물고기는 포유류에서 감각 정보를 처리하는 신피질(neocortex)이 없기 때문에 고통을 느낄 수 없다고 알려져 있었으나, 최근에 제브라피쉬는 포유류와 유사한 통각수용체(nociceptor)가 존재하고 고통을 감지할 수 있는 메커니즘이 존재할 것이라는 연구 결과가 나오고 있습니다. 

고온이나 산성 물질에 노출된 제브라피쉬 배아는 행동성이 낮아지는데 모르핀 등의 진통제 투여로 행동성이 개선되었습니다. 또한 고온에 노출된 제브라피쉬 배아는 온도가 점점 올라갈 수록 통각 신경이 크게 반응하는 것을 확인하였습니다. 하지만 어떤 신경구조 및 신경회로를 통해 고통을 느끼는지는 아직 밝혀지지 않았고 현재 연구가 진행되고 있습니다.

* 그림 출처: Curr Neuropharmacol. 2022;20(3):476-493.

제브라피쉬도 기억 및 학습을 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 뇌에도 기억과 학습, 인지기능을 담당하는 뇌 신경회로가 있습니다. 제브라피쉬는 같은 종과 무리 지어 다니는 사회적 행동을 하는데, 개별 포획 확률을 감소시켜 포식으로부터 보호하는 역할을 합니다.

시각적인 특징 및 후각 신호가 작용하여 무리 지어 다니는 선호도를 보이고, 사람의 영유아기에 해당하는 시기에 외형이 달라도 함께 키워진 제브라피쉬에 대한 선호도를 보이는데, 이 때의 학습 및 기억은 성체 시기에서도 유지됩니다. 알코올과 니코틴이 제브라피쉬 학습에 미치는 영향이 연구되어 있습니다. 제브라피쉬에서 전기 충격을 이용한 충격 회피 학습을 확인할 수 있으며, 먹이 보상을 이용하여 시각 및 공간식별에 대한 학습을 진행할 수 있습니다.

*그림 출처: Noldus. https://www.noldus.com

국내 및 해외의 제브라피쉬 소재은행은 야생형 제브라피쉬 뿐만 아니라 개별연구자들에 의하여 개발된 돌연변이 및 형질전환 제브라피쉬 라인들을 기탁받아 필요한 연구자들에게 분양해 줌으로서 연구자들이 필요한 제브라피쉬 라인을 손쉽게 연구에 활용할 수 있도록 지원을 하고 있으며, 국내와 국외에서 제브라피쉬를 분양 받을 수 있는 소재은행의 사이트는 아래와 같습니다. 

  - 미국 : Zebrafish International Resource Center (ZIRC, https://zebrafish.org)

  - 유럽 : European Zebrafish Resource Center (EZRC, https://www.ezrc.kit.edu)

  - 일본 : National BioResource Project(NBRP, https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html)

  - 국내 : 질환모델링 제브라피쉬 소재은행(KNRRC, https://cc.aris.re.kr/zcdm/app/org/orgIntro.do), 형광리포터 제브라피쉬 협력센터(FRZCC) 

특히 해외의 제브라피쉬 소재은행에서 형광리포터 제브라피쉬의 수입은 “형광리포터 제브라피쉬 협력센터＂에 요청하시면 수입 및 검역과정에 대하여 지원을 받을 수 있습니다.

제브라피쉬는 척추동물모델로서 인간이 가지는 대부분의 유전자를 가지고 있으며 동시에 인간 유전체와 높은 유전학적, 기능적 유사성을 가지고 있는 동물모델 입니다. 특히 제브라피쉬는 유전자의 돌연변이 동물모델 제조 및 형질전환 동물모델 제조가 용이하여 이들 유전자변형 제브라피쉬를 이용하여 뇌신경질환(파킨슨, 루게릭병, 정신분열/자폐증), 심장 및 혈액질환, 종양질환(위암, 간암, 췌장암), 대사성 질환(비만, 지방간, 당뇨), 피부질환(미백제, 아토피), 염증 및 면역질환 등의 다양한 질환동물모델 제조가 가능하며 이러한 질환모델을 이용한 질병의 병인 기전 연구 및 신약개발연구가 활발히 이루어지고 있습니다. 또한 환경유해물질이나 화학물질에 의한 독성 연구에도 활발하게 이용되고 있는 동물모델 입니다. 

