포에서 일시적으로 발현되는 경우가 있습니다. 이러한 발현은 ectopic expression(이소성 발현)이라고도 부릅니다.  매우 소량의 Cre라도 loxP 서열을 인식하여 예기치 않은 재조합을 일으킬 수 있기 때문에, 이러한 재조합을 탐지할 수 있는 실험설계가 필수적입니다.

     

     3) 관리적 요인: 유전형 분석 오류, 서로 다른 라인의 혼입

     

    PCR 분석 시 primer 또는 probe의 낮은 특이도에 따른 유전형 분석 오류가 발생하거나, 서로 다른 삽입 위치 또는 copy number를 가진 독립된 라인이 혼입되었을 경우, 유전형 분석 결과에 혼선을 줄 수 있습니다.

    유사질문
    • 형질전환 마우스 colony의 유전적 안정성을 확보하려면 어떤 요인을 고려해야 하나요?
    References
      1) Zeldovich L. Genetic drift: the ghost in the genome. Lab Anim. 2017;46:255–257.
       
      2) Cabrera A, Edelstein HI, Glykofrydis F, et al. The sound of silence: Transgene silencing in mammalian cell engineering. Cell Syst. 2022;13(12):950–973.
       
      3) Song AJ, Palmiter RD. Detecting and Avoiding Problems When Using the Cre–lox System. Trends Genet. 2018;34(5):333–340.
       
      4) Haruyama N, Cho A, Kulkarni AB. Overview: engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009;Chapter 19:Unit 19.10.

    형질전환 번식 genetic drift epigenetic silencing ectopic expression
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  • 형질전환 마우스의 유전형 분석에서 hemizygote와 homozygote를 어떻게 구분할 수 있나요? 마우스/랫드 형질전환

    형질전환 마우스에서 transgene이 유전되었는지 여부는 conventional PCR만으로도 확인할 수 있으나 hemizygote와 homozygote를 구분하려면 transgene copy 수를 정량적으로 측정할 수 있는 방법이 필요합니다. 일반적으로 real-time PCR 기반의 상대적 정량 분석, Probe/Endpoint 분석법, droplet digital PCR(ddPCR) 등의 기법이 사용됩니다.

     

     - 가장 널리 사용되는 방법은 real-time PCR (qPCR)로, transgene의 증폭 정도를 endogenous single-copy gene(게놈 내에 단일한 복제수로 존재하는 유전자)과 비교하여 상대적인 transgene 양을 산출합니다. Hemizygote는 대조군 대비 1배수, homozygote는 2배수의 발현을 보입니다.
     
     - 또 다른 방법으로는 Probe/Endpoint 분석법이 있습니다. 이 방법은 형질전환 마우스에서 wild-type 대립유전자와 mutant transgene 대립유전자를 동시에 검출할 수 있도록 고안된 fluorescent probe 기반의 PCR 분석법입니다. PCR 증폭 후 각 probe의 형광 세기를 최종 단계에서 측정하여, wild-type 대립유전자는 x축, mutant transgene 대립유전자는  y축에 해당하는 형광값으로 표현합니다. 분석 결과, homozygote는 하나의 축에, heterozygote는 두 probe 모두에 반응하므로 대각선 상에 분포하게 되어, 세 유전형을 명확히 구분할 수 있습니다.
     
    - 보다 높은 정밀도와 민감도를 필요로 하는 경우에는 droplet digital PCR (ddPCR)을 사용할 수 있습니다. ddPCR은 PCR 반응 혼합물을 수천 개의 미세한 droplet으로 나누어 각각 독립적인 PCR 반응을 수행하는 방식으로, 절대적인 transgene copy 수를 정량할 수 있는 것이 특징입니다. 표준곡선이 없어도 정량화가 가능하고, PCR inhibitor의 영향을 덜 받으며, 실험 간 재현성도 높아 형질전환 마우스의 hemizygote와 homozygote를 보다 정확히 구분할 수 있습니다.
    유사질문
    • 형질전환 마우스에서 transgene copy 수를 확인하려면 어떻게 해야 하나요?
    References
      1) The Jackson Laboratory. Hold the Agarose! Advanced PCR Methods for Genotyping Mice. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2015/september/hold-the-agarose-advanced-pcr-methods-for-genotyping-mice
       
      2) Ballester M, Castelló A, Ibáñez E, Sánchez A, Folch JM. Real-time quantitative PCR-based system for determining transgene copy number in transgenic animals. Biotechniques. 2004;37(4):610–613.
       
