1. 경추탈구 방법의 적용

-실험의 목적에 따라 시료 채취를 위해 안락사용 약물을 이용할 수 없을 때 사용하는 물리적 안락사 방법입니다¹. 

-마우스 외에 랫드, 조류, 미성숙한 토끼에서 시행할 수 있는 방법입니다².  

-연구자는 실험 목적에 따른 물리적 경추탈구가 필요한 과학적 정당성을 제시하여 IACUC에 승인 받아야 합니다.

2. 경추탈구 방법의 주의 사항

-동물에게 고통을 주지 않도록 성공적으로 신속하게 경추탈구를 하기 위해 연구자는 사체나 마취된 동물을 이용하여 충분히 연습해서 숙련되어야 합니다. 또한 CO₂ gas 또는 약물을 함께 사용하는 것을 적극 고려해야 합니다^{3, 4}. 

-경추탈구 방법은 이를 수행하거나 관찰하는 사람에게 심리적으로 불편한 감정을 줄 수 있으므로 이 방법을 결정하고 지시하는 관리자와 감독자는 이 문제에 대해 민감하게 고려해야 합니다^{5, 6, 7, 8}.
 

1. 마취제 vs 진통제 

전신마취제는 중추신경계통에 영향을 주어 의식소실을 일으키므로 결과적으로 수술 중에는 환자가 통증을 느끼지 못합니다. 진통제는 의식을 유지한 채로 신경전달물질의 전달을 억제하거나 통증중추에 작용하여 일정시간 동안 통증을 완화시킵니다.

2. 선제적 진통제의 필요성

선제적 진통제 투여는 수술 전 및 수술 중에 진통제를 투여하는 절차를 말합니다. 선제적 진통제 투여는 수술 중 환자의 안전성을 향상시키고 수술 후 경험하는 통증을 줄여 수술 후 관리와 환자의 복지에 좋은 영향을 줍니다¹. 진통제 뿐만 아니라 국소마취제 또한 의식소실 없이 진통효과를 나타내므로 선제적 진통제로 사용됩니다. 

1. 비약물적 통증관리의 필요성

수술 후 통증관리와 실험으로 인한 통증관리를 위해서 일차적으로 진통제를 이용한 약물적 처치가 고려되어야 합니다. 단, 약물의 이용이 실험에 미치는 방해요소라는 증거가 확실할 경우, 비약물적 통증관리 절차를 계획하여 IACUC의 승인을 받아야 합니다.  
NRC 가이드에 따르면, 통증의 비약물적 조절 또한 효과적이므로 수술 후 또는 시술 전후 관리로서 고려하라고 제안하고 있습니다¹. 비약물적 통증관리를 시행할 경우에는 진통약물을 이용하는 경우보다 더 자주 동물을 관찰하여 기록하고 그 경과의 효과를 신속하게 평가해야 합니다. 

2. 비약물적 통증관리 방법 

-회복 및 휴식공간 또는 environmental enrichment 의 제공: 소음이 없고 어두운 조명, 체온유지가 가능한 안락하고 따뜻한 장소나 엔리치먼트 도구(house, nesting 등), 가온패드

-상처와 수술부위의 적절한 소독과 드레싱(bandage) 관리
-경구 또는 비경구 수액 처치, 기호성 높은 보조적 식이의 제공
-국소마취제(lidocaine, bupivacaine) 연고나 주사제를 이용한 통증관리

예) 척수손상 수술 후 배뇨장애가 예상될 경우, 사료의 섭취가 어려울 수 있으므로 바닥에 사료를 놓아 주거나 부드럽고 기호도 높은 보조식이를 제공하고 인공적 배뇨를 위해 하루 2회 이상 복부 마사지 관리
예) 수술 후 봉합부위의 진통을 위해 수술 후 3일 이상 리도카인 마취제 연고를 하루 2번 술부에 적용
 

1. 오가노이드 정의
오가노이드(Organoid)란 장기를 뜻하는 “Organ”과 유사함을 뜻하는 접미사 “oid”가 결합된 신조어로 실험실에서 인위적으로 만든 3차원 세포 응집체 즉, 장기 유사체를 의미합니다¹. 2009년 네덜란드 후브레히트 연구소의 Hans Clevers가 주도한 연구에서 마우스 내부 장기의 줄기세포로 작은 장기를 만들어 ‘오가노이드’라는 명칭을 붙였습니다². 1차 조직인 인체유래 암조직 또는 정상조직으로부터 유래한 세포나 배아줄기세포(ESC), 유도만능줄기세포(iPSC) 등 다양한 세포를 3차원 배양법으로 응집하여 배양한 단순화된 장기유사체입니다. 
 

