[Retro-orbital Injection의 유용성]
Adult 및 neonatal rat에서 어려운 미정맥 주사 대신 쉽고 빠르게 재현 가능한 투여 방법입니다. 단, neonatal rat에서 생후 2일 이상 되었을 때는 피부가 어두워지고 정맥이 보이지 않게 되어 투여가 어렵습니다. 

[Adult 랫드에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 27G(Gauge)정도의 작은 바늘로 최대 0.15 ml 투여 가능합니다.
2. 호흡마취 하고 횡와위자세로 눕힌 후 점안마취제인 proparacaine을 점안하고 최소 30초 동안 둡니다 (그림 1). 
3. 안구가 조금 튀어나오도록 보정합니다.
4. 눈 표면을 손상시키지 않도록 아래로 비스듬히 바늘을 내안각 (medial canthus)쪽으로 45° 각도로 삽입합니다. 이 때 안구와 안와 뼈 사이로 삽입합니다 (그림 2). 
5. 바늘 끝이 눈 밑부분에 올 때까지 안구 가장자리를 따라 바늘을 접근합니다.
6. 흡인 없이 부드럽게 주사하고 바늘을 천천히 뺍니다.

그림 1. Adult Rat에서 점안 마취 예시 사진

* 그림출처: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

그림 2. Adult Rat에서 Retro-orbital Injection 예시 사진

* 그림출처: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

[Neonatal Rat에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 29-31G 바늘로 g당 최대 5μL를 투여 가능합니다.
2. 오른손잡이의 경우, 평평한 표면에 좌측 횡와위자세로 눕히고 호흡마취 합니다 (단, 호흡마취 장비가 눈꺼풀과 눈물관 부위를 가려서는 안됨).
3. Paw withdrawal reflex를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 
4. 머리 아래에 광원을 사용하여 정맥동을 쉽게 볼 수 있도록 하고 바늘을 eye socket(내안각: Medial Canthus와 동일)에 바늘사면을 아래로 향하게 하여 40°의 각도로 삽입합니다 (그림 3). 
5. 바늘의 1/3을 eye orbit 뒤쪽에 위치한 retro-orbital sinus 부위로 2mm정도 밀어 넣습니다.
6. 흡인 없이 부드럽게 주사하고 역류를 방지하게 위해 잠시 기다렸다가 바늘을 천천히 뺍니다.
7. 투명한 용액을 주사 하였을 때는 정맥이 잠시 투명해져야 합니다. 만약 주사 후 눈이 부어 오르면 바늘이 정맥에 삽입되지 않았음을 의미합니다. Neonatal 두개골은 매우 부드러워서 바늘이 두개골을 뚫으면 용액이 수막이나 뇌실질에 들어갈 수 있습니다.
8. 랫드를 보온 장치에 올려놓아 체온을 유지하면서 회복시킵니다.
9. 어미에게 새끼를 돌려보내기전에 통증 반응이 있는지 확인합니다. 
10. 오염을 피하기 위하여 각 동물마다 새로운 멸균 주사기를 사용합니다.

그림 3. Neonatal Rat에서 Retro-orbital Injection 예시 사진

* 그림출처: Rocha-Ferreira E et al. J Vis Exp. 2024;(204):10.3791/65386.

[Retro-orbital Injection의 유용성]
Adult 및 neonatal mouse에서 어려운 미정맥 주사 대신 쉽고 빠르게 재현 가능한 투여 방법입니다. 또한 미정맥 주사보다 스트레스가 덜 할 수 있습니다.

[Adult Mouse에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 27.5G(Gauge) 이하, 0.5cm 바늘 길이의 인슐린 주사기 또는 27G이하, 0.5cm 바늘 길이의 Tuberculin 주사기를 준비합니다.
2. 오른손잡이로 예를 들면 마우스를 마취 후 좌측 측와위로 눕히고 눈의 등쪽과 배쪽 피부에 가벼운 압력을 가하여 마우스의 안구를 돌출 시킵니다. 이 때 호흡에 방해되도록 강하게 압박하지는 않습니다 (그림 1). 
3. 진통을 위하여 0.5% proparacaine을 점안하고 바늘을 30°의 각도로 바늘사면을 아래로 향하게 하여 내안각(Medial Canthus)쪽으로 삽입합니다 (그림 2). 
4. 안구 가장자리를 따라 아래로 진행하여 눈의 바닥에 도달할 때까지 진행합니다. 주사 전 흡인하지 않고 부드럽게 투여합니다. 
5. 부드럽고 천천히 바늘을 뺍니다. 이 때 출혈이 거의 없거나 전혀 없어야 합니다.