      3) Nakagaki A, Urakawa A, Hirano S, Anami T, Kishino T. Application of droplet digital PCR in the analysis of genome integration and organization of the transgene in BAC transgenic mice. Sci Rep. 2018;8:6638.
    형질전환 hemizygote homozygote transgene copy
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  • F0 세대 형질전환 마우스에서 유전형 분석이 불확실하거나 자손에게 형질이 유전되지 않는 이유는 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환

    F0 세대 형질전환 마우스에서 유전형 분석이 불확실하거나 자손에게 형질이 유전되지 않는 주요 원인으로는 모자이크 현상 및 germline transmission 실패, 무작위적 transgene 삽입, Transgene silencing, Genotyping 오류 및 F0 위양성 등이 있습니다. 이러한 문제를 방지하기 위해서는 체계적인 founder 마우스 라인 확립 전략을 수립해야 합니다.

     
    1) 모자이크 현상 및 germline transmission(생식세포 전달) 실패

    F0 마우스에서 transgene이 하나의 염색체에 안정적으로 삽입되었다면, 멘델의 법칙에 따라 F1 자손의 약 50%가 해당 유전자를 유전 받아야 합니다. 만약 F1 세대에서 유전 비율이 50%보다 현저히 낮다면, 해당 F0 개체가 모자이크 개체일 가능성이 높습니다. 이는 배아 발생 중 유전자 통합 시점이 늦어 모든 세포에 transgene이 삽입되지 않았기 때문입니다. 모자이크 개체는 생식세포 중 transgene을 포함한 세포의 수에 따라 유전자를 자손에게 아예 전달하지 않거나 매우 낮은 효율로만 전달할 수 있습니다.

     
    2) 무작위적 transgene 삽입

    Transgene은 무작위로 마우스 유전체에 삽입되므로, 기존의 정상 유전자를 방해할 수 있습니다. 이러한 삽입은 haploinsufficiency(반수체 불충분성)로 인해 heterozygous 개체에서도 예상치 못한 표현형을 유발할 수 있습니다. 대부분의 돌연변이에 의한 표현형은 열성이므로, heterozygote를 교배하여 homozygote를 만들어야만 표현형이 확인됩니다. 또한 homozygote는 hemizygote보다 transgene 발현 수준이 더 높을 수 있습니다. 밝혀지지 않은 유전자로 인한 불확실성을 배제하려면, 삽입 위치가 서로 다른 독립적인 마우스 라인 2개 이상을 분석하는 것이 바람직합니다.

     
    3) Transgene silencing(유전자 침묵)

    Transgene silencing은 transgene이 전사 비활성 영역에 삽입될 때 발생합니다. 이 경우 유전자가 유전체 내에 존재하지 않더라도 mRNA 전사가 일어나지 않아 발현이 되지 않습니다.  이러한 전사 비활성 상태는 repressor(억제 인자)가 promoter 주변에 존재할 경우, 발현이 억제된 유전자 안에 삽입되었을 경우, DNA methylation(DNA 메틸화), X-inactivation(X 염색체 불활성화), genomic imprinting(유전체 각인) 등의 epigenetic regulation(후성유전적 조절)에 의해 나타날 수 있습니다.

    이러한 가능성을 줄이기 위해서는 insulator sequence(절연체 서열)를 transgene에 포함시키는 것이 도움이 될 수 있습니다. 반대로, enhancer나 promoter 근처에 유전자가 삽입되면 예상치 못한 조직이나 시점에서 유전자가 비의도적으로 발현되는 leaky expression이 나타나는 경우도 있습니다.

    한편, transgene의 발현은 세대를 거치며 점점 감소하거나 완전히 사라지기도 하는데, 이러한 epigenetic silencing(후성유전적 침묵)은 특히 high copy number를 가진 형질전환 마우스가 나이가 들수록 자주 발생할 수 있습니다.