국내에서 제브라피쉬는 한국생명공학연구원, 질병관리청 국립보건연구원, 안전성 평가연구소, 국립해양생물자원관, 한국한의학연구원, 한국화학연구원 등 다수의 연구소에서 질환연구, 신약개발연구, 독성연구 등에 활용되고 있으며, 또한 많은 대학에서 제브라피쉬를 이용한 다양한 연구가 수행되고 있습니다. 한국제브라피쉬연구회(http://kzfs.co.kr)를 방문하시면 제브라피쉬 동물모델을 활용하는 국내 연구진과 연구분야를 확인하실 수 있고, 또한 다양한 제브라피쉬 관련 연구정보를 확인하실 수 있습니다. 

해외에서 제브라피쉬를 이용한 다양한 연구정보는 The Zebrafish Information Network (https://zfin.org)에서 확인할 수 있으며, 제브라피쉬를 이용한 사람의 질환연구에 대한 정보는 Zebrafish Disease Model Society 홈페이지(https://www.zdmsociety.org)에서 확인할 수 있습니다.

형질전환 제브라피쉬는 야생형의 제브라피쉬 배아에 인위적으로 연구자가 발현시키기를 원하는 외부의 유전자를 주입하여 발현되도록 만들어진 유전자 조작 제브라피쉬를 의미합니다. 제브라피쉬 배아에 주입된 외부 유전자는 야생형의 제브라피쉬가 가지고 있던 유전체(Genome)에 삽입되어 본래의 유전체와 함께 자손에 유전됨으로써 지속적으로 외부 유전자를 발현하게 됩니다.  따라서 형질전환 제브라피쉬는 본래의 야생형이 가지고 있지 않은 외부 유전자가 발현되어 단백질을 추가로 만들어 내기 때문에 야생형과는 다른 발달 및 행동 차이를 보일 수 있습니다. 

하지만 도입된 외부 유전자가 발달이나 행동과는 관련이 없는 단백질을 만드는 경우에는 행동이나 발달과정의 차이가 관찰되지 않을 수도 있습니다. 특히 GFP나 RFP등의 형광단백질을 생산하는 유전자를 삽입한 경우에는 발달이나 행동의 변화없이 형광현미경을 이용한 형광단백질의 관찰을 통하여 특정 조직이나 세포의 발생 및 분화, 그리고 이동 과정을 관찰할 수 있는 형광리포터 제브라피쉬를 제조할 수 있습니다.

형질전환 제브라피쉬를 제조할 때에 외부 유전자를 발현시키기 위하여 사용한 프로모터의 종류에 따라서 외부 유전자가 발현되는 조직과 발현시기가 달라질 수 있으며, 따라서 외부유전자를 발현시키기 위하여 사용한 프로모터의 종류에 따라서 형질전환 제브라피쉬의 표현형이 달라지게 됩니다. 

형질전환 제브라피쉬를 제조하는 방법에는 외부 유전자를 발현하기 위해 필요한 프로모터를 확보하는 방법에 따라서 ① Tol2 transposon-based system 이용, ② E-coli based homologous recombination 방법, ③ knock-in 방법 등을 사용할 수 있습니다

형질전환 제브라피쉬는 필요한 조직특이적으로 형광단백질을 발현하는 재조합 DNA를 만들어서 제브라피쉬 배아에 microinjection하여 제작합니다.

1. 먼저 형광단백질을 발현시키고자 하는 조직에서 특이적으로 발현하는 프로모터를 확보합니다.

2. 조직특이적 프로모터와 형광유전자 또는 발현시키고 싶은 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 제조합니다.  

