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  • 418 형질전환 마우스에서 Backcrossing은 무엇이고 어떻게 하는 것인가요? 마우스/랫드 형질전환

    [Backcrossing]

     
    - Backcrossing(역교배)은 형질전환 마우스를 원하는 유전적 배경(inbred strain)으로  만들거나, 유전자 좌위(mapping)를 확인하기 위해 사용하는 2세대 유전 교배 전략입니다.
     
    - 형질전환 마우스는 보통 혼합된 유전적 배경(mixed background)을 갖기 때문에, 이를 일정한 유전적 배경으로 만들기 위해 여러 세대에 걸쳐 근교계 마우스와 반복 교배가 필요합니다.

     

    [Backcrossing 방법]

     
    - 1단계: 형질전환 마우스 생성, 무작위 삽입(transgene insertion) 혹은 특정 좌위 삽입(KI/KO 등) 후, 형질전환 마우스(Tg/+, KO/+)를 제작합니다.
     
    - 2단계: Backcrossing 시작

    형질전환 마우스를 원하는 Inbred strain(C57BL/6, BALB/c 등)과 교배합니다.

    예시: 형질전환 마우스(Tg/+) × C57BL/6 → F1 세대 (50% C57BL/6)

     
    - 3단계: 반복적 Backcrossing 실시

    매 세대마다 형질전환 개체를 선별해 원래 근교계 마우스와 다시 교배합니다.

    일반적으로 10세대 이상 backcrossing하면 → 99%의 유전적 배경이 근교계가 됩니다.

     

     

     

     

    * 그림출처 : https://en.wikipedia.org/wiki/Backcrossing

    유사질문
    • TG, KO 마우스 계통을 관리할 때 사용하는 Backcrossing 방법을 설명해 주세요
    References
      1)Silver LM. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Oxford University Press; 1995.
      2)Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
      3)Bouabe H, Okkenhaug K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 2013;1064:315-336. doi:10.1007/978-1-62703-601-6_23
      4)Crawley JN. What’s Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. 2nd ed. Wiley; 2007.
      5)The Jackson Laboratory. Handbook on Genetically Standardized Mice. https://resources.jax.org/therapeutic-area-essentials/jax-handbook-genetically-standardized-mice Accessed July 10, 2025.
      6)Backcrossing. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Backcrossing Accessed July 10, 2025.

    Mouse, 형질전환, Backcrossing, 번식, Genetics
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  • 417 면역부전 마우스로 유방암 전이 xenograft 모델을 확립하려고 하는데, 어떤 마우스를 써야하나요? 마우스/랫드 형질전환
    - 면역부전 마우스를 활용하여 유방암 전이 xenograft 모델을 확립하려면, 다음과 같은 마우스 모델과 세포를 고려할 수 있습니다.

     

     1) 면역부전 마우스 모델

     
     - NSG 마우스 (NOD-scid IL2Rγnull): NSG 마우스는 T세포, B세포, NK세포가 모두 결핍된 고도의 면역결핍 모델로, 인간 유방암 세포의 이식 및 전이를 효과적으로 재현할 수 있습니다.
     
     - NOD/SCID 마우스: 이 모델은 T세포와 B세포가 결핍되어 있으며, NK세포 기능도 저하되어 있어 인간 유방암 세포의 이식에 적합합니다. 그러나 NSG 마우스에 비해 전이 재현성이 다소 낮을 수 있습니다.
     
     - Nude 마우스 (nu/nu): T세포가 결핍된 모델로, 유방암 세포의 이식에는 사용될 수 있으나, 전이 모델로서는 제한적입니다.
     
     

     2) 세포주 선택

     
     - 삼중음성 유방암세포주 (Triple-negative breast cancer): 대표적으로 MDA-MB-231가 있으며 폐, 뼈, 간, 뇌로 강한 전이성을 보입니다.  이외에 전이가 가능한 세포주로는 MDA-MB-435와 SUM1315가 있습니다.
     
     - HER2+ 유방암세포주: 대표적으로 폐와 림프절로 전이가 가능한 KPL-4가 있습니다. 하지만 BT-474는 전이성이 낮습니다.
     
     - ER+/PR+ 유방암세포주: ZR-75-1 세포주는 주로 osteoblastic(골형성) 전이를 유도 할 수 있으나 MCF-7 세포주는 전이성이 낮기 때문에 활용이 제한적입니다.
     