     
    4) Genotyping(유전형 분석) 오류 및 F0 위양성

    PCR 분석 시 primer 또는 probe의 특이도가 낮을 경우, 위양성 결과가 나올 수 있습니다. 따라서 F0 개체의 유전형을 판별할 때는 Southern blotting을 통한 분석이 권장됩니다.  F0 개체가 전혀 얻어지지 않은 경우, 가장 먼저 고려해야 할 것은 microinjection(미세주입) 과정의 기술적 문제입니다. 삽입된 transgene 자체가 마우스 배아 발달이나 이유기 전 생존에 필수적인 기능을 방해했을 가능성도 있습니다. 이러한 경우에는 실험을 반복하기 전에 해당 transgene의 생물학적 기능 및 구성 요소를 재평가할 필요가 있습니다.

     
    5) 형질전환 founder 마우스 라인 확립 전략

    PCR과 Southern blotting은 transgene 존재 여부를 확인하는 가장 보편적인 분석법입니다. Southern blotting은 위양성 비율이 낮고, copy number 및 flanking fragment(인접 절편) 등 더 많은 정보를 제공하므로 founder 선별 시 권장됩니다. 분석해야 할 F0 개체 수가 많은 경우, 먼저 PCR로 양성 개체를 선별한 후, 소수 샘플에 대해 Southern blotting을 진행해 정확성을 확보할 수 있습니다.

    같은 construct를 사용하더라도 삽입 위치나 copy number에 따라 서로 다른 표현형이 발생할 수 있으므로, 독립된 founder 라인은 혼합되지 않도록 별도 관리해야 합니다. PCR 결과는 동일 transgene에 대해 동일 amplicon(증폭산물)을 생성하기 때문에, 서로 다른 라인이 섞이면 일반적인 PCR로는 구분이 불가능합니다.

    Zygote 주입 후 약 3주 뒤, 잠재적 founder 마우스가 태어나며, 이유 전 genotyping을 통해 유전형을 확인합니다. Founder가 식별되면 생식 능력이 생기는 9주령 이후에 교배가 가능하며, 이로부터 얻어진 F1 자손은 실험에 사용할 수 있는 최초 세대가 됩니다. F1 세대에서는 germline transmission과 transgene copy number를 반드시 검증해야 하며, 같은 founder로부터 나온 F1 개체들이 동일한 copy number와 flanking sequence(인접 서열)를 가졌다면, 해당 개체들 중 어느 한 마우스를 선택해 확립된 단일 라인으로 사용할 수 있습니다.

    유사질문
    • 형질전환 founder 마우스에서 어떤 개체를 교배용으로 선택해야 하나요?
    References
       
      1) Haruyama N, Cho A, Kulkarni AB. Overview: engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009;Chapter 19:Unit 19.10.
       
      2) The Jackson Laboratory. Model Generation Frequently Asked Questions. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://front.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/model-generation-frequently-asked-questions
    형질전환 번식 mosaicism germline transmission transgene silencing
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  • 형질전환마우스 제작의뢰시 off-target mutation 관리는 어떻게 하나요? 마우스/랫드 형질전환
    - Off-target mutation은 의도하지 않은 유전체 부위에서 발생하는 비특이적 유전자 변형을 의미하며, CRISPR/Cas9과 같은 유전자 편집 기술을 사용하는 경우 나타날 수 있습니다. CRISPR/Cas9 시스템에서 Cas9 단백질이 표적 외 유전체 부위에 작용하여 원치 않는 유전체 부위의 절단을 일으키고 예상치 못한 유전적 변이를 초래할 수 있습니다. 이는 실험 결과의 신뢰성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
     
    - 정확한 gRNA 설계: 예측 알고리즘과 딥러닝 모델 등을 통해 guide RNA (gRNA)의 특이성을 최대화하는 것이 설계의 핵심이며, whole genome에서 잠재적 off-target 부위를 정확하게 탐색하고 평가하는 것이 필수적입니다. 최신 연구에서는 Word2Vec 및 CNN 기반 모델들이  높은 정확도로 off-target 예측에 활용되고 있습니다.
     
