연구실에서 사용되는 예쁜꼬마선충의 야생형(Wild Isolate)은 N2 strain이고, 영국의 브리스톨(Bristol) 근교에서 채집되었습니다. 선충 연구실에서는 주로 이 야생형 N2를 기반으로 하여 돌연변이체를 만듭니다. 예쁜꼬마선충의 돌연변이체는 다른 모델생물처럼 유전자 변형을 통해 만들 수 있기 때문에 종류가 매우 다양합니다. 예를 들어, N2보다 수명이 2배 이상 긴 돌연변이체는 대사 관련 유전자인 daf-2의 일부 서열에 돌연변이가 일어나 형성됩니다. 형광 단백질이 발현되는 돌연변이체는 형광 단백질을 암호화하는 외부 유전자를 삽입시켜 만들고 형질전환체(Transgenic Animal)이라고 부릅니다.

예쁜꼬마선충의 돌연변이체는 다음과 같은 방식을 통해 만들 수 있습니다.

과거에는 무작위적인 변이, 주로 100bp 이상의 긴 결손(Deletion)을 일으킨 후에 원하는 유전자의 돌연변이체를 찾아가는 방식(Genome-Wide or Target-Selected Mutagenesis)을 주로 사용하였고, 기존에 존재하지 않는 새로운 돌연변이체나 특정한 돌연변이를 필요로 하는 경우에 Gene-Targeted Mutagenesis 방식도 다수 사용하고 있습니다. 특히 크리스퍼(CRISPR) 기술의 발전 이후에는 특정 유전자의 돌연변이 제작이 훨씬 용이해짐에 따라 Gene-Targeted Mutagenesis 방식도 널리 사용되는 추세입니다.

필요로 하는 돌연변이체는 다음과 같은 사이트를 통해 확인할 수 있습니다.

1) 예쁜꼬마선충은 액체 배지에서도 배양이 가능합니다. 다량의 예쁜꼬마선충 샘플이 필요한 경우 등에 액체 배양법을 사용합니다.

2) 예쁜꼬마선충의 대표적인 액체 배지로 S-medium이 있습니다. 이 배지에 선충의 먹이인 대장균(E. coli OP50)을 넣어주어 선충을 배양합니다. 적절한 배양 환경을 위해 20℃ 배양기를 사용하며, 추가적으로 산소가 공급될 수 있도록 쉐이커(Shaker)를 이용하면 좋습니다. 더 자세한 배양 방법이 궁금하다면, WormBook에 출간된 ‘Maintenance of C. elegans’를 참고하면 좋습니다.

3) 액체 배지에서 배양할 경우, 고체 배지에서 배양한 개체보다 몸이 가늘고 길며 알을 품는 경향이 있습니다.
 

세균이나 곰팡이 등으로 배지가 오염되었을 때는 새로운 배지에 옮기거나 Bleaching 방법을 사용하여 제거할 수 있습니다. 대부분의 오염 물질은 선충을 해치지 않지만, 배지가 깨끗할 때 실험을 하기 용이합니다. 
 

1) 새로운 배지에 옮기는 방법

  - 준비물: NGM 배지

  - 과정

    (1) NGM 배지의 일부를 잘라내어 새 배지에 올립니다. 

    (2)선충이 기어 나오면 또 다른 새 배지에 옮깁니다. 

    (3) (1)-(2) 과정을 반복합니다.

2) Bleaching 방법

  - 준비물: 5% Sodium hypochlorite (NaClO) 1ml, 5M NaOH 0.5ml, 물 3.5ml

  - 과정

    (1) 5% Sodium hypochlorite (NaClO) 1ml, 5M NaOH 0.5ml, 물 3.5ml 를 섞은 표백 용액을 만듭니다. 

    (2) 오염된 배지의 선충을 튜브에 모아 표백 용액을 넣고 4분에서 최대 6분 동안 vortexing 하면 선충의 알(embryo)만 남게 됩니다. 

    (3) 4번 이상 물로 헹군 뒤 알을 새로운 배지에 옮깁니다.
 

예쁜꼬마선충은 액체 질소 (-196°C) 및 deep freezer (-80°C)에서 오랜 기간 저장이 가능합니다. 예쁜꼬마선충의 ice-binding proteins (IBPs) 등이 저온 충격(cold shock) 및 동결 시 생존율을 향상시키는 데에 도움을 주기 때문입니다. 저온 동결 방법에는 크게 Liquid Freezing Solution과 Soft Agar Freezing Solution을 이용한 방법이 있습니다.