    유사질문
    • 유방암 세포의 생착률과 전이 효율을 높이기 위한 세포주와 면역결핍 마우스 조합은 어떻게 구성해야 하나요?
    References
      1) Puchalapalli M et al. 2016. NSG Mice Provide a Better Spontaneous Model of Breast Cancer Metastasis than Athymic (Nude) Mice. PLoS One 11(9):e0163521.
      2) Kurebayashi J et al. 1999. Isolation and characterization of a new human breast cancer cell line, KPL-4, expressing the Erb B family receptors and interleukin-6. Br J Cancer 79(5-6):707-717.
      3) Holliday DL et al. 2011. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Res. 13(4):215.
      4) Iorns E et al. 2012. A New Mouse Model for the Study of Human Breast Cancer Metastasis. PLoS One 7(10):e47995.
      5) Ş Comşa, et al. 2015. The Story of MCF-7 Breast Cancer Cell Line: 40 years of Experience in Research. Anticancer Res. 35(6):3147-3154.
    면역부전마우스 유방암 Xenograft
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  • 416 특정 형질전환 마우스에서 공격성이 더 올라갈 수 있나요? 이 경우 어떻게 해야할까요? 마우스/랫드 형질전환
    - 특정 형질전환 마우스 (알츠하이머 모델, 세로토닌 시스템 변화 모델)에서 공격성이 증가하는 현상은 여러 연구에서 보고되고 있습니다. 이러한 행동 변화는 유전자 변형이 신경전달물질시스템에 영향을 끼칠 때 나타날 수 있습니다.

     

     1) Tg2576 마우스와 5xFAD (알츠하이머 모델)

     
      - 사람의 amyloid precursor protein (APP) gene을 과발현하는 Tg2576마우스는 알츠하이머질환의 진행과 동시에 공격성이 나타나고 사회적 상호작용이 감소합니다.
     
      - 사람의 돌연변이 APP 및 PS1 유전자를 과발현하는 5xFAD 마우스는 질병의 빠른 진행과 함께 공격성을 동반한 부상 발생 빈도 증가로 인해 사육 중 개체 분리를 조기에 해야 한다고 보고되었습니다.

     

     2) RGS2 과발현 마우스

     
      - 세로토닌 뉴런에서 RGS2 단백질을 과발현한 마우스는 공격 행동이 증가하며, 이는 세로토닌 시스템의 조절 기능 변화와 관련이 있습니다.

     

    [해결 방법]

     
    - 공격성이 높은 마우스는 분리하여 단독사육을 할 수도 있으나, 사회적 고립의 부작용을 줄이기 위해 투명한 칸막이로 분리된 케이지에서 시각적, 후각적, 청각적 교류를 유지하는 ‘separated pair housing’ 을 통해 공격성을 줄일 수 있습니다.
     
    - 은신처, 터널, 씹을 수 있는 재료 등 다양한 환경 풍부화 요소를 제공하는 것이 공격성을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
     
    - 외상이 생긴 마우스는 전임수의사와 논의하여 적절한 치료 계획을 수립합니다.
     
     
    유사질문
    • 형질전환 마우스에서 특정 유전자 발현이 사회적 상호작용 또는 공격성에 어떤 영향을 미칠 수 있나요?
    • 알츠하이머 마우스 모델이 더 공격적인가요?
    References
      1) Alexander G  et al. 2011. Increased aggression in males in transgenic Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Behav Brain Res 216(1):77-83.
      2) Mark MD et al. 2019. RGS2 drives male aggression in mice via the serotonergic system. Commun Biol 2:373.
      3) Hohlbaum K et al. 2020. Social enrichment by separated pair housing of male C57BL/6JRj mice. Sci Rep 10:11165.
      4) Van Loo PLP et al. 2002. Influence of cage enrichment on aggressive behaviour and physiological parameters in male mice. Appl Anim Behav Sci 76(1):65-81.
      5) Filip Kosel et al. 2021. Reduced social investigation and increased injurious behavior in transgenic 5xFAD mice. J Neurosci Res 99(1):209-222.
    형질전환 마우스 공격성 알츠하이머
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  • 415 Hetero 마우스에서 원하는 수의 homo 마우스를 획득하기 위한 교배 전략은 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환
    - Heterozygous(+/-) 마우스에서 homozygous(+/+ 또는 -/-) 마우스를 얻기 위해서는 Het x Het 교배 전략이 기본입니다. 이 경우, 산자의 유전자형 분포는 25% homozygous, 50% heterozygous, 25% WT (Wild type)로 나타나며 이론적으로 전체 산자의 25%가 homozygous입니다.
    - 필요한 Homozygous 마우스 수(N)에 따른 교배쌍(Het x Het) 수를 계산해 보면, 이론적 Homozygous 출현 비율이 25%이므로,

                           필요한 총 산자 수 = N/0.25 = 4N

    - 한 쌍의 교배에서 평균 5마리 산자 수를 확보한다고 가정하면, 아래와 같이 0.8N으로 이론적 교배 쌍의 수가 필요합니다.

