제브라피쉬가 얼마나 빨리 자라는지 그 속도를 사람이 자라는 속도와 비교해 보면 쉽게 이해될 것입니다. 수정 후 26시간 정도 지난 제브라피쉬는 3개월 된 태아와 매우 유사합니다. 우리 기관 중 가장 먼저 형성되고 활동을 하게 되는 것이 바로 심장입니다. 제브라피쉬의 경우도 심장이 가장 먼저 형성되고 일반적인 현미경 아래에서 심장박동을 수정 후 24 시간 이내에서 확인이 가능합니다. 발생과정이 빠르다는 것과 반투명하기 때문에 초기 발생과정에서 심장박동 뿐만 아니라 혈액의 흐름을 직접 눈으로 보고 확인할 수 있다는 것이 큰 장점입니다.

제브리피쉬의 노화는 사람의 노화와 매우 유사합니다. 제브라피쉬도 늙게 되면 허리가 휘고 피부 비늘(scale)도 거칠어지게 됩니다.  활동성도 감소하고 시간이 지나면 자연사 과정을 거치게 됩니다. 실험실의 안정적인 조건하에서 제브라피쉬를 키우게 되면 30개월령 물고기의 경우 대부분 노화 표현형을 보여줍니다. 
 

제브라피쉬 노화 모델로는 사람의 조로증을 모사하기 위해 비정상적인 Lamin A의 발현을 과량 유도한 개체가 있습니다. Lamin A는 세포막 구성에 매우 중요한 기능을 하는 단백질입니다. 이것이 비정상적인 형태로 발현되면 세포의 핵막이 쭈글쭈글해지며 급속히 노화됩니다. 아래 사진은 조로증 모델 제브라피쉬입니다. 정상적인 형태(WT)와는 다르게 조로증이 유발된 개체는 척추가 심하게 휘어져 있는 모양을 볼 수 있습니다.
 

* 그림출처: Koshimizu E et al. PLoS One. 2011;6(3):e17688.

형질전환이란 기존에 없던 형질을 가지게 되는 것입니다. 예를 들어 박테리아에 엠피실린 저항성 유전자를 도입하여 엠피실린이 존재하는 환경에서 살 수 있게 되었다면, 이 박테리아는 엠피실린 저항성을 가지게 된 것입니다. 이 때, 이 박테리아는 형질전환(transform) 되었다고 합니다.

제브라피쉬의 경우도 마찬가지 입니다. 기존에 없던 형질을 받아들이게 된 제브라피쉬는 형질전환이 된 것입니다. 다만 제브라피쉬가 외부 유전자를 안정적으로 받아들이게 되었다면 이 개체는 교배를 통해 안정적으로 보유 및 유지할 수 있게 됩니다. 이렇게 만들어진 개체를 strain이라고 합니다. 이런 strain은 유전적으로 안정하기 때문에 이렇게 만들어진 개체를 형질전환 제브라피쉬라고 하는데 영어로는 transgenic zebrafish라고 부르게 됩니다. –genic이란 어미가 붙게 되는 이유는 후대에 유전적으로 전해질 수 있기 때문입니다. 
 

아래 사진은 EGFP라는 형광단백질의 발현 조절이 가능한 형질전환된 제브라피쉬 개체입니다. 이 개체는 모든 신경에서 활성을 가지고 있는 elevl3 라는 유전자의 프로모터를 이용하여 EGFP를 발현시킨 것입니다. 따라서 초록색 형광이 모든 신경에서 발현하게 됩니다.
 

* 그림출처: Hong J et al. Commun Biol. 2021;4(1):1405.

제노프스에서 transplantation 실험은 eyebrow knife를 사용하여 진행합니다. 연구를 진행하기 위한 특정 세포를 eyebrow knife를 사용하여 잘라낸 후 다른 개체에 이식하는 방법으로 진행됩니다.

주로 lineage tracing을 위해 수행하게 되는데 GFP와 같은 tracer를 발현한 개체에서 확인하고자 하는 세포를 잘라낸 후 tracer가 없는 개체에 이식하여 조직이 어떤 식으로 발생하고 어떤 방향으로 세포들이 이동하여 조직을 형성하는지 확인 가능합니다.

* 그림출처: Tanaka EM et al. Dev Cell. 2011;21(1):172-185.

이런 transplantation을 사용한 실험을 사용하여 발생학 연구 시 중요한 fate map을 알아낼 수 있었습니다. 더불어 transplantation을 사용한 연구 중 발생과정에 중요한 역할을 하는 organizer들을 알아낸 실험도 존재합니다. 대표적으로 dorsal lip of blastopore를 다른 개체에 이식하여 2개의 머리를 만드는 실험으로 실험 방법은 동일하게 한 개체에서 dorsal lip of blastopore 부분만 다른 개체로 옮겨서 확인할 수 있습니다.

* 그림출처: Rivera AS. University of the Pacific. https://scholarlycommons.pacific.edu/open-images/16/

제노프스의 배아를 통해 행동분석 또한 가능합니다. 제노프스의 배아를 사용한 행동분석은 제노프스 배아의 swimming을 분석하여 진행합니다. 마우스를 사용한 open field 분석과 동일하게 배아의 swimming 속도, 방향 등을 측정하여 행동분석이 가능합니다. 또한 시각정보를 통한 행동분석도 가능한데 이 경우에는 배아가 헤엄치는 부분에 색상의 차이를 두어 배아가 어느 쪽의 색을 더 선호하는지 측정하는 방식으로 진행됩니다.
 

* 그림출처: Udoh UG et al. STAR Protoc. 2023;4(3):102422.