3. 형광유전자 발현을 위한 재조합 DNA의 제조에는 ① Tol2 transposon-based system 이용, ② E-coli based homologous recombination 방법, ③ knock-in 방법 등을 사용할 수 있습니다.

4. Microinjector를 이용하여, One-cell stage의 제브라피쉬 배아에 만들어진 재조합 DNA를 미세주입 합니다. 

5. 미세주입된 DNA는 배아의 발생과정을 거치며 개체의 유전체에 삽입됩니다. 

6. 재조합 DNA가 주입된 배아들을 성체까지 키운 후, 이들을 야생형(wildtype) 제브라피쉬와 교배하여 F1 세대의 배아를 확보합니다.

7. F1 세대에서 미세주입된 외부 재조합 DNA에 의한 형광발현을 확인함으로써 형광리포터 제브라피쉬를 확보합니다. 

그림 1. 형광리포터 제브라피쉬 제조과정 (출처: MATER METHODS. 2012;2:109.)

표 1. 형광리포터 제브라피쉬 제조방법에 따른 장단점 비교

제브라피쉬는 자연에서의 발생속도와 유사한 사육 조건을 제공해야합니다. 

1) 9 cm 직경 페트리디쉬에 10 ml의 Egg H₂O를 넣고 약 100개의 발생배를 넣으면 좋다.

    - Egg H₂O: 멸균증류수 945 ml에 다음 시약을 넣어준다

   (10ml 10mM NaH₂PO_4,  0.01M; 10ml 10mM Na₂HPO₄, 20ml 100mM Sodium Citrate, 15ml 100mM CaCl₂) 
 

2) 대조구가 죽은 것은 물고기가 알을 낳을 때 변과 같은 분비물을 같이 배출하기 때문에 부모의 장 환경에 따라 난막에 여러 병원성 미생물이 붙어 있을 수 있다. 특히, 질산성세균이 난의 발생을 악영향을 미치므로 breeding cage에서 최대한 빠른 시간 내 알을 회수하고 0.005%의 메틸렌블루가 있는 Egg H₂O에 약 1-2시간 정도는 배양 후, 메틸렌블루가 없는 Egg H₂O로 교환 후 배양한다.
 

실험에 희생한 제브라피쉬 유생과 성체 물고기가 최소한의 고통으로 떠날 수 있게 해야합니다. 

1. 유생

  - 7일 이하(7dpf): 락스(15%)원액을 사육수와 1:4로 섞은 후, 이 용액에 유생을 넣고 5분간 기다린 후 희생 확인

  - 8-15일: 약 4℃ 정도 찬물이 있는 페트리디쉬에 물고기를 넣고 얼음 위에 페트리디쉬를 올려 놓은 후  수분 정도 기다린 후 희생 확인

 2. 15일 이상~성체

   - 얼음마취(약 5-10분간 얼음에 담가둠) 후 이석이 있는 부분을 수술용 가위로 잘라줍니다. 

   - 0.4 % 이상 농도의 tricaine사용

제브라피쉬는 순환여과양식시스템(RAS: Recirculating Aquaculture System), 즉, 폐쇄 시스템에서 사육하기 때문에 물고기의 분비물 및 먹다남은 사료, 사료에서 용출되는 영양성분들이 시스템 물에 남아 순환하면서 병원성 미생물의 영양분으로 작용을 합니다. 가장 흔하게 발생하는 질병은 솔방울병과 아가미병입니다. 이러한 질병을 일으키는 원인균들이 존재하지만 수질관리에 의해 발병하는 것이 대부분입니다. 폐쇄 양육시설에서 순환하는 사육수가 모든 물고기에게 노출되기 때문에 사료 급이 후 남은 사료 제거 및 분비물 제거를 부지런히 해야합니다.

1. 세균성 질병: 세균성 질병은 만성적이고 실내사육 물고기에 자주 나타납니다. 치사율은 낮지만 특정 상황에서는 치명적일 수 있습니다.

  1) 피부 및 전신감염

    (1) 원인체: Aeromonads, Salmonicida, Pseudomonas spp., Edwardsiella spp., Streptococcus spp., Nocardia spp.