                           이론적 교배쌍 수 = 4N/5 = 0.8N

    - 그러나 실제 실험에서는 homozygous 산자 발생률이 25%보다 낮을 수 있고, 교배 당 평균 산자수가 5마리 보다 적거나, 생존율 저하 등의 문제가 발생할 수 있습니다. 이를 고려하여 보수적으로 N~2N 이상의 교배쌍을 계획하여야 원하는 수의 마우스를 확보 할 수 있습니다.
     
     
    - 또한, 암컷 또는 수컷 산자만 필요하거나, 암컷의 번식 기간, 평균 출산 횟수 등의 요소 역시 필요한 교배쌍 수에 영향을 미칩니다. 번식력이 떨어지거나 임신 성공률이 낮은 경우에는 대리모를 활용하여 Homozygous 개체 수를 확보하는 전략도 고려해야 합니다.
    유사질문
    • 형질전환 heterozygote 마우스를 이용해 빠르게 homozygote 라인을 구축하려면 어떤 교배 전략을 세워야 하나요?
    References
      1) A Jackson Laboratory Resource Manual. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. https://research.uci.edu/wp-content/uploads/JAX-breeding-strategies.pdf . Accessed May 31, 2025.
      2) Silver LM. 1995. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Oxford University Press. [ISBN: 9780195075547]
    Hetero Homo 마우스 교배
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  • 414 유전자변형 마우스를 잘 관리하기 위해 기록해야 하는 정보에는 어떤 것이 있나요? 마우스/랫드 형질전환

    [유전자변형 마우스 관리를 위해 반드시 작성해야 하는 정보]

     
    - 유전자변형 마우스에 대한 가계도(Pedigree), 산자 수(Litter Size), 출산 간격(Litter Interval), 번식을 시작하고 끝내기까지의 번식 주기 (Reproductive Life Cycle), 번식력(Fertility), 실험동물의 동물복지 관련 우려사항(Welfare Concerns), 표현형 특징(Known Phenotypes)은 유전자변형 마우스를 관리하기 위해 꼭 기록하고 확인해야 하는 정보입니다. 또한 정보를 기록하는 것 뿐만 아니라 기록된 정보를 이용하여 유전자변형 마우스의 상태를 주기적으로 확인하고 산자를 생산하지 못하는 교배용 마우스를 교체하는 것과 같은 조치를 취하는 부분도 매우 중요합니다.

     

    [유전자변형 마우스 관리 중 문제가 발생할 수 있는 주요 원인]

     
    - 관리하는 사람의 실수로 다른 계통과 교배하여 유전적 오염(Genetic contamination)이 발생할 수 있으며 실례로 1982년 Roy Stevens 박사 연구실에서 Jackson Lab으로 도입되었던 129X1/SvJ 라인의 경우 털색 관련 돌연변이가 발생하여 마우스 데이터를 비교한 결과 Jackson Lab 도입 전 다른 계통과 실수로 교배되었을 가능성이 높은 것으로 확인된 사례가 있습니다.
     
    - Genotyping 샘플 취급 과정에서의 실수나 오염, 잘못된 라벨링 등으로 유전자형 정보가 잘 못 기재되는 경우로 다수의 마우스 샘플을 얻고 이를 이용하여 실험하는 과정에서 오류가 발생할 수 있습니다.
     
    - 불완전한 기록이나 인수인계 과정의 실수로 유전자변형 마우스의 가계도를 잘 못 기재되는 경우에도 문제가 발생합니다.

     

    [유전자변형 마우스 가계도(Pedigree) 작성에서 주의해야 할 점]

     
    - 외부 도입 마우스에 대한 확인 및 기록 유지 : 마우스 라인을 외부에서 새로 도입했을 때, 변형된 유전자와 배경 계통을 반드시 확인하고 해당 라인이 어떻게 만들어졌는지를 상세히 기록하고 보관해야 합니다.
     
    - 표준화된 명명 규칙 사용 및 연구자 교육 : 연구자 간 혼선이 없도록 구조화된 명명법을 사용하고 기록의 일관성을 유지하는 한편, 구성원을 대상으로 교육을 일정 주기로 실시합니다.
     