2. 오가노이드의 장점과 단점
2차원 세포배양과 유사하여 조작이 간단하면서 세포보다 생체장기와 높은 유사성을 보이기 때문에 동물모델보다 윤리적, 경제적으로 부담이 적은 유력한 실험모델로 평가되고 있습니다³. 기존 2차원 세포 모델에서 관찰하기 어려운 조직 내 세포 간 상호작용, 세포 이동, 약물 분포 등 복합적인 정보를 획득할 수 있으므로 조직의 구조 및 기능 측면에서 높은 재현성을 나타냅니다⁴. 그러나 3차원 모델로의 활용이 기대되고 있으나 실제 조직의 혈관 등 복잡한 환경 구현이 어려운 한계를 보입니다⁵.

3.  오가노이드의 응용
향후 심화 기술 개발을 통한 장기의 크기 확대가 이루어지면 장기 이식 및 세포 치료에 사용될 수 있을 것으로 바이오 산업 분야에서 기대하고 있습니다⁶. 주요 응용 분야에는 질환 모델링, 약물 스크리닝, 재생의료, 감염병 연구, 약물평가 등이 있습니다^{7, 8}. 

백색지방은 전신에 광범위하게 분포되어 있으나 갈색지방은 견갑부, 액와부, 신장 주위, 흉각 내 등에 한정되어 분포되어 있으며 갈색 지방의 양은 보통 마우스 체중의 1% 이내로 알려져 있습니다.

백색지방과 갈색지방의 주요한 차이점은 백색지방조직(White Adipose Tissue)은 에너지를 저장하는 역할을 하는 반면, 갈색지방조직(Brown Adipose Tissue)은 철분을 다량 함유하고 있는 갈색 미토콘드리아가 다수 존재하여 갈색을 띠며 열을 발생시켜 체온을 유지하고 에너지를 소모시키는 역할을 합니다.

마이코플라즈마(Mycoplasma)에 오염된 세포는 동물실험에 사용해서는 안 됩니다. 세포가 마이코플라즈마에 오염되면 형태적, 기능적 이상을 일으켜 세포의 대사 및 성장 저해, 모양의 변화, 단백질 및 유전자 발현 변화, transfection 시 효율 저하 등의 변화가 일어나 세포의 고유한 특성을 잃게 됩니다. 또한 오염된 세포를 barrier 시설 내로 반입하여 동물실험을 수행할 경우 미생물 감염사고의 원인이 될 수 있습니다. Hans G Drexler 등의 연구¹에 따르면 primary cell culture의 1%, 초기 계대배양세포 중 5%, 사람 또는 동물 세포를 연속 배양할 경우 15~35%가 세포배양 시 마이코플라즈마에 오염되었다는 보고도 있습니다. 마이코플라즈마 오염 여부는 세포 펠렛 또는 세포 배양액을 이용한 PCR 검사로 비교적 간단하게 확인할 수 있습니다. 

* Mycoplasma 란?

자가 증식 능력을 가진 매우 작은 크기(0.2~0.8μm)의 원핵 생물로 일반적인 필터로는 제거할 수 없음. 세포 벽이 없기 때문에 페니실린 계열의 항생제는 예방에 효과가 없으며 광학 현미경으로는 관찰이 불가능하여 오염 여부를 확인하기 어려움. 

마취에 대한 부작용 중 하나로 각막이 건조되고 손상되어 각막 궤양이 발생할 수 있습니다. 눈동자 가로 방향으로 흰색 또는 회색의 띠모양이 관찰되는데 이를 띠모양각막병증(Band Keratopathy)라고 합니다. 주로 ketamine과 xylazine을 이용한 마취 시 자주 관찰될 수 있습니다. 이러한 증상을 예방하기 위하여 Yohimbine(Xylazine의 길항제)을 사용하여 마취를 즉시 깨우거나, 마취 동안 각막이 건조되는 것을 예방하기 위하여 안 연고 등 사용을 고려해 볼 수 있습니다. 

* 그림출처: 왼) Koehn D et al. PLoS One. 2015.  오) 2022년 KCLAM LOOK2002 전현정 박사 발표자료

동물이용 생물안전 2등급(ABSL2)시설을 안전하게 이용하기 위해서는 다음과 같은 사항에 주의해야 합니다.

- 감염구역의 동물실을 출입하는 인원은 사전에 이용방법에 대한 추가 교육, 건강검진 및 필요시 백신 접종 등을 받아야 합니다. 

- 감염구역에 출입할 때에는 적절한 개인보호장비를 착용하도록 합니다. 특히 에어로졸이 발생할 가능성이 높은 경우를 포함하여 감염 물질을 사용하는 모든 활동에는 이중 장갑의 착용 및 N95 호흡기와 안전고글의 사용을 권고 합니다.