    - 선별 후 분석과 스크리닝: 제작된 마우스의 whole-genome sequencing 및 PCR 스크리닝으로 off-target site 여부를 확인하여 불필요한 변이가 없는 개체를 선별합니다. 또한, PCR 및 단백질 발현 검사를 통해 잠재적 off-target 후보 부위를 중심으로 실제 유전자 변이 발생 여부를 확인합니다.
     
    - 교배를 통한 off-target 완화: 생산 단계에서 정상마우스와(야생형)와의 반복적인  backcrossing(후대교배)을 통해 off-target 변이를 점진적으로 희석 및 제거하고 교배 세대를 거치면서 유전자 배경이 표준화되어 타겟 변이에 집중할 수 있도록 관리합니다.
     
    - Conditional Knockout (cKO) 기술 활용: 특정 조직이나 시기에만 유전자 기능을 제거하는 조건부 KO 마우스는 Cre-loxP, FLP-FRT 재조합 효소 시스템을 이용하여 필수 유전자의 삭제로 인한 치명적 부작용 없이 gene KO를 유도할 수 있어 더욱 정밀한 유전자 기능 연구와 off-target 최소화가 가능합니다.
    유사질문
    • 형질전환마우스 설계 시 off-target을 최소화하는 방법은 무엇인가요?
    References
      1) A. Imani, J. Valiant and A. A. Santoso Gunawan, "Deep Learning-based Approach on sgRNA off-target Prediction in CRISPR/Cas9," 2023 International Conference on Computer Science, Information Technology and Engineering (ICCoSITE), Jakarta, Indonesia, 2023, pp. 440-444, doi: 10.1109/ICCoSITE57641.2023.10127682.
      2) Lopes R and Prasad MK, Beyond the promise: evaluating and mitigating off-targeteffects in CRISPR gene editing for safer therapeutics. Front. Bioeng. Biotechnol. 11:1339189 (2024), doi: 10.3389/fbioe.2023.1339189
      3) Yang Y. Conditional KO 마우스 제작법과 관련 동향 [Conditional KO mouse generation methods and related trends]. BRIC Bio리포트. Published June 9, 2016. Accessed July 10, 2025. https://www.ibric.org/bric/trend/bio-report.do?mode=view&articleNo=8691839&title=Conditional+KO+마우스+제작법과+관련+동향
      4) Yoshiki, A., Ballard, G. & Perez, A.V. Genetic quality: a complex issue for experimental study reproducibility. Transgenic Res 31, 413–430 (2022), doi.org/10.1007/s11248-022-00314-w
    형질전환마우스 off-target mutation 제작 설계 관리
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  • 형질전환마우스의 유전자 변형이 안정적으로 유지되고 있는지 확인하는 방법에는 무엇이 있나요? 마우스/랫드 형질전환
    - 형질전환마우스의 유전자 변형이 안정적으로 유지되고 있는지 확인하는 방법은 크게 두 가지 관점에서 이루어집니다.
       1) 유전자의 물리적 존재 여부(유전자형 확인)
       2) 유전자의 발현과 기능 확인(표현형 및 기능적 분석)
     
    - 유전자 변형의 안정성 확인은 단일한 방법이 아닌 DNA 수준의 PCR 및 Southern blot, mRNA 수준의 RT-PCR/qPCR, 단백질 수준의 Western bolt/IHC, 구조적・염색체 수준의 FISH, 그리고 세대 간 전달을 평가하는 계통 분석 등 다양한 접근법을 활용하여 상호 보완적으로 확인할 수 있습니다.
     
    -유전자 변형 안정성 평가 주요 방법 요약

    유사질문
    • 형질전환마우스의 품질관리는 어떻게 하나요?
    References
      1) 치매 모델 형질전환 마우스 및 이를 이용한 스크리닝 방법(2016).
      2) Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction (2018).
      3) Generation of single-copy transgenic mouse embryos directly from ES cells by tetraploid embryo complementation (2001).
    형질전환마우스 유전자 변형 안정성 확인 품질관리 검증
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  • 형질전환마우스를 수입/분양 받아 사용할 때 MTA(Material Transfer Agreement)가 반드시 필요한가요? 마우스/랫드 형질전환
    - 네, 필요합니다.
     
