Grip Strength 평가의 목적은 마우스 앞다리의 잡는 힘과 앞다리와 뒷다리의 결합된 잡는 힘을 측정하여 마우스의 근력을 분석하는 것입니다.

1. 앞다리 근력 측정

 1) 오직 앞발로만 격자(Grid)를 잡을 수 있도록 마우스를 격자(Grid)위로 부드럽게 낮춥니다.
 2) 몸통을 수평으로 유지시키고 격자(Grid)에서 발이 풀어질 때까지 일정하게 지속적으로 잡아 당깁니다. (갑자기 세게 잡아당기지 않도록 주의) 
 3) 동물이 격자를 놓았을 때, 동물의 최대 근력치가 화면에 나타납니다. 
 4) 3회 반복하여 평균값을 구하고 몸무게로 보정합니다.

2. 앞다리-뒷다리 근력 측정

 1) 앞발과 뒷발로 동시에 격자를 잡을 수 있도록 마우스를 격자의 꼭대기 위로 부드럽게 낮춥니다.
 2) 몸을 격자에 평행하게 유지시키고 격자에서 완전히 발이 풀어질 때까지 일정하게 지속적으로 잡아 당깁니다. (갑자기 세게 잡아당기지 않도록 주의) 
 3) 동물이 격자를 놓았을 때, 동물의 최대 근력치가 화면에 나타납니다. 
 4) 3회 반복하여 평균값을 구하고 몸무게로 보정합니다.

이 평가는 동물에게 환경적 맥락(Context)과 조건자극(CS, 톤 사운드)을 전기쇼크(US, 가벼운 발 전기충격)와 함께 주어(공포학습), 공포 조건에 대한 학습을 평가하는 검사입니다. 검사는 맥락조건화(Contextual Fear Conditioning)와 단서조건화(Cued Fear Conditioning)로 나누어 평가합니다. 공포 학습 후에, 전기쇼크(US) 없이 환경적 맥락(Context) 혹은 조건자극(CS, 톤 사운드)을 주게 되면, 공포 상태가 움직임이 없는 혹은 감소된 형태로 나타납니다. 움직임이 없는 시간(Freeze Time)은 학습/기억 행동을 평가하는데 사용됩니다.

1. 평가 장비
 1) Fear Conditioning System
   - 챔버(방음상자): 챔버는 shock generator, 카메라, light, 스피커, metal floor grid가 있는 평가용 cage를 포함
   - 바닥이 그리드(Grid)로 구성되어 전기쇼크를 전달할 수 있는 조건화 평가용 cage가 chamber 안에 위치
   - 챔버에는 전기쇼크(US)를 전달하기 위한 장치(Shock Generator)와 조건자극(CS)을 전달할 수 있는 장치(소리자극 전달 스피커) 있음

2. 평가 방법 
 1) DAY 1 (공포 학습)
   - 적응: 120초 → Tone(80dB, 3600Hz): 30초 → Foot Shock(0.6mA): 2초 (tone의 마지막 2초에 같이 자극되어 같이 종료됨) → 30초간 머무른 후, 원래 cage로 위치
 2) DAY 2 (Contextual Fear Conditioning, 맥락 조건화 평가): 마우스 조건화 상자에 둔 상태에서 소리 자극을 제시하지 않고 동결 반응을 측정하여 장소에 대한 공포 기억 평가
 3) DAY 3 (Cued Fear Conditioning, 단서 조건화 평가): 장소에 대한 공포 기억의 요소를 제거하기 위해, 새로운 환경이 조성된 챔버에 동물을 넣고, 소리 자극을 제시하여 나타나는 동결 반응을 측정

일반적인 활동 수준, 총 운동활동 및 탐색습관을 결정하는 데 사용되는 간단한 감각 운동 테스트입니다. 이를 통해 불안 정도와 탐험 욕구를 평가할 수 있습니다. 마우스가 open field arena에서 중앙(불안한 위치)보다는 주변 부위에서 더 많은 시간을 보내며 자신을 보호하려는 본능에 기반하여 평가합니다.
 

1. 평가 장비
  1) arena
     크기: 44.5 x 44.5 cm , 장비 사양에 따라 activity 센터 부착 
  2) 장비 자체 기록 혹은 video tracking system을 이용한 움직임 기록
 

2. 평가 방법
   실험을 수행하는 마우스를 arena 내의 center 앞의 periphery 영역에 마주보게 놓은 후, 20분간 움직임을 기록합니다. 기록된 영상을 통해 중심부 및 주변부에 따른 이동거리, 이동시간, rearing 등을 측정할 수 있습니다. 