그림 1. Retro-orbital Injection 투여 예시 

* 그림출처: Yardeni T et al. Lab Anim (NY). 2011;40(5):155-160.

그림 2. Retro-orbital Injection 투여 모식도

* 그림출처: Yardeni T et al. Lab Anim (NY). 2011;40(5):155-160.

[Neonatal Mouse에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 생후 1-2일령 마우스에 이 투여 방법을 사용할 수 있습니다.
2. 보온 장치와 부드러운 거즈가 포함된 nesting이 있는 작은 용기에 neonatal mouse를 넣고 거즈 패드를 덮어 더 따뜻하게 해 줍니다.
3. 31G, 0.3125 inch 바늘길이의 0.3ml 인슐린 주사기를 사용합니다.
4. 마취는 하지 않고, 해부현미경(8-10배 확대면 충분)을 사용합니다.
5. Adult mouse와 마찬가지로 오른손잡이라면 neonatal mouse를 좌측 측와위로 눕히고 엄지와 검지손가락 끝으로 머리를 고정합니다. 호흡을 방해하지 않도록 너무 강하게 압박하지 않습니다. Neonatal mouse의 나머지 몸은 엄지와 검지손가락사이에 자리잡습니다 (그림 3). 
6. 멸균식염수와 면봉을 사용하여 눈위를 부드럽게 닦고(너무 적시면 저체온증의 위험이 있음) 바늘 사면을 아래로 향하게 하여 3시 위치에서 내안각(Medial Canthus)이 될 부위인 eye socket에 약 30°의 각도로 삽입합니다 (그림 3).
7. 부드럽게 투여를 하고 천천히 바늘을 빼내고 neonatal mouse를 보온이 되는 다른 용기에 놓습니다.

그림 3. Neonatal mouse에 대한 Retro-orbital Injection 투여 예시

* 그림출처: Yardeni T et al. Lab Anim (NY). 2011;40(5):155-160.

[절차]
비강내 투여를 실시할 경우 동물을 마취한 후 비강부위가 잘 보일수 있게 적절한 보정을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 투여시 동물의 비강 크기에 맞는 적절한 피펫과 팁이 필요합니다.

한 손으로 두부를 감싸듯이 보정하여 코끝이 하늘을 향하도록(약 45º) 하고, 투여를 용이하게 하기 위하여 투여 되는 한쪽 외비강을 비스듬히 위치합니다. 투여되는 외비강에 피펫을 이용하여 조심스럽게  한 방울 씩 떨어트려 들숨에 흡입할 수 있도록 합니다. 마취에서 회복하기 전 동물이 정상적으로 호흡하는지 관찰합니다.

* 그림출처: Krishnan JKS et al. J Neurosci Methods. 2017;286:16-21.

[주의사항]
랫드에서 권장하는 비강투여 약물의 최대 투여액량(Volume)은 0.1mL 입니다. 약물이 도달할 표적 부위에 따라 투여액량을 결정합니다. 상부호흡기계 또는 중추신경계가 표적인 경우 적은 양(~5μL), 하부 호흡기계가 표적인 경우에는 더 많은 양(예: 30~50μL)을 투여합니다.

[절차]
비강내 투여를 실시할 경우 동물을 마취한 후 비강부위가 잘 보일수 있게 적절한 보정을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 투여시 동물의 비강 크기에 맞는 적절한 피펫과 팁이 필요합니다. 

한 손으로 두부를 감싸듯이 보정하여 코끝이 하늘을 향하도록(약 45º) 하고, 투여를 용이하게 하기 위하여 투여되는 한쪽 외비강을 비스듬히 위치합니다. 투여되는 외비강에 피펫을 이용하여 조심스럽게  한 방울 씩 떨어트려 들숨에 흡입할 수 있도록 합니다. 마취에서 회복하기 전 동물이 정상적으로 호흡하는지 관찰합니다.

* 그림출처: Eyme KM et al. STAR Protoc. 2021;2(1):100290.

[주의사항]
성체 마우스에서 권장하는 비강투여 약물의 최대 투여액량(Volume)은 <0.05mL 입니다. 약물이 도달할 표적 부위에 따라 투여액량을 결정합니다. 상부호흡기계 또는 중추신경계가 표적인 경우 적은 투여액량(~5μL), 하부 호흡기계가 표적인 경우에는 더 많은 투여액량(예, 30~50μL)을 투여합니다.
 

[척수강 내 투여(Intrathecal Injection) 이란?]
중추신경계에 치료제를 전달하는 것은 혈액-뇌 장벽(BBB)과 혈액-척수 장벽때문에 어렵습니다. 이를 극복하기 위해 척수강 내 경로를 활용합니다. 척수관(Spinal Canal) 이나 거미막하 공간(Subarachnoid Space)을 통해 뇌척수액에 도달하도록 하는 투여방법입니다. 이 투여방법은 마취, 화학 요법, 통증 관리, 약물 전달에 활용할 수 있습니다.