    - 유전자형 및 표현형 모니터링 : 주기적으로 유전자형을 확인하고 표현형의 변화를 주의 깊게 관찰하며 예상치 못한 변이가 발견되면 원인을 조사하여 변이를 확인 및 검증하고 연구에 미치는 영향을 평가하여 번식 및 관리 계획을 조정합니다.
     
     
    유사질문
    • 유전자변형 마우스의 변형된 유전형질을 잘 유지하기 위해 주의해야 할 부분이 있을까요?
    References
      1) NC3Rs. Breeding and colony management. Accessed July 9, 2025. https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/breeding-and-colony-management
      2) Fernando B, Thomas R, Jan-Bas P, James B, Ferdinando S, Paolo C, Yann H, Dirk W. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA working group report. Lab Anim. 2020;54(2):135-148.
      3) The Jackson Laboratory. Maybe it’s Not You, Maybe it’s Your Mice! JAX Blog. August 3, 2016. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2016/august/maybe-its-not-you
      4) University of Michigan Animal Care & Use Program. My Strain Initiative. Accessed July 9, 2025. https://animalcare.umich.edu/animal-use/my-strain-initiative/
    Pedigree 유전자변형 마우스 가계도 Genetic Contamination
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  • 413 내가 관리하고 있는 유전자변형 마우스 중에서 교배용 마우스를 선택해야 한다면 어떤 마우스를 선택하는 것이 좋을까요? 마우스/랫드 형질전환

    [교배 마우스 선별기준]

    - 교배용 마우스는 필요한 유전자변형 형질을 가지고 있는 마우스 중에서 외관상 건강하고 질병이 없으며 암수 개체 크기 차가 크지 않고 체중이 적정한 마우스를 선택하는 것이 좋습니다.
    - 교배용 마우스는 6~8주령 마우스가 적합하며 교배용 마우스를 선택하기 전 신체 검사를 실시하여 털이 뽑히거나 왜소하거나 물린 흔적이 있는 개체, 수두증, 부정교합 등 선천적인 기형이 있거나 음경 포피에 상처가 있는 개체는 제외합니다.
    - 산자 수가 많은 마우스 중에서 교배 마우스를 선택하는 것보다 적정 수준의 산자 중에서 교배용 마우스를 선발하는 것이 좋은데 그 이유는 어미의 모유량이나 영양 성분이 산자 수에 따라 증가하는 것이 아니기 때문에 충분한 모유를 섭취한 개체를 선택하는 것이 좋습니다.
     

    [신체 검진을 통해 교배용 마우스에서 제외해야 할 마우스 기형 사례]

     

    * 그림출처 : Guidebook on Mouse and Rat colony Management, Charles River Laboratory, 2015.

    유사질문
    • 마우스에서 임신이 어려운 선천적 기형 증상이 있을까요?
    References
      1) Charles River Laboratories. Guidebook on Mouse and Rat Colony Management. Charles River Laboratories; 2015.
      2) The Jackson Laboratory. Handbook on Genetically Standardized Mice. 6th ed. The Jackson Laboratory; 2009.
      3) AALAS Learning Library. Colony Management 1: Breeding and Recordkeeping. Accessed July 9, 2025. https://www.aalaslearninglibrary.org/
    Breeder 기형 Vaginal Septum Imperforate Vagina Preputial Injury
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  • 412 종양이 발생해서 수명이 짧은 유전자변형 마우스의 교배 케이지는 어떻게 관리해야 할까요? 마우스/랫드 형질전환
    - 마우스의 수명은 1.5 ~ 2년이며 임신하고 새끼를 출산할 수 있는 연령은 보통 수컷은 10~12개월까지, 암컷의 경우 6~8개월까지 가능합니다. 하지만 종양이 발생하거나 루게릭병, 헌팅턴병 등의 특징을 나타나는 유전자변형 마우스의 경우 일반 마우스에 비해 수명이 짧거나 어린 나이에 표현형이 나타납니다. 이런 라인들의 경우 라인별 특징에 따른 교배 전략 수립이 필요한데, 종양이 발생하거나 표현형이 발현되는 것으로 알려진 연령 전에 교배 마우스를 교체하거나 육아 능력이 떨어지는 마우스의 경우 수술적 기법을 활용하여 유전자변형 마우스의 난소를 다른 마우스로 이식하고 교배하는 것을 권장하는 경우도 있습니다. 유전자변형 마우스 도입 전 해당 라인에 대한 특징과 권장하는 교배 방법을 미리 숙지해두는 것이 필요합니다.
     