Rotarod 평가는 마우스에서 운동 조화를 평가하기 위하여 사용됩니다. 마우스는 돌아가는 막대기(Rod) 위에서 균형을 유지해야만 합니다. 일정한 속도(10rpm)로 유지되거나 계속적으로 가속(4-40rpm)되며 돌아가는 막대기에서 마우스가 떨어질 때까지 걸리는 시간(Latency Time)을 측정합니다.

- 가속도 평가: 3일 동안 3개 set의 실험을 연속으로 진행

* Accelerating Rota Rod with Touchscreen: Model No.LE8505 (Harvard Apparatus, USA)

Y Maze Spontaneous Alternation는 마우스가 새로운 환경을 탐험하려는 의지를 측정하는 행동평가 방법입니다. 마우스는 일반적으로 이전에 방문한 곳으로 돌아가는 것보다 새로운 공간을 탐험하는 것을 선호합니다. Hippocampus, septum, basal forebrain, prefrontal cortex 등 뇌의 많은 부분이 이 작업에 관여합니다.
  

1. 평가 장비
  1) Y자 모양의 미로
    - 총 3개의 동일한 통로가 각각 120°각도를 이루며 위치해 있음 (통로 규격: 35cm[길이] X 5cm[넓이] X 10cm[높이])
    - 흰색 (검정색 계통 마우스에 사용), 검정색 (흰색 계통 마우스에 사용)
  2) Video Tracking System
    - 카메라는 천장에 달려 있고, 컴퓨터에 연결되어 프로그램을 이용해서 조절, 촬영 후 분석

2. 평가 방법
  1) 동물을 행동평가실로 이동시킨 후 실험실 환경에 두어 30분간 적응, 행동 평가실의 조도는 가장 어둡게 설정
  2) Y자형 아크릴 미로의 경우, 평가하는 마우스 계통의 색상과 대비되는 색상을 선택 (흰색: 검정색 계통 마우스에 사용, 검정색: 흰색 계통 마우스에 사용)
  3) 마우스의 꼬리를 잡아 cage에서 꺼낸 후, 마우스를 하나의 arm 통로 끝 벽을 보도록 위치
  4) 8분(실험설정에 따라 변경 가능) 간 마우스가 Y자형 미로를 자유롭게 이동할 수 있도록 하며 측정

3. 평가 분석
 - 미로 중앙으로 들어간 후, 동물은 세 개의 통로을 자유롭게 탐색할 수 있는데 진행하는 동안 마우스는 최근에 방문 하지 않은 통로(새로운 통로)에 들어가는 경향을 보여야 합니다. 이 테스트는 형질전환 마우스의 인지 결핍을 정량화하고 평가하는데 사용됩니다.
 

접촉성 피부염 유발 마우스 모델, mouse ear swelling test, local lymph node assay 등에서는 마우스의 귀 두께를 측정하여 귀 부종의 정도를 측정합니다.
마우스의 귀 두께 측정 방법은 다음과 같습니다. 
 

1. 마우스의 귀 두께 측정 시, 마우스를 보정하는 사람과 두께를 측정하는 실험자 총 2인이 필요하며 두께측정기 (예: 디지털 마이크로미터 또는 피코크 다이얼 두께 측정기)와 핀셋을 준비한다.
2. 보정하는 사람이 마우스를 한손으로 보정한 후 다른 한손으로는 핀셋을 이용하여 측정하고자 하는 쪽의 마우스의 귓바퀴를 잡아 접힌 귀를 펼쳐준다. (이때, 마우스의 귀는 쉽게 발적 등이 나타나기 때문에 핀셋을 이용하여 조심스럽게 잡아준다.)
3. 두께를 측정하는 실험자가 두께측정기를 이용해 마우스 귀의 평평한 부분을 3회 이상 측정한다. 귀가 접힌 채로 측정되는 경우가 있으므로 주의하며 측정한다.