* 그림출처: Rahman MM et al. Biomedicines. 2023;11(5):1413.

[방법]
1. 마취한 랫드의 요천추부위에 제모를 한 후 클로로헥시딘과 70% 알코올로 3회 소독합니다. 
2. 그림처럼 흉골을 바닥에 대고 엎드린 자세로 뒷다리를 복부 아래로 가져와 요천추 부위를 아치형으로 만듭니다.

* 그림출처: Thomas A et al. PLoS One. 2016;11(10):e0163909.

3. 25G 피하주사바늘과(Hypodermic Needle) 인슐린 주사기 (0.5ml)를 이용하여 마지막 요추(L6)와 첫번째 천추(S) 사이에 15-30°로 투여합니다. (그림에서 Cx: coccygeal vertebrae, L5: fifth lumbar verterbrae, L6: sixth lumbar vertebrae, S: sacrum. *: injection site (L6-S1))
4. 투여 전 주사바늘 허브(Needle Hub)에 뇌척수액이 존재하거나 투여 중 꼬리가 꿈틀거리면 성공적으로 투여가 되었다는 징후입니다. 
5. 이러한 징후가 나타나지 않거나 주사 전 바늘 허브에 혈액이 보이면 바늘을 빼고 다른 멸균 바늘을 사용하여 다시 수행합니다.  

[랫드 종류에 따른 투여 위치와 용량]
랫드에 따라 문헌에서는 투여치와 투여량이 다릅니다. 아래의 표를 참고하여 활용하시기 바랍니다. 

[방법] 

1. 마취된 마우스의 꼬리 밑에서 시작하여 약 3x3cm 범위로 털을 면도합니다. 
2. 면도한 부위를 5–10% 포비돈-아이오딘 용액으로 소독한 후, 70% 에탄올로 닦아냅니다. 이 과정을 3번 반복합니다.
3. 마우스의 복부 아래에 15mL cornical tube를 놓아 주사 바늘이 경막 내 공간에 접근할 수 있도록 척추간 인대(Interspinous Ligament)의 넓은 영역을 노출될 수 있도록 합니다 (그림 1B).
4. 근육과 엉덩이뼈의 경계에서 형성된 두 개의 홈을 찾아 장골능(Iliac Crest)을 찾습니다. 장골능(Iliac Crest)에 가장 돌출된 척수 돌기를 식별하여 L6 위치를 찾습니다. 이 위치가 척수가 끝나는 부위이기 때문에 투여 시 척수 손상이 가능성이 적습니다. 
5. 해밀턴 주사기에 투여물질(5–10μL)을 준비하여 주입합니다. 동일한 주사기를 여러 동물에 사용할 수 있지만 교차 오염을 방지하기 위해 투여물질별로 하나의 주사기만 사용해야 합니다. 
6. 그림 1C처럼 엉덩이 위쪽을 꼬집어 잡듯이 잡고(Pinching) 꼬리가 보일 수 있도록 합니다. 
7. 주사 바늘을 L5와 L6 척추 사이의 홈에 약 30° 각도로 삽입하여 깊이 약 0.5cm 정도까지 넣습니다 (그림 1D). 
8. 주사 바늘이 경막 내 공간에 성공적으로 들어가면 쥐의 꼬리가 움직이거나 "튀는" 반응이 관찰됩니다. 
9. 꼬리의 움직임을 관찰한 후, 투여물질을 천천히 지속적으로 주사합니다. 바늘을 조심스럽게 제거하고 주사 부위에 역류가 있는지 확인합니다.

그림 1. Intrathecal Injection 방법

* 그림 출처: Kennedy Z et al. Methods Mol Biol. 2022;2434:345-353.

[마우스에 따른 투여 위치와 용량]

마우스에 따라 문헌에서는 투여치와 투여량이 다릅니다. 아래의 표를 참고하여 활용하시기 바랍니다. 

* 표 출처: Rahman MM et al. Biomedicines. 2023;11(5):1413.

기도 내 투여는 랫드가 마취된 상태에서 몸부림이나 재채기 등의 반사를 최소화하여 진행합니다.