    이외 수명이 짧거나 표현형 관련 문제가 있는 마우스는 Sperm/Embryo Freezing을 통해 해당 라인을 보존하고 필요할 때 복원하는 방법을 사용하는 것이 좋으며 호모형에서 조기 사망하거나 표현형이 발현되어 문제가 되는 라인은 생존성과 번식 능력을 보존하기 위해 Heterozygous 상태로 유지하는 것이 권장됩니다.

     

     

    [교배 마우스 관리에 주의가 필요한 사례 1, (Tumor development : B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J)]

    - 위 마우스는 Trp53 유전자 기능을 잃어 어린 나이에 종양이 발생하는 마우스입니다.  Homozygous 마우스의 경우 대부분 3~6개월 사이 종양 (주로 림프종과 육종)이 발생하는데 특히, 암컷은 수컷에 비해 이유 시기까지 생존율이 현저히 낮다고 알려져 있습니다.  Heterozygous 마우스는 약 10개월경에 종양이 발생합니다.
     
    - 권장 교배 방법은 Heterozygous Female x Homozygous Male이며 Homozygous 암컷의 낮은 생존율과 종양 발생 시기를 고려한 방법입니다.
     

    [교배 마우스 관리에 주의가 필요한 사례 2 (ALS : B6.Cg-Tg(Prnp-TARDBP*A315T)95Balo/J)]

    - 위 마우스는 ALS(루게릭병)이나 유비퀴틴 응집체가 동반된 전측두엽 피질 변성증(FTLD)과 같은 신경근육계 또는 신경퇴행성 질병을 연구하기 유용한 마우스로 Hemizygous 마우스를 구매할 수 있습니다. Hemizygous 수컷의 경우 암컷에 비해 더 짧은 수명을 가지며 약  3.5개월 생존하는데 결장 장신경총 신경이 점진적으로 퇴행되고 이것이 위장 운동 저하로 이어져 폐사에 이르게 됩니다. Hemizygous 암컷의 경우 수명이 5-6개월 정도로 폐사 전 잘 걷지 못하고 다리를 끌거나 체중이 감소하고 의식이 저하되는 것을 관찰할 수 있습니다.                                
     
    - 권장 교배 방법은 Hemizygote x Noncarrier (Colony 중 Wild type or C57BL/6J inbred mice)이며 암수 마우스별 표현형 발현 시기 전 교배용 마우스를 교체하는 것이 필요합니다.
     

    [교배 마우스 관리에 주의가 필요한 사례 3 (Huntington Disease : B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J)]

    - 위 마우스는 인간 헌팅턴병 유전자의 일부를 포함하고 있어 헌팅턴병(HD)의 여러 특징을 모방하는 진행성 신경학적 표현형을 가진 마우스로 Hemizygous 마우스를 구매할 수 있습니다. Hemizygous 암컷의 경우 번식력은 있지만 질병으로 새끼를 돌볼 수 없기에 Hemizygous Female 난소를 건강한 암컷 B6CBAF1에게 이식(Ovarian transplant)하여 교배하는 방법을 권장하며 Hemizygous 수컷의 경우 3~4주 정도에만 교배가 가능하기에 짧은 교배 기간동안 임신을 많이 할 수 있도록 여러 마리 암컷과 동시에 교배하는 방법이 필요합니다.
     
    - 권장 교배 방법은 Ovarian transplant hemizygote female x B6CBAF1/J male이며 B6CBAF1 female X Hemizygous HD62 male (수1: 암2 교배)를 통해서도 교배할 수 있습니다. Hemizygous 암컷의 육아능력과 Hemizygous 수컷의 짧은 교배 가능 기간을 고려한 교배 방법입니다.
    유사질문
    • 루게릭병, 헌팅턴병을 연구할 수 있는 유전자변형 마우스는 표현형 문제로 수명이 짧거나 새끼를 잘 돌보지 못하는데 어떻게 관리해야 할까요?
    References
      1) The Jackson Laboratory. B6.129S2-Trp53<tm1Tyj>/J. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/strain/002101
      2) The Jackson Laboratory. B6.Cg-Tg(Prnp-TARDBP*A315T)95Balo/J. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/strain/010700
      3) The Jackson Laboratory. B6CBA-Tg(HDexon1)62Gpb/1J. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/strain/002810
      4) The Jackson Laboratory. Handbook on Genetically Standardized Mice. 6th ed. The Jackson Laboratory; 2009.
    Breeding Tumor ALS Huntington Disease 생식능력
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  • 411 형질전환 마우스 colony를 유지하는 과정에서 유전형 분석 결과가 반복적으로 예상과 다르게 나타나는 이유는 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환

    형질전환 마우스 colony를 유지하는 과정에서 유전형 분석 결과가 반복적으로 예상과 다르게 나타나는 현상의 원인은 크게 생물학적, 기술적, 관리적 측면으로 구분할 수 있으며, 각 요인을 이해하고 적절하게 대처하는 것이 colony의 유전적 안정성을 유지하는 데 필수적입니다.