    - Material Transfer Agreement (MTA)란 형질전환마우스와 같은 생명과학 연구 재료의 이전 시, 제공자와 수령자 간의 권리･의무 및 사용 조건을 명확히 규정하는 법적 계약입니다. 이 계약은 지적 재산권 보호, 사용 범위 한정, 책임 한계, 안전과 품질 관리의 규율, 그리고 법적 분쟁 예방을 목적으로 전 세계적으로 표준화되어 있는 수단입니다. 실험동물, 특히 형질전환마우스와 같은 유전자변형 동물자원은 지식재산권, 생물안전, 연구 무결성과 직결되기 때문에, 무분별한 이전을 방지하고 연구 목적의 적법성을 담보하기 위해 반드시 명확한 계약 구조가 필요합니다.
     
    - 국내외적으로 형질전환마우스의 수입이나 분양, 심지어 연구기관･기업 간의 이전에도 MTA가 필수적이라는 규정이 존재합니다. 또한, 생물다양성협약(CBD), 나고야 의정서(NP)등 국제 유전자원 이익공유(ABS, Access and Benefit Sharing) 규범에 따라 생물 유전자원 이전 시 법적 및 윤리적 문제 예방을 위해 MTA가 이행계약의 핵심 실질 수단으로 널리 사용되고 있습니다.
     
    - 형질전환마우스의 경우, 국내외 기관 간 연구목적으로의 이전, 국제 공동연구, 신규자원 도입, 산업적 활용 등 거의 모든 이전 거래에서 MTA 작성 및 상호 서명 절차가 요구됩니다.  Addgene등 주요 생물자원 유통 조직, 해외 실험동물 유통 기업, 국내기관 모두 수입/분양 시 MTA 체결을 필수로 하며, 대부분 온라인 또는 서면 방식의 표준 양식[예: UBMTA (Uniform Biological Material Transfer Agreement)] 또는 각 기관별 양식을 활용합니다. 연구재료의 소유권, 허용 용도(연구 한정 사용 여부), 재분배 금지, 결과물 활용 제한, 지식재산권 귀속, 책임 및 면책, 안전관리, 비밀유지조항 등 주요 조항을 반드시 포함합니다.
     