1. 랫드를 주사마취하여 기도 투여 보정 장치에 안전하게 위치시킨다.
2. 보정 장치 와이어에 위쪽 앞니를 걸고 포셉으로 혀를 부드럽게 견인하여 기도를 확보한다.
3. 광원을 이용하여 랫드의 인후두 부위를 비춰서 해부학적 구조물을 확인한다.
4. 광원을 통해 성대 사이에 기도 개구부를 찾아서 카테터를 조심해서 주입한다.
5. 주입된 카테터를 통해 pipette tip 또는 주사기를 연결해 약물을 주사한다.
6. 약물 주입 후 카테터를 제거하고 랫드를 cage로 옮겨서 마취에서 회복되는지 확인한다.

기도 내 투여는 마우스가 마취된 상태에서 몸부림이나 재채기 등의 반사를 최소화하여 진행합니다.

[기도 내 투여 실험 절차]

1. 마우스를 마취하여 기도 투여 보정 장치에 안전하게 위치시킨다.
2. 보정 장치 와이어에 위쪽 앞니를 걸고 포셉으로 혀를 부드럽게 견인하여 기도를 확보한다.
3. 광원을 이용하여 마우스의 인후두 부위를 비춰서 해부학적 구조물을 확인한다.
4. 광원을 통해 성대 사이에 기도 개구부를 찾아서 해밀턴 주사기 바늘을 조심해서 주입한다.
5. 해밀턴 주사기의 약물을 주사한다.
6. 주사 후 바늘을 빼고 마우스를 cage로 옮겨서 마취에서 회복되는지 확인한다.

관절염을 유발하는 동물실험에서 마우스 무릎 관절에 치료를 위한 세포나 물질을 직접 적용하기 위해 관절강 내 투여 방법이 시행되며, 모든 절차는 IACUC의 승인을 받아야 합니다.

무릎관절에 물질을 투여하기 위해 외과적으로 피부 절개 후 관절에 접근하는 방법과 피부절개 없이 주사바늘을 이용하여 직접 주입하는 방법을 모두 사용하고 있습니다. 1회 투여량은 10ul 이하를 권장하며 투여하는 세포의 양이 더 중요한 변수입니다. 

[방법]

1. 동물을 심마취하고 투여부위인 무릎을 제모하고 소독한다.
2. 다리를 구부려 무릎 관절을 확인한다. 슬개골(Patella) 연골을 먼저 확인한 후 바로 아래 경골 고원(Tibial Plateau)을 확인한다. 
3. 슬개골과 경골고원 사이의 공간을 향해 피부면과 수직이 되도록 주사바늘을 진입시킨다.   
4. 투여물질을 직접 투여하거나 피부를 절개하여 관절강을 육안으로 확인한 후 주사침으로 주입한다.

그림 1. 투여부위

그림 2. 피부절개 투여법

그림 3. 비절개 투여법

여러 투여법 중 비교적 드물게 사용하는 방법이지만 랫드에서 피내투여 방법을 시행할 수 있습니다. 피내투여를 선택한 목적 및 적절한 절차에 대해서 IACUC의 승인을 받아야 합니다. 

마취 없이 시행할 경우, 주사침에 찔리거나 랫드에게 물리는 사고가 빈번한 절차이므로 주의해야 합니다. 마취는 회복이 빠른 호흡마취가 적절합니다. 투여물질이 유출되어 연구자에게 튀는 위험이 있으므로 보호안경, 안면보호구를 착용하는 것이 좋습니다. 투여물질의 MSDS에 대해 숙지해야 합니다. 1회 투여시 0.05-0.1ml 이하의 투여량이 적절하며 최대 6 부위(Site)에 주입하는 것을 권장합니다.

[투여경로별 투여 적정량과 주사침 게이지: NIH]

[방법]

* 그림 출처: Queen's University. University Animal Care Committee Standard Operating Procedure; SOP 10.9 - Intradermal Injection in Rats.

1. 모든 동물에게 새 멸균 주사침으로 투여를 진행하며, 다른 동물에게 사용한 주사침을 재활용하지 않습니다.
2. 보정틀을 이용하거나 마취를 시행합니다.
3. 포셉 또는 손으로 투여부위를 잘 잡아 투여 부위를 확보하고 주사바늘을 30° 이하의 각도로 피부 1mm깊이로 피내에 찔러 넣은 뒤 앞쪽으로 3-4mm 정도 피부와 수평하게 피내에 밀어 넣습니다. 
4. 바늘이 반대편으로 나오거나 피하로 진입하지 않도록 주의하며 천천히 주입합니다. 투여액의 양만큼 볼록하게 피부텐트(Tent)가 생기는 것을 확인하며 주사침을 바로 빼지 않고 5초 정도 유지한 후 제거합니다. 주사부위로 투여액이 누출되는지 확인합니다.
5. 귓바퀴에 투여할 경우 염색액을 사용하여 주입여부를 확인하는 방법도 사용됩니다.