     
     1) 생물학적 요인: Genetic Drift(유전적 부동), Epigenetic Silencing(후성유전적 침묵)
     
    형질전환 마우스 colony를 여러 세대에 걸쳐 유지할 경우, 유전자 구성이 점차 달라지는 Genetic drift가 발생할 수 있습니다. 이는 마우스의 표현형 또는 유전형 분석 결과가 실험실 간 또는 시간 경과에 따라 달라지는 주요 원인 중 하나입니다. Genetic drift는 특히 면역체계와 같은 영역을 연구할 때 표현형에 심각한 차이를 초래할 수 있습니다. Genetic drift를 늦추기 위해서 공급업체들은 마우스 배아를 동결보존하고, 이를 사용하여 기초 colony를 몇 세대마다 교체합니다.

    또한, 형질전환 마우스에서는 transgene이 염색체에 안정적으로 삽입되었더라도 세대를 거치며 점차 발현이 감소하거나 완전히 사라지는 epigenetic silencing 현상이 발생할 수 있습니다. 이는 transgene 삽입 위치의 크로마틴 구조 변화, DNA methylation(DNA 메틸화), histone modification(히스톤 변형) 등에 의해 유도됩니다. 시간이 지남에 따라 silencing은 유전자 발현이 없는 세포 비율 증가의 형태로 나타나며, ON/OFF 상태의 이분화된 분포로 관찰되기도 합니다.

    특히 유전자 회로에서 여러 transgene의 연속적 발현이 필수인 경우, 하나의 유전자라도 silencing되면 전체 회로 기능이 중단될 수 있습니다. 더 나아가, silencing은 인접한 유전자로 전파되어 누적적으로 발현 억제를 일으킬 수 있으며, 이는 실험의 재현성과 유효성에 중대한 영향을 줄 수 있습니다.

     
     2) 기술적 요인: Cre-lox 기반 재조합
     
    일반적으로 Cre 재조합효소는 성체의 특정 세포에서만 발현되도록 설계되지만, 배아 발달 초기 단계 또는 생식세포에서 일시적으로 발현되는 경우가 있습니다. 이러한 발현은 ectopic expression(이소성 발현)이라고도 부릅니다.  매우 소량의 Cre라도 loxP 서열을 인식하여 예기치 않은 재조합을 일으킬 수 있기 때문에, 이러한 재조합을 탐지할 수 있는 실험설계가 필수적입니다.

     

     3) 관리적 요인: 유전형 분석 오류, 서로 다른 라인의 혼입

     

    PCR 분석 시 primer 또는 probe의 낮은 특이도에 따른 유전형 분석 오류가 발생하거나, 서로 다른 삽입 위치 또는 copy number를 가진 독립된 라인이 혼입되었을 경우, 유전형 분석 결과에 혼선을 줄 수 있습니다.

    유사질문
    • 형질전환 마우스 colony의 유전적 안정성을 확보하려면 어떤 요인을 고려해야 하나요?
    References
      1) Zeldovich L. Genetic drift: the ghost in the genome. Lab Anim. 2017;46:255–257.
       
      2) Cabrera A, Edelstein HI, Glykofrydis F, et al. The sound of silence: Transgene silencing in mammalian cell engineering. Cell Syst. 2022;13(12):950–973.
       
      3) Song AJ, Palmiter RD. Detecting and Avoiding Problems When Using the Cre–lox System. Trends Genet. 2018;34(5):333–340.
       
      4) Haruyama N, Cho A, Kulkarni AB. Overview: engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009;Chapter 19:Unit 19.10.

    형질전환 번식 genetic drift epigenetic silencing ectopic expression
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  • 410 형질전환 마우스의 유전형 분석에서 hemizygote와 homozygote를 어떻게 구분할 수 있나요? 마우스/랫드 형질전환

    형질전환 마우스에서 transgene이 유전되었는지 여부는 conventional PCR만으로도 확인할 수 있으나 hemizygote와 homozygote를 구분하려면 transgene copy 수를 정량적으로 측정할 수 있는 방법이 필요합니다. 일반적으로 real-time PCR 기반의 상대적 정량 분석, Probe/Endpoint 분석법, droplet digital PCR(ddPCR) 등의 기법이 사용됩니다.