1) Liquid Freezing Solution을 이용한 동결 및 해동

  - 준비물: S buffer (129ml 0.05M K₂HPO₄, 871ml 0.05M KH₂PO₄, 5.85g NaCl), 글리세린

  - 과정:

    (1) S buffer와 30%의 글리세린을 넣은 튜브 바이알에 L1-2단계가 다량 포함된 굶은 선충을 함께 넣고 -80°C에서 동결합니다. 

    (2) 해동 시에는 액체가 될 때까지 실온에서 녹인 후 NGM 배지로 옮겨 배양합니다.

2) Soft Agar Freezing Solution을 이용한 동결 및 해동

  -  준비물: S buffer (129ml 0.05M K₂HPO₄, 871ml 0.05M KH₂PO₄, 5.85g NaCl), Soft Agar Freezing Solution (0.58g NaCl, 0.68g K₂HPO₄, 30g 글리세롤, 0.56ml 1M NaOH, 0.4g 한천, H₂O up to 100ml)

  - 과정:

    (1) S buffer 와 Soft Agar Freezing Solution을 1:1로 섞은 용액에 L1-2단계가 다량 포함된 굶은 선충을 넣고 -80°C에서 동결합니다. 

    (2) 해동 시에는 얼린 용액의 일부를 조각 내어 NGM 배지로 옮겨 배양합니다. 

같은 C57BL/6가 맞습니다. 같은 계통이라고 하더라도 hair cycle에 따라 피부 색이 다르게 관찰될 수 있습니다. 모발 성장 주기(Hair Cycle)는 보통 모낭의 성장기인 Anagen, 퇴행기인 Catagen, 휴지기인 Telogen으로 구분되는데 피부색소는 모구(Hair Bulb)에서 모낭(Hair Follicle)이 모섬유(Hair Fiber)로 변화될때 활발하게 생산됩니다. 색소 침착은 성장기(Anagen)의 중반에서 후반에 가장 많이 진행되며, 휴지기(Telogen)에는 생산되지 않습니다. 또한, 노화나 외상에 의해서도 색소가 모낭에서 빠져나와 대식세포(Macrophage)에게 포식되기도 하는데 이러한 작용들로 인해 피부색깔이 약간씩 변할 수 있습니다. 

* 그림출처: 가톨릭대학교 의생명산업연구원 실험동물연구센터

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마우스에서의 다툼(fighting)은 주로 수컷에서 호발하는데 영역다툼과 계층간 우위 선점으로 인한 현상으로 여겨집니다. 야생에서 수컷 마우스는 계층사회로 상위계급이 하위계급에 비해 먹이를 비롯한 자원에 대한 접근성의 우위를 갖게 되며, 서열이 지켜지지 못하였을 경우 상위계급 동물이 하위계급 동물을 공격을 하게 됩니다. 수컷 마우스는 또한 영역을 확보하는 특성을 지니고 있어 자신의 영역에 냄새로 표시를 하게 되는데 자신의 영역 내에 들어온 낯선 수컷은 침입자로 간주하어 적대시하게 되므로 다툼이 발생됩니다. 

자연상태에서 이러한 다툼이 발생될 경우, 하위 계급 동물 또는 침입자는 복종하는 자세를 취하거나 도망가는 등의 행동으로 피할 수 있는데 케이지에서 사육되는 실험동물은 피할 수 있는 공간이 한정되어 심하게 상처를 입거나 불임이 되고 심하게는 죽는 경우가 발생하기도 합니다. 

따라서 4주령 이상의 성성숙이 완료된 수컷 개체들에서 다툼이 확인되면 별도의 케이지에 분리해주는 것이 적절하며, 동물들이 숨을 수 있는 마우스하우스, 튜브 등의 구조물과 nesting 할 수 있는 물품들을 제공하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 