골수는 젤라틴 같은 부드러운 조직으로 뼈의 빈 공간의 중심에 위치하며 혈액 세포를 만드는 조혈모세포를 포함하는 면역 시스템의 중요한 구성요소 중 하나입니다. 골수의 경우, 설치류 등 작은 실험동물에서는 조혈기능이 활성화된 골수를 가진 뼈(흉골, 늑골, 상완골, 대퇴골 등)에서 채취할 수 있으며 그 중 대퇴골(femur)과 흉골(sternum)이 골수를 추출하기에 좋은 부위입니다.
살아있는 동물의 골수 채취는 거의 요구되지 않으며 개와 같은 큰 실험동물에서만 고려됩니다.
안락사 이후 빠르게 골수의 응고가 시작되고 골수세포들의 자가융해 과정이 시작되기 때문에 안락사 이후 5분 이내에 골수를 얻는 것이 세포형태학상으로 최적으로 여겨집니다.
 

[골수채취 방법: 대퇴골(Femur), 경골(Tibia)]

- 적절한 방법으로 안락사 된 마우스를 앙아위로 눕힌 다음 피부를 에탄올로 소독합니다. 피부를 제거하여 뒷다리를 노출시킨 후, 뒷다리의 기저부에 있는 주요 근육을 제거하여 고관절을 노출시켜 기저부 주위의 대퇴골을 자릅니다. 발뒤꿈치의 아킬레스건을 자르고 경골 주위에 있는 주요 근육들을 제거합니다. 대퇴골 주위에 있는 주요 근육들을 제거한 뒤 무릎관절을 자릅니다. 경골 주위에 있는 주요 근육들을 제거하고 비골(fibula)을 제거합니다.
- 대퇴골과 경골의 골단(epiphyses)을 제거한 후 23G의 주사바늘을 꽂아 골수에 접근할 수 있도록 합니다. 
- 뼈 하나당 대략 2-3mL PBS를 천천히 주입하여 골수가 반대쪽 말단에 씻겨 나오게끔 합니다. 같은 과정을 반대쪽 다리에도 진행합니다.

피하이식 모델 뿐 아니라 동소이식 모델,  전이성 종양 모델 등이 최근 많이 활용되고 있습니다. 이러한 종양 실험의 경우 동물에게 심각한 고통과 스트레스를 야기하므로 인도적인 실험종료의 기준을 준수하는 것이 중요하며, 근거로 활용할 인도적인 실험종료의 기준이 명확하지 않을 경우 연구자는 pilot study를 통해 각 실험에 대한 기준을 미리 설정하는 작업이 필요합니다. 외관상 종양사이즈를 확인할 수 없는 경우에는 영상 자료를 활용하는 것이 도움이 될 수 있습니다(Optical Imaging, MRI 등).

어떤 경우라도 동물이 빈사상태로 방치되거나 동물의 죽음 그 자체가 실험종료의 기준이 되지 않도록 반드시 연구자가 개입하여 그 전에 인도적으로 실험을 종료해야 합니다.
※ 빈사상태(moribund) : 자극에 대한 반응이 없고 호흡곤란, 저체온증, 웅크림 등을 동반함. 빈사상태의 동물은 실제적으로 혼수상태로 사망에 임박함.

아래의 종양사이즈나 동물의 건강상태 등에 대한 지표(Body Condition Scoring 등)를 활용하되 실제적인 적용에 대해서는 기관의 IACUC 및 전임 수의사와 논의하여 진행하시기 바랍니다.

[종양 연구에서의 가이드라인 (동물실험계획서 심의 가이드라인, 2020: 농림부/한국실험동물수의사회 공동발간)]

1. 모든 종양 연구에서 동물의 잠재적 통증 및 고통이 최소화될 수 있게 종료시점을 선정함
2. 일반적 종양 실험 시, 종양의 무게가 체중의 5%를 초과하는 안됨 (예: 25g 마우스에서 17mm, 250g 랫드에서 35mm 정도 피하종양까지 허용)
3. 종료시점
  - 종양이 정상 신체 기능을 방해하거나 종양 부위에 통증 및 고통을 유발하는 경우
  - 정상동물 체중과 비교하여 20% 체중 감소한 경우 등 (종양의 무게 고려 필요, 예를 들어 다량의 복수가 발생하는 종양모델의 경우 오히려 체중이 증가하기도 함)
  - 종양부위의 궤양 및 감염
  - 종양 주위 조직 침윤
  - 영구적 상처 유발

[Endpoints in Animal Study Proposals 중에서 (미국 국립암연구소)]

1. Either a primary tumor size (subcutaneous: 20mm in diameter for a mouse and 40mm in diameter for a rat; intramuscular: 5mm in diameter for a mouse) or weight (4,000mg maximum weight for a mouse and 8,000mg maximum weight for a rat). Formulas for calculating tumor size can be found in the literature (see tumor size references). Justification to exceed this size restriction must be approved by the NCI at Frederick ACUC in advance. 
2. Tumors that ulcerate, become necrotic or infected. 
3. Palpation of tumor induces a pain response (vocalization, flinching, withdrawal). 
4. Tumors that interfere with the ability to eat, drink, or ambulate.