이런 배아의 시각정보를 사용하여 행동학습 연구도 가능합니다. 이 경우에도 동일하게 색상을 이용하여 진행하게 되는데 특정 색상위를 헤엄치게 되면 전기충격을 가하는 방식의 학습을 진행하여 행동분석을 수행합니다.

* 그림출처:  Blackiston DJ et al. Cold Spring Harb Protoc. 2012;2012(5):10.1101/pdb.top068338 pdb.top068338.

제노프스 배아는 난황(Yolk)을 포함하고 있어 형광 이미징을 진행 시 어려움이 존재할 수 있습니다. 특히 표피가 아닌 deep tissue 이미징을 진행할 시 난황과 더불어 배아 표피에 존재하는 pigment 또한 문제가 될 수 있습니다. 이를 방지하기 위하여 두가지의 방법을 사용해 이미징 퀄리티를 증가시킬 수 있습니다.

- Bleaching : 과산화수소를 사용하여 표피에 존재하는 pigment를 제거시켜주는 방법

- Clearing : 조직을 투명하게 만들어주는 기법으로 형광 이미징 진행을 원활하게 도와주는 방법

Clearing 기법은 여러 물질을 사용하여 진행할 수 있습니다. 가장 간단한 방법으로는 BA:BB solution을 사용하여 탈수시킨 조직을 투명화시키는 방법이 존재하지만 이는 탈수로 인한 조직의 변형이 일어날 수 있기 때문에 최근 여러 회사에서 개발되고 있는 clearing solution을 사용하여 진행 가능합니다.
 

제노프스에서 regeneration을 연구할 수 있는 방법으로는 제노프스 배아의 꼬리를 잘라 재생하는 것을 연구하는 방법이 사용됩니다. 제노프스의 꼬리에는 굉장히 많은 종류의 조직이 존재하고 있기 때문에 다양한 조직의 재생기전과 재생과정에서 조직간 일어나는 커뮤니케이션을 연구하기 굉장히 좋은 모델입니다. 실험은 특정 발생단계의 제노프스 배아 꼬리를 자른 후 재생되는 것을 확인하는 간단한 방법으로 이루어집니다.
 

* 그림출처: Love NR et al. BMC Dev Biol. 2011;11:70.

제노프스에서도 충분히 마우스와 비슷한 conditional knock-out을 수행할 수 있습니다. 이는 제노프스의 fate map을 확인한 후 이에 해당하는 세포에 유전자 조작을 수행하는 방법으로 진행됩니다. 제노프스를 연구하는 연구자들의 커뮤니티인 Xenbase에서 제노프스의 발생에 따른 fate map을 확인할 수 있습니다.
 

* 그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/xenbase/static/anatomy/xenbasefate.jsp

또한 Photocaged Morpholino Oligomers를 사용하면 UV light를 사용하여 특정 시기에만 유전자 발현을 조절할 수 있습니다.

* 그림출처: Deiters A et al. J Am Chem Soc. 2010;132(44):15644-15650.

제노프스 배아가 성장할 때 머리 구조는 neural crest 라고 불리는 전구세포로부터 발생하게 됩니다. Neural crest는 발생과정에서 이동하여 결합조직(connective tissue), 뼈, 연골, 근육, 신경 등으로 분화하게 됩니다. 이 과정에서 뼈의 형성은 먼저 중간엽 줄기세포(MSC)가 연골세포로 분화하여 먼저 연골을 형성하고 이후 골화가 진행되어 뼈가 만들어 집니다.
 

* 그림출처: Translational Orthopaedic Biomaterials Interest Group. https://www.tobig.eu/bone-101/bone-101/bone-formation-and-remodeling/

그렇기 때문에 제노프스의 머리 형성과정에서 먼저 형성되는 연골조직은 연골 관련 연구를 진행하기 매우 좋은 모델입니다. 또한 2-cell stage에서 한쪽 세포에만 유전자 발현을 조절하게 되면 오른쪽 또는 왼쪽 중 한곳에서만 유전자 발현 조절로 인한 문제가 나타나기 때문에 연구를 진행하기에 매우 간편한 모델이 됩니다. 제노프스의 머리 구조 연구는 연골을 염색할 수 있는 Alcian Blue staining 기법을 이용하거나 항체를 이용한 염색 기법으로 심화연구를 진행할 수 있습니다.
 

* 그림출처: Dubey A et al. Curr Pathobiol Rep. 2017;5(1):79-92.

Nodal cilia는 left-right asymmetry를 형성하는 초기 배아에서 굉장히 중요한 기관입니다. 이런 nodal cilia는 사람에는 node에, mouse는 notochord에, zebrafish에서는 Kuffer’s vesicle에 존재한다고 알려져 있습니다. 제노프스에서 이런 nodal cilia를 연구하기 위해서는 gestrocoel roof plate(GRP) 를 확인하여야 합니다.

* 그림출처: Blum M et al. Development. 2014;141(8):1603-1613.

제노프스의 발생과정에서 온도는 배아의 발생 속도를 조절하는 가장 중요한 요소입니다. 유전자의 조작없이 온도 조절만으로 제노프스의 배아 성장 속도를 조절해 필요한 발생 단계를 쉽게 얻을 수 있습니다.

온도에 따른 제노프스 발생 단계까지 걸리는 시간은 제노프스 연구자 커뮤니티인 Xenbase에서 확인 가능합니다. 다만 morpholino를 사용한 유전자 발현 저해시 낮은 온도는 추천하지 않습니다. 이는 unspecific한 binding이 증가하여 특이적으로 binding 해야하는 morpholino의 작용을 저해시킬 가능성이 높기 때문입니다. 반대로 CRISPR/Cas9을 사용한 유전자 조작시에는 Xenopus laevis의 경우 처음 6시간동안 12℃ incubation 후 22℃ incubation이 더 효과적이라는 보고가 있습니다.