    (2) 증상: 피부에 육안으로 보이게 감염, 궤양성·괴사성 피부 및 지느러미 병변, 체표홍반, 출혈, 복막염, 전신부종

    (3) 치료 방법: 정확한 감염의 종류를 확인하여 적절한 항생제를 사용, 수질환경 개선

  2) 마이코박테리오시스

    (1) 원인체: Mycobacterium spp.

    (2) 증상: 다산감소, 무기력, 거식증, 수축, 피부궤양, 고열, 부종, 복부팽창

    (3) 치료 방법: 항생제가 잘 듣지 않기 때문에 감염된 물고기 제거, 수질 최적화, 엄격한 위생 및 검역, 감염된 시스템 및 부속품 소독

  3) 아기미질환 (BGD, Bacterial Gill Disease): 여러 세균 뿐만 아니라 고밀도사육 및 수질악화로도 발생

    (1)원인체: Aeromonads, Salmonicida, Pseudomonas spp., Edwardsiella spp., Streptococcus spp., Nocardia spp. Mycobacterium spp.등 여러 세균들

    (2) 증상: 호흡곤란(유영빈도 증가 혹은 물표면으로 유영빈도 증가, 심할 경우 궤양형성 및 근육내 출혈 관찰

    (3) 치료 방법: 6-15 ppm 클로라민 T로 약 1시간 약욕
 

2. 원생동물성 질병 

  1) 벨벳병 (Velvet Disease): 대표적인 외형변화가 체표비늘이 솔방울 모양처럼 뻗어 솔방울병이라고도 부름

    (1) 원인체: Piscinoodinium pollulare   

    (2) 증상: 체표 비늘이 솔방울처럼 뻗음, 아가미 염증, 저산소증, 삼투압 조절 장애, 2차 세균 감염, 먹이 감소

    (3) 치료 방법: 물 10L에 인공소금 1g을 넣은 소금물에 하루정도 약욕. Atabrine TM을 1회 1 mg/l로 3일간 투약, Chloroquine Hydro-Chloride로 침지

제브라피쉬를 건강하게 사육하기 위해서 청소 및 소독 절차는 매우 중요하며 사용하는 시설의 유형과 수조당 제브라피쉬의 수, 수조의 형태와 시스템 및 수질 등의 여러가지 조건에 따라 선택해야 합니다. 

1) 일반적인 청소 : 질병 전염의 가능성이 우려되지 않는 상황에서는 비누 및 화학적 소독제의 사용이 독소를 유발할 수 있으므로 될 수 있으면 피하는게 좋습니다. 청소 중 유량을 증가시키면 감염물질을 제거할 수 있고, zebrafish를 수집하는데 사용되는 그물과 같은 경우 화학적 소독제를 사용하여 멸균하여 감염의 가능성을 제거하는 것이 필요합니다. 

2) 화학적 소독제 및 세제 종류 : BCMB(Benzalkonium Chloride + Methylene Blue Solution), SH(Sodium Hypochloride (6.15% Bleach)), PPSC(Potassium Peroxymonosulfate + Sodium Chloride (37g/1gallon RO water)) 등

3) 소독제 사용방법 : 소독제에 수조를 각각 BCMB-30분, SH-5분이상, PPSC-30분 정도 담근 후 물로 철저히 헹궈내야 합니다. 

4) 주의사항 : 소독제 및 세제를 사용하여 폴리카보네이트 탱크를 청소하는 경우, 수중 환경의 비누 잔류물이 제브라피쉬의 몸에 쉽게 흡수되어 질병과 사망을 유발할 수 있으므로 물로 철저히 헹궈야 합니다. 탱크를 다시 채우기 전에 탈염소 또는 역삼투를 거친 깨끗하고 차가운 물로 여러 번 철저히 헹궈야 합니다. 작업 표면은 사용 전후에 청소해야 하며 물고기가 청소된 표면과 접촉하거나 청소 제품의 냄새가 나는 곳에서도 동일한 주의가 적용됩니다.