* 그림출처: 가톨릭대학교 의생명산업연구원 실험동물연구센터 

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토끼는 하루 20~350ml/kg (평균 130ml/kg/day)의 소변을 배출하며, 사람과 동일 방법으로 소변 검사용 키트를 이용하여 소변 중 혈액(Blood), 빌리루빈(Bilirubin), 유로빌리노겐(Urobilinogen), 케톤체(Ketones), 단백질(Protein), 아질산염(Nitrite), 포도당(Glucose), pH, 비중(Specific Gravity), 백혈구(Leucocytes), 색깔 등을 검사할 수 있습니다.  채식을 하는 토끼의 소변은 알칼리성 (pH.8~9, 평균 8.2 )이며, 비중이 1.003~1.036 (평균 1.015)으로 먹이의 종류나 건강상태에 따라 흰색, 연노란색, 연갈색 등을 나타낼 수 있습니다. 젊고 건강한 토끼에서는 종종 소변에서 알부민이 확인될수 있으며 성체에서는 단백질도 나타날 수 있으나 양이 증가할 경우 신장손상의 가능성이 있습니다. 포도당(Glucose), 케톤체, 빌리루빈은 정상 개체에서 나타나지 않습니다. 적혈구는 매우 적은 수(0~3cells/hpf, High-Power Field)가 확인될 수 있으나, 증가했을 경우 신장손상이나 감염 등을 의심할 수 있습니다. 

* 그림출처: 가톨릭대학교 의생명산업연구원 실험동물연구센터

소변을 채취하는 방법은 케이지에 배변판을 설치하거나 바닥에 풀어놓고 자유롭게 돌아다니게 하면서 채취할 수 있습니다. 일반적인 포유류가 장을 통해 칼슘을 흡수하고 분변을 통해 배출하는 것과 달리, 토끼는 대부분 신장을 통해 칼슘이 배출되며 알칼리성의 소변에서 칼슘이 침전되어 찐득(thick)하고 크리미(creamy)한 형태를 나타냅니다.  

* 그림출처: 가톨릭대학교 의생명산업연구원 실험동물연구센터

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토끼는 주로 귀정맥(marginal ear vein①)과 귀동맥(central ear artery②)에서 채혈을 할 수 있으며, 사람과 같은 방법으로 솜이나 부드러운 거즈를 이용하여 압박지혈을 합니다. 토끼귀의 혈관은 몸통에서 뻗어 나와 귀의 가운데로 주행하는 귀동맥(②)이 끝부분에서 양쪽으로 갈라져 귀정맥(①)으로 나눠져서 1개의 동맥과 2개의 정맥에서 채혈을 할 수 있습니다. 목적에 따라 정맥과 동맥 중에 선택하여 채혈을 할 수 있으며, 채혈 후 지혈을 확실히 해야 하는데, 특히 귀동맥(②)으로 채혈 할 경우 지혈을 더 오래 해야 합니다. 

건강한 성체에서 한번에 채혈할 수 있는 혈액량은 0.5~10ml 정도로 토끼의 크기와 계통에 따라 다를 수 있습니다. 채혈양이 많거나 반복적인 채혈을 했을 경우 채혈양만큼 피하수액(로 미지근하게 데운 생리식염수, ~10ml)을 투여하는 방법을 추천합니다.

아래의 사진은 토끼에서 귀정맥을 이용한 채혈 과정을 보여주고 있습니다.

  1) 채혈하기 10~15분 전에 손가락 한마디 정도의 국소마취크림(EMLA Cream)을 채혈하려는 혈관 위에 두툼하게 발라줍니다. 국소마취를 하지 않으면 바늘 삽입 시 토끼가 움직여서 실패할 확률이 높습니다.

  2) 채혈하기 전에 토끼는 담요 등을 이용하여 보정하거나 약물을 사용하여 진정시켜줍니다. 하지만 진정제 등의 약물을 투여했을 경우 혈관 확장이 잘 되지 않을 수 있습니다. 2인 1조로 한사람이 보정을 하고 다른 한사람이 채혈하는 것이 좋습니다.

  3) 채혈하려는 귀를 따뜻하게 하거나 부드럽게 자극을 주여 혈관을 확장시켜줍니다. 클리퍼로 채혈할 부위의 털을 약간씩 밀어줘도 됩니다. 특히 바깥쪽 혈관을 이용할 때는 제모를 해야 혈관이 잘 보입니다.

  4) 24G IV 카테터(catheter) 또는 19~23G 나비침(butterfly needle)을 정맥 또는 동맥에 삽입하고 주사기를 연결하여 천천히 채혈을 합니다. 혈관 내에 카테터를 삽입하는 방법이 어려울 경우 실험동물수의사 등의 전문가나 경험이 있는 사람에게 교육을 받고 진행하는 것을 추천합니다. 또한 귀정맥은 채혈 뿐만 아니라 약물의 투여경로로도 사용됩니다. 

  5) 필요한 양의 채혈이 완료되면 혈관내 카테터를 부드럽게 제거하고 마른 솜으로 2~5분간 압박하여 지혈을 합니다. 동맥으로 채혈했을 경우가 지혈 시간이 훨씬 길어집니다. 피가 완전히 멎은 것을 확인하고 동물을 케이지에 넣어야 합니다.