- 깔짚 교환시는 에어로졸의 발생을 최소화하기 위하여 2등급의 케이지 체인지 스테이션 위에서 작업하도록 합니다. 감염 물질을 다루는 모든 작업은 생물안전작업대 내에서 수행해야 하며, 만약 생물안전작업대 사용이 어려울 경우 개인보호장구와 더불어 다른 일차적인 안전 장치를 사용해야 합니다.

- 실험종료 후 실험실을 떠나기 전 및 오염이 확인되거나 오염이 의심되는 물질을 다룬 후에는 반드시 작업대 표면을 적절한 소독약으로 닦아서 오염물질을 제거해야 합니다. 또한 생물학적 위해 물질을 엎질렀을 때에는 biohazard spill kit를 사용하여 즉시 오염을 제거하도록 합니다.

- 사용한 케이지는 멸균 전까지 복도에 보관 시 반드시 필터가 있는 케이지 뚜껑 등으로 덮어두어야 합니다. 
- ABSL-2 구역에서 사용한 깔짚을 비롯하여 감염을 유발할 수 있는 모든 물질 (조직, 사체, 깔짚, 사료, 주사기 혹은 그 외의 폐기물 등)은 사육 구역을 벗어나기 전에 고압증기 멸균 또는 화학약품처리 등 생물학적 활성을 제거할 수 있는 과정을 거쳐야 합니다.
 

생물학적 활력이 동일 연령대의 다른 동물과 비교하여 현저하게 떨어져 있거나, 극심한 통증 반응으로 동물을 유지하기 어렵다고 판단되는 경우에는 설정된 인도적인 종료시점에 따라 안락사를 실시하여야 합니다. 

이 때 감염 실험 혹은 LD₅₀ 측정 등 사망을 종료시점으로 설정한 경우에도, 동물이 빈사상태에 이르러 더 이상 회생가능성이 없다고 판단되면 죽음으로 간주하고 인도적으로 안락사를 진행해야 합니다. 혹은 체중측정을 동반하는 lethal challenge의 경우에도 체중변화 및 기타 임상증상 등에 따른 scoring system을 활용(예: 20% 체중감소, 4℃ 이상 체온 저하 등)하여 종료시점을 적용하는 것이 가능합니다.

만성독성시험의 경우 해당 실험동물 생존율의 중간값 또는 그 이상 실험하는 경우 반드시 실험동물수의사와 협의하여 안락사를 위한 종료시점 범위를 확립할 수 있습니다. 백신 실험 중 paresis, paralysis, and/or convulsions 등의 증상을 보이는 동물은 사망으로 간주하여 인도적으로 안락사 할 수 있습니다.
 

이산화탄소를 이용한 안락사는 설치류에서 흔히 사용되는 방법으로 이산화탄소의 빠른 억제작용 및 진통, 마취 효과는 잘 알려져 있으며 또한 저렴하고 비인화성으로 잘 구비된 장비와 함께 사용시 사용자에 대한 위험성도 낮습니다. 이 때 고통이나 스트레스를 동반하지 않고 빠른 시간 내에 무의식 및 안락사를 유도하기 위해서는 이산화탄소의 농도가 중요합니다.

낮은 농도의 CO₂(6% 내지 10%)에 장기간 노출되면 랫드의 코르티코스테론 및 개의 코르티솔이 증가하는 것으로 밝혀져 있으며, 반대로 너무 높은 농도인 100% CO₂에 30초 동안 노출되는 경우에도 노르에피네프린이 증가하는 등의 스트레스 반응 유발된다고 합니다. 따라서 사전에 이산화탄소가 채워진 안락사 chamber에 동물을 넣는 것은 좋은 안락사 방법이 아닙니다. 또한 이산화탄소와 함께 산소를 공급하는 방법도 다른 수단에 의한 안락사보다 시간이 더 걸릴 수 있으므로 추천하지 않습니다. 

이와 반대로 점진적 충전 방법(30~70% chamber volume/min)을 사용한 이산화탄소 노출은 의식불명 시작 전에 carbonic acid에 의한 수용체 활성화로 인한 통증을 유발할 가능성이 적습니다. 마취 농도의 점진적 충전 방법을 사용할 때에는 호흡 정지 후 최소 1분 동안 CO₂ 흐름을 유지해야 합니다. 

Chamber 내의 동물이 호흡과 의식을 완전히 소실할 때까지 기다린 후(약 3~5분 소요) 동물을 꺼내어 심장이 정지되었는지 확인해야 합니다. 또한 신생 동물의 경우 이산화탄소에 의한 저산소증에 대해 저항력이 강하여 죽음에 이르기까지 보다 오랜 시간(최소 1.5배)이 필요하므로 마취제의 주사나 경추 탈골, 단두 등의 방법도 고려해야 합니다.