     

     - 가장 널리 사용되는 방법은 real-time PCR (qPCR)로, transgene의 증폭 정도를 endogenous single-copy gene(게놈 내에 단일한 복제수로 존재하는 유전자)과 비교하여 상대적인 transgene 양을 산출합니다. Hemizygote는 대조군 대비 1배수, homozygote는 2배수의 발현을 보입니다.
     
     - 또 다른 방법으로는 Probe/Endpoint 분석법이 있습니다. 이 방법은 형질전환 마우스에서 wild-type 대립유전자와 mutant transgene 대립유전자를 동시에 검출할 수 있도록 고안된 fluorescent probe 기반의 PCR 분석법입니다. PCR 증폭 후 각 probe의 형광 세기를 최종 단계에서 측정하여, wild-type 대립유전자는 x축, mutant transgene 대립유전자는  y축에 해당하는 형광값으로 표현합니다. 분석 결과, homozygote는 하나의 축에, heterozygote는 두 probe 모두에 반응하므로 대각선 상에 분포하게 되어, 세 유전형을 명확히 구분할 수 있습니다.
     
    - 보다 높은 정밀도와 민감도를 필요로 하는 경우에는 droplet digital PCR (ddPCR)을 사용할 수 있습니다. ddPCR은 PCR 반응 혼합물을 수천 개의 미세한 droplet으로 나누어 각각 독립적인 PCR 반응을 수행하는 방식으로, 절대적인 transgene copy 수를 정량할 수 있는 것이 특징입니다. 표준곡선이 없어도 정량화가 가능하고, PCR inhibitor의 영향을 덜 받으며, 실험 간 재현성도 높아 형질전환 마우스의 hemizygote와 homozygote를 보다 정확히 구분할 수 있습니다.
    유사질문
    • 형질전환 마우스에서 transgene copy 수를 확인하려면 어떻게 해야 하나요?
    References
      1) The Jackson Laboratory. Hold the Agarose! Advanced PCR Methods for Genotyping Mice. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2015/september/hold-the-agarose-advanced-pcr-methods-for-genotyping-mice
       
      2) Ballester M, Castelló A, Ibáñez E, Sánchez A, Folch JM. Real-time quantitative PCR-based system for determining transgene copy number in transgenic animals. Biotechniques. 2004;37(4):610–613.
       
      3) Nakagaki A, Urakawa A, Hirano S, Anami T, Kishino T. Application of droplet digital PCR in the analysis of genome integration and organization of the transgene in BAC transgenic mice. Sci Rep. 2018;8:6638.
    형질전환 hemizygote homozygote transgene copy
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  • 409 F0 세대 형질전환 마우스에서 유전형 분석이 불확실하거나 자손에게 형질이 유전되지 않는 이유는 무엇인가요? 마우스/랫드 형질전환

    F0 세대 형질전환 마우스에서 유전형 분석이 불확실하거나 자손에게 형질이 유전되지 않는 주요 원인으로는 모자이크 현상 및 germline transmission 실패, 무작위적 transgene 삽입, Transgene silencing, Genotyping 오류 및 F0 위양성 등이 있습니다. 이러한 문제를 방지하기 위해서는 체계적인 founder 마우스 라인 확립 전략을 수립해야 합니다.

     
    1) 모자이크 현상 및 germline transmission(생식세포 전달) 실패

    F0 마우스에서 transgene이 하나의 염색체에 안정적으로 삽입되었다면, 멘델의 법칙에 따라 F1 자손의 약 50%가 해당 유전자를 유전 받아야 합니다. 만약 F1 세대에서 유전 비율이 50%보다 현저히 낮다면, 해당 F0 개체가 모자이크 개체일 가능성이 높습니다. 이는 배아 발생 중 유전자 통합 시점이 늦어 모든 세포에 transgene이 삽입되지 않았기 때문입니다. 모자이크 개체는 생식세포 중 transgene을 포함한 세포의 수에 따라 유전자를 자손에게 아예 전달하지 않거나 매우 낮은 효율로만 전달할 수 있습니다.

     
    2) 무작위적 transgene 삽입

    Transgene은 무작위로 마우스 유전체에 삽입되므로, 기존의 정상 유전자를 방해할 수 있습니다. 이러한 삽입은 haploinsufficiency(반수체 불충분성)로 인해 heterozygous 개체에서도 예상치 못한 표현형을 유발할 수 있습니다. 대부분의 돌연변이에 의한 표현형은 열성이므로, heterozygote를 교배하여 homozygote를 만들어야만 표현형이 확인됩니다. 또한 homozygote는 hemizygote보다 transgene 발현 수준이 더 높을 수 있습니다. 밝혀지지 않은 유전자로 인한 불확실성을 배제하려면, 삽입 위치가 서로 다른 독립적인 마우스 라인 2개 이상을 분석하는 것이 바람직합니다.