[귀정맥을 이용한 채혈 또는 약물 투여 순서]

* 그림출처: 가톨릭대학교 의생명산업연구원 실험동물센터
 

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C57BL/6가 아형(substrain)으로 갈라져서 The Jackson Laboratory에서 사육되면 C57BL/6J로, National Institutes of Health(NIH)에서 키워진 마우스를 C57BL/6N이라고 합니다. 
 

1921년 C.C. Little에 의해 확립된 C57BL은 1937년에 C57BL/6와 C57BL/10으로 아계(substrain)가 나뉘었는데요. 이 중 1948년에 C57BL/6의 24대 자손(F24)이 The Jax.(The Jackson Laboratory)로 옮겨져 C57BL/6J로 확립되었고, 그런 후 The Jax.에서 32대 자손(F32)이 1951년에 National Institutes of Health(NIH)로 건너가 C57BL/6N이 되었습니다. 이렇게 같은 계통(strain)이라 하더라도 이후에 차이가 확인될 경우 계통명 뒤에 슬래시(/) 표기 후 세대수, 기관의 명칭(J, N 등) 등을 붙이고 아형(substrain)으로 구분하며, 이동된 기관에 대한 표기도 함께 할수 있는데요. 예를 들어 C57BL/6NTac은 C57BL/6의 151대 자손(F151)이 1991년에 NIH(C57BL/6N)에서 Taconic Farms으로 옮겨져서 만들어졌으며 이에 대한 표기를 C57BL/6NTac로 한 것입니다.

C57BL/6J와 C57BL/6N의 유전적 차이는 확립 초기에는 12 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)s 정도였으나, 이후에 점점 증가되어 2013년에 발표된 논문에 따르면 34 SNPs가 다른 것이 확인되었습니다. 이처럼 같은 조상에서 갈라져 나왔으나 키워진 장소가 다른 채로 오랜 시간이 지나게 되면서 유전적 변이가 확인되었는데요. 이로 인해 연구결과에 영향을 미칠 수 있는 부분들도 많은 것으로 발표되고 있습니다.
 

따라서 본인이 진행하는 실험에 어떤 substrain이 사용되어야 하는지 충분히 검토 후 실험을 진행해야 합니다. 

[예시]  
 

- F1N.Scn1a +/−(C57BL/6N background)가 F1J.Scn1a +/− (C57BL/6J background) 에 비해 hyperthermia‐induced seizure가 잘 유도됨.

- 수컷 C57BL/6J가 C57BL/6N에 비해 로타로드 측정(rotarod assay)에서 운동적응력(motor coordination)이 높았고, 조건부 공포(conditional fear)의 정도가 감소된 것이 확인됨.
 

국내에서 생산되는 업체별 C57BL/6의 아형은 다음과 같습니다. 

- 오리엔트바이오: C57BL/6NCrljOri (http://www.orientbio.co.kr/sub2/sub1_1.asp?cate1=1001&cate2=2002)

- 코아텍: C57BL/6NHsd (http://www.koatech.co.kr/sub02/01.php)

- 샘타코: C57BL/6NTacSam (http://www.samtako.com/bbs/board.php?bo_table=b1#)

국내에서 생산되는 C57BL/6은 대부분 C57BL/6N이므로, C57BL/6J로 실험을 진행해야 할 경우 수입업체를 통해 The Jackson Laboratory로부터 직접 수입을 하거나 일본 등에서 유지되고 있는 C57BL/6J(생산업체 SLC)를 수입하면 됩니다.
수입대행업체: 두열바이오텍, 라온바이오, 새론바이오, 오리엔트바이오, 중앙실험동물 등

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꼬리가 빨갛게 부었거나 상처가 없다면, 이렇게 꼬리가 휜 경우는 kinked tail(knk) 유전자로 인한 변이(mutation)로 보입니다. knk heterozygote인 경우, 꼬리 척추의 기형(dysmorphology)과 융합(vertebral fusion)으로 꼬리가 휜 형태로 태어나며 homozygote는 발생과정에서 사산됩니다. 이러한 증상은 기형으로 번식에 사용하는 것은 바람직하지 않으며 척추 또는 발생 과정의 실험에도 배제하는 것이 적절합니다.

* 그림 출처: 가톨릭대학교 의생명사업연구원 실험동물연구센터

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