일반적으로 Sentinel Animal(공시동물)을 사용하여 미생물 모니터링이 시행되었으나 최근에는 분자진단기술의 진화로 공시동물의 사용없이 동물실험시설의 환경검체를 이용하는 미생물 모니터링 방법이 사용되고 있습니다.
 

1. 시료 채취 방법

  1) 공시동물이 없는 soiled bedding 수집 : cage 안에 면봉이나 필터를 넣고 흔들거나 저어서 수집
  2) 배기된 먼지를 포집할 수 있는 사육장비 전용의 장치 사용
  3) 직접 먼지 포집 : 면봉 등을 이용하여 배기구, cage 내부 표면 등의 먼지를 포집
  4) 이 외 직접 검체 채취 : 비침습적인 방법으로 동물의 분변, 털, 구강샘플 채취 

2. 장점

  1) 기존의 soiled bedding 수집에 할애되는 노동력/시간 및 동물구매 관련 예산 절감
  2) 효율성과 민감성이 높은 PCR 방법으로 검사 진행
  3) 공시동물을 대체하는 방법으로 동물의 희생을 줄일 수 있으므로 3R 원칙에 부합
 

3. 고려사항

  1) 검사법의 특성상 민감도와 특이도가 높아 시료 채취 및 검사 전까지 검체 보관을 적절하게 해야 위양성 및 위음성 결과를 줄일 수 있음
  2) 동물사육실의 정확한 감염여부를 확인하기 위해서는 직접 실험동물을 검사하는 방법과 병용하는 것이 필요함
  3) 다양한 병원체에 대한 감염 여부를 확인할 수 있는 검사기관에 의뢰하는 것을 권장
 

1. 복강으로 주사마취제 치사량을 투여하여 심마취를 시행한 후, 동물을 앙와위 자세로 고정한다.
2. 목 부위를 70% 알코올로 소독한 후 scalpel로 기관부위의 피부절개를 시행한다.
3. 피부아래의 침샘을 노출시킨 후 침샘과 흉골설골근을 분리하고 기관 주위의 근육을 절개하여 조심스럽게 기관을 노출시킨다.
4. 기관 아래쪽에 봉합사(cotton 혹은 nylon)를 위치시킨다. 
5. 노출된 기관의 중앙부에 26G needle로 조심스럽게 구멍을 내는데, 이 때 기관에 다른 손상이 가지 않도록 주의한다. 
6. 구멍에 폐 방향으로 catheter를 0.5cm정도 넣는다. catheter를 과도하게 밀어넣으면 폐조직 손상을 유발할 수 있다.
7. 4의 봉합사를 이용하여 catheter가 기관 안에 고정되도록 단단히 묶어준다. 이 때 확실히 묶지 않으면 이후에 주사되는 buffer가 폐 안으로 들어가지 않는다.
8. Prewarmed-PBS 또는 0.1-5mM의 EDTA가 추가된 PBS 1ml을 주사기를 통해 천천히 주입한다.
9. 주입된 buffer를 다시 천천히 회수하여 BALF를 모집하고 해당 과정을 약 3-5회 충분히 반복한다.
10. 모집된 세포는 centrifuge하여 상층액과 세포 pellet을 각각 모은 후 culture 또는 FACS, RT-PCR 및 ELISA 등의 방식을 사용해 분석한다.

* 그림출처: Sun F et al. Murine Bronchoalveolar Lavage. Bio Protoc. 2017;7(10):e2287.

※ 성공적인 BALF 채취를 위해서는 동물의 마취가 중요한데 Pentobarbital과 같은 Barbiturate가 진정과 호흡억제 효과가 있어 선호되며 Isoflurane 및 Ketaimine 등이 사용될 수 있습니다.
 그러나 CO₂는 lung permeability를 증가시켜 출혈을 유발하므로 BALF 세포 상태 및 결과에 영향을 줄 수 있어 사용해서는 안됩니다.