     
    3) Transgene silencing(유전자 침묵)

    Transgene silencing은 transgene이 전사 비활성 영역에 삽입될 때 발생합니다. 이 경우 유전자가 유전체 내에 존재하지 않더라도 mRNA 전사가 일어나지 않아 발현이 되지 않습니다.  이러한 전사 비활성 상태는 repressor(억제 인자)가 promoter 주변에 존재할 경우, 발현이 억제된 유전자 안에 삽입되었을 경우, DNA methylation(DNA 메틸화), X-inactivation(X 염색체 불활성화), genomic imprinting(유전체 각인) 등의 epigenetic regulation(후성유전적 조절)에 의해 나타날 수 있습니다.

    이러한 가능성을 줄이기 위해서는 insulator sequence(절연체 서열)를 transgene에 포함시키는 것이 도움이 될 수 있습니다. 반대로, enhancer나 promoter 근처에 유전자가 삽입되면 예상치 못한 조직이나 시점에서 유전자가 비의도적으로 발현되는 leaky expression이 나타나는 경우도 있습니다.

    한편, transgene의 발현은 세대를 거치며 점점 감소하거나 완전히 사라지기도 하는데, 이러한 epigenetic silencing(후성유전적 침묵)은 특히 high copy number를 가진 형질전환 마우스가 나이가 들수록 자주 발생할 수 있습니다.

     
    4) Genotyping(유전형 분석) 오류 및 F0 위양성

    PCR 분석 시 primer 또는 probe의 특이도가 낮을 경우, 위양성 결과가 나올 수 있습니다. 따라서 F0 개체의 유전형을 판별할 때는 Southern blotting을 통한 분석이 권장됩니다.  F0 개체가 전혀 얻어지지 않은 경우, 가장 먼저 고려해야 할 것은 microinjection(미세주입) 과정의 기술적 문제입니다. 삽입된 transgene 자체가 마우스 배아 발달이나 이유기 전 생존에 필수적인 기능을 방해했을 가능성도 있습니다. 이러한 경우에는 실험을 반복하기 전에 해당 transgene의 생물학적 기능 및 구성 요소를 재평가할 필요가 있습니다.

     
    5) 형질전환 founder 마우스 라인 확립 전략

    PCR과 Southern blotting은 transgene 존재 여부를 확인하는 가장 보편적인 분석법입니다. Southern blotting은 위양성 비율이 낮고, copy number 및 flanking fragment(인접 절편) 등 더 많은 정보를 제공하므로 founder 선별 시 권장됩니다. 분석해야 할 F0 개체 수가 많은 경우, 먼저 PCR로 양성 개체를 선별한 후, 소수 샘플에 대해 Southern blotting을 진행해 정확성을 확보할 수 있습니다.

    같은 construct를 사용하더라도 삽입 위치나 copy number에 따라 서로 다른 표현형이 발생할 수 있으므로, 독립된 founder 라인은 혼합되지 않도록 별도 관리해야 합니다. PCR 결과는 동일 transgene에 대해 동일 amplicon(증폭산물)을 생성하기 때문에, 서로 다른 라인이 섞이면 일반적인 PCR로는 구분이 불가능합니다.

    Zygote 주입 후 약 3주 뒤, 잠재적 founder 마우스가 태어나며, 이유 전 genotyping을 통해 유전형을 확인합니다. Founder가 식별되면 생식 능력이 생기는 9주령 이후에 교배가 가능하며, 이로부터 얻어진 F1 자손은 실험에 사용할 수 있는 최초 세대가 됩니다. F1 세대에서는 germline transmission과 transgene copy number를 반드시 검증해야 하며, 같은 founder로부터 나온 F1 개체들이 동일한 copy number와 flanking sequence(인접 서열)를 가졌다면, 해당 개체들 중 어느 한 마우스를 선택해 확립된 단일 라인으로 사용할 수 있습니다.

    유사질문
    • 형질전환 founder 마우스에서 어떤 개체를 교배용으로 선택해야 하나요?
    References
       
      1) Haruyama N, Cho A, Kulkarni AB. Overview: engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009;Chapter 19:Unit 19.10.
       
      2) The Jackson Laboratory. Model Generation Frequently Asked Questions. The Jackson Laboratory. Accessed July 9, 2025. https://front.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/model-generation-frequently-asked-questions
    형질전환 번식 mosaicism germline transmission transgene silencing
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