    - MTA는 미국, 유럽, 일본 등은 물론 한국에서도 유전자변형동물의 연구자원 이전에 있어 ‘선결 요건’으로 제도화 되어 있습니다. 한국의 경우 [실험동물 기탁등록보존 및 분양에 관한 규정], [유전자변형생물체 관리], [생명연구자원관리 시행계획] 등 국가 행정령과 가이드라인에서도 분양/수입 시 MTA 필요 여부, 절차 및 세부 양식, 지적재산권･안전 관리 등에 관한 규정이 존재합니다. 그에 따라, 대한민국법상 실험동물 분양/수입/활용 시에는 반드시 법적 절차와 안전, 윤리, 책임 적합성을 입증해야 하며, 이 과정에서 MTA는 행정적 필수 서류입니다.
    유사질문
    • 유전자변형동물을 사용하고자 할 때 연구자가 법적으로 반드시 확인해야 하는 절차는 무엇인가요?
    References
    형질전환마우스 유전자변형동물 수입/분양 물질이전계약서 Material Transfer Agreement (MTA)
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  • 마우스 KO 모델에서 conditional KO과 null(constitutive) KO의 차이점이 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환
    - 마우스 Knock-Out(KO) 모델은 특정 유전자를 제거함으로써 그 기능을 연구할 수 있으며, 크게 전신에서 유전자를 제거하는 Null KO와 특정 조건에서만 제거하는 Conditional KO로 나뉩니다. Null KO는 직접적인 표현형 분석에 적합하지만, 치사 유전자의 경우 활용이 어려우며 Conditional KO는 유전자의 기능을 세포별·시기별로 정밀하게 분석할 수 있어 더 유연한 실험 설계가 가능합니다.
    - Null KO는 배아 발생 초기부터 전신에서 표적 유전자가 제거되는 모델로, homologous recombination 또는 CRISPR/Cas9 기술을 이용해 제작됩니다.
    이 방식은 유전자의 기능을 빠르게 확인할 수 있는 장점이 있으나, 유전자 결실이 배아 치사를 유발하거나 전신에서의 복합적인 효과로 인해 특정 조직의 기능을 분리해서 연구하기 어려운 단점이 있습니다
    - Conditional KO는 유전자의 기능을 특정 조직이나 특정 시점에서만 제거할 수 있도록 설계된 모델입니다.
    가장 대표적인 방식은 Cre-loxP 시스템으로, floxed 유전자를 가진 마우스와 특정 세포 특이적 Cre 발현 마우스를 교배하여 세포 특이적으로 유전자를 제거할 수 있습니다. 예를 들어, Alb-Cre는 간, Nestin-Cre는 신경계 특이적 KO를 유도합니다.
    - 위와 같은 기술을 이용하여, p53 유전자는 종양 억제 유전자로 널리 연구되지만, 전신 p53 KO는 조기 사망을 유발합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 특정 세포(간, 폐, 또는 신경세포)에서만 p53을 삭제하는 conditional KO 모델이 사용됩니다.
    유사질문
    • 마우스 KO의 종류가 있나요? 있다면 무엇인가요?
    References
      1) Hall B, Limaye A, Kulkarni AB. Overview: generation of gene knockout mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009;Chapter 19:Unit 19.12:19.12.1–19.12.17. doi:10.1002/0471143030.cb1912s44
      2) White JK, Gerdin AK, Karp NA, et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 2016;537(7621):508-514. doi:10.1038/nature19356.
      3) Donehower L, Harvey M, Slagle B, et al. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature. 1992;356:215-221. doi:10.1038/356215a0
    Conditional Knock Out mouse Null Knock Out mouse Constitutive Knock Out mouse Conditional KO constitutive KO
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  • 우성 및 반우성 유전자 변형 마우스는 번식은 어떻게 하나요? 마우스/랫드 형질전환
    - 우성(dominant) 유전자와 반우성(semi-dominant) 유전자는 표현형 발현 양상에 따라 구분됩니다. 우성 유전자 마우스는 대부분 heterozygous(+/mut) 상태만으로도 실험이 가능하기 때문에, heterozygous(+/mut)와 wild type(+/+)교배가 일반적이며, 반우성 유전자 마우스는 유전형에 따라 표현형이 달라지므로 동형 접합 개체를 확보하는 heterozygous(+/mut) 끼리의 교배전략이 보편적입니다.
     
    - 우성 유전자란 하나의 대립 유전자만 있어도 완전한 표현형이 발현되는 유전자를 의미합니다. 이 경우 이형 접합(heterozygous) 상태 만으로도 동형 접합(homozygous)과 유사하거나 동일한 표현형이 나타납니다. 따라서, 대부분의 실험이나 colony 유지에서는 +/mut(wildtype/mutant) 개체를 wild type과 교배하여 자손의 절반에서 원하는 유전형을 얻는 방식이 보편적 입니다. 또한, mut/mut 상태의 마우스는 유전자가 과 발현 되거나, 불임, 치사가 나타날 수 있습니다.
     
    - 따라서, 표현형 분석이 필요한 실험에서는 두 유전형을 모두 확보하는 것이 중요하고, 이를 위해 +/mut와 +/mut 교배 전략이 보편적으로 활용 됩니다. 단, mut/mut 개체의 경우 번식력이 떨어질 수 있으므로, 교배 전에 strain 특성을 확인 해야 합니다.
     
    - 따라서, heterozygous(+/mut)와 wild type(+/+)교배가 일반적이며, 반우성 유전자 마우스는 유전형에 따라 표현형이 달라지므로 동형 접합 개체를 확보하는 heterozygous(+/mut) 끼리의 교배전략이 보편적입니다.
    유사질문
    • 우성 형질 마우스의 breeding scheme은 어떻게 설계하나요?
    References
      1) The Jackson Laboratory. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice: A Jackson Laboratory Resource Manual. Bar Harbor, ME: The Jackson Laboratory; 2009
      2) Papaioannou VE, Behringer RR. Phenotypic analysis of dominant mutant effects in mice. Cold Spring Harb Protoc. 2024;2024(1):pdb.over107978. doi:10.1101/pdb.over107978.
    번식 우성 유전자 반우성 유전자 dominant semi-dominant
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