형질전환 제브라피쉬는 필요한 조직특이적으로 형광단백질을 발현하는 재조합 DNA를 만들어서 제브라피쉬 배아에 microinjection하여 제작합니다.

1. 먼저 형광단백질을 발현시키고자 하는 조직에서 특이적으로 발현하는 프로모터를 확보합니다.

2. 조직특이적 프로모터와 형광유전자 또는 발현시키고 싶은 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 제조합니다.  

3. 형광유전자 발현을 위한 재조합 DNA의 제조에는 ① Tol2 transposon-based system 이용, ② E-coli based homologous recombination 방법, ③ knock-in 방법 등을 사용할 수 있습니다.

4. Microinjector를 이용하여, One-cell stage의 제브라피쉬 배아에 만들어진 재조합 DNA를 미세주입 합니다. 

5. 미세주입된 DNA는 배아의 발생과정을 거치며 개체의 유전체에 삽입됩니다. 

6. 재조합 DNA가 주입된 배아들을 성체까지 키운 후, 이들을 야생형(wildtype) 제브라피쉬와 교배하여 F1 세대의 배아를 확보합니다.

7. F1 세대에서 미세주입된 외부 재조합 DNA에 의한 형광발현을 확인함으로써 형광리포터 제브라피쉬를 확보합니다. 

그림 1. 형광리포터 제브라피쉬 제조과정 (출처: MATER METHODS. 2012;2:109.)

표 1. 형광리포터 제브라피쉬 제조방법에 따른 장단점 비교

제브라피쉬는 자연에서의 발생속도와 유사한 사육 조건을 제공해야합니다. 

1) 9 cm 직경 페트리디쉬에 10 ml의 Egg H₂O를 넣고 약 100개의 발생배를 넣으면 좋다.

    - Egg H₂O: 멸균증류수 945 ml에 다음 시약을 넣어준다

   (10ml 10mM NaH₂PO_4,  0.01M; 10ml 10mM Na₂HPO₄, 20ml 100mM Sodium Citrate, 15ml 100mM CaCl₂) 
 

2) 대조구가 죽은 것은 물고기가 알을 낳을 때 변과 같은 분비물을 같이 배출하기 때문에 부모의 장 환경에 따라 난막에 여러 병원성 미생물이 붙어 있을 수 있다. 특히, 질산성세균이 난의 발생을 악영향을 미치므로 breeding cage에서 최대한 빠른 시간 내 알을 회수하고 0.005%의 메틸렌블루가 있는 Egg H₂O에 약 1-2시간 정도는 배양 후, 메틸렌블루가 없는 Egg H₂O로 교환 후 배양한다.
 

실험에 희생한 제브라피쉬 유생과 성체 물고기가 최소한의 고통으로 떠날 수 있게 해야합니다. 

1. 유생

  - 7일 이하(7dpf): 락스(15%)원액을 사육수와 1:4로 섞은 후, 이 용액에 유생을 넣고 5분간 기다린 후 희생 확인

  - 8-15일: 약 4℃ 정도 찬물이 있는 페트리디쉬에 물고기를 넣고 얼음 위에 페트리디쉬를 올려 놓은 후  수분 정도 기다린 후 희생 확인

 2. 15일 이상~성체

   - 얼음마취(약 5-10분간 얼음에 담가둠) 후 이석이 있는 부분을 수술용 가위로 잘라줍니다. 

   - 0.4 % 이상 농도의 tricaine사용

제브라피쉬는 순환여과양식시스템(RAS: Recirculating Aquaculture System), 즉, 폐쇄 시스템에서 사육하기 때문에 물고기의 분비물 및 먹다남은 사료, 사료에서 용출되는 영양성분들이 시스템 물에 남아 순환하면서 병원성 미생물의 영양분으로 작용을 합니다. 가장 흔하게 발생하는 질병은 솔방울병과 아가미병입니다. 이러한 질병을 일으키는 원인균들이 존재하지만 수질관리에 의해 발병하는 것이 대부분입니다. 폐쇄 양육시설에서 순환하는 사육수가 모든 물고기에게 노출되기 때문에 사료 급이 후 남은 사료 제거 및 분비물 제거를 부지런히 해야합니다.

1. 세균성 질병: 세균성 질병은 만성적이고 실내사육 물고기에 자주 나타납니다. 치사율은 낮지만 특정 상황에서는 치명적일 수 있습니다.

  1) 피부 및 전신감염

    (1) 원인체: Aeromonads, Salmonicida, Pseudomonas spp., Edwardsiella spp., Streptococcus spp., Nocardia spp.

    (2) 증상: 피부에 육안으로 보이게 감염, 궤양성·괴사성 피부 및 지느러미 병변, 체표홍반, 출혈, 복막염, 전신부종

    (3) 치료 방법: 정확한 감염의 종류를 확인하여 적절한 항생제를 사용, 수질환경 개선

  2) 마이코박테리오시스

    (1) 원인체: Mycobacterium spp.

    (2) 증상: 다산감소, 무기력, 거식증, 수축, 피부궤양, 고열, 부종, 복부팽창

    (3) 치료 방법: 항생제가 잘 듣지 않기 때문에 감염된 물고기 제거, 수질 최적화, 엄격한 위생 및 검역, 감염된 시스템 및 부속품 소독

  3) 아기미질환 (BGD, Bacterial Gill Disease): 여러 세균 뿐만 아니라 고밀도사육 및 수질악화로도 발생

    (1)원인체: Aeromonads, Salmonicida, Pseudomonas spp., Edwardsiella spp., Streptococcus spp., Nocardia spp. Mycobacterium spp.등 여러 세균들

    (2) 증상: 호흡곤란(유영빈도 증가 혹은 물표면으로 유영빈도 증가, 심할 경우 궤양형성 및 근육내 출혈 관찰

    (3) 치료 방법: 6-15 ppm 클로라민 T로 약 1시간 약욕
 

2. 원생동물성 질병 

  1) 벨벳병 (Velvet Disease): 대표적인 외형변화가 체표비늘이 솔방울 모양처럼 뻗어 솔방울병이라고도 부름

    (1) 원인체: Piscinoodinium pollulare   

    (2) 증상: 체표 비늘이 솔방울처럼 뻗음, 아가미 염증, 저산소증, 삼투압 조절 장애, 2차 세균 감염, 먹이 감소

    (3) 치료 방법: 물 10L에 인공소금 1g을 넣은 소금물에 하루정도 약욕. Atabrine TM을 1회 1 mg/l로 3일간 투약, Chloroquine Hydro-Chloride로 침지

제브라피쉬를 건강하게 사육하기 위해서 청소 및 소독 절차는 매우 중요하며 사용하는 시설의 유형과 수조당 제브라피쉬의 수, 수조의 형태와 시스템 및 수질 등의 여러가지 조건에 따라 선택해야 합니다. 

1) 일반적인 청소 : 질병 전염의 가능성이 우려되지 않는 상황에서는 비누 및 화학적 소독제의 사용이 독소를 유발할 수 있으므로 될 수 있으면 피하는게 좋습니다. 청소 중 유량을 증가시키면 감염물질을 제거할 수 있고, zebrafish를 수집하는데 사용되는 그물과 같은 경우 화학적 소독제를 사용하여 멸균하여 감염의 가능성을 제거하는 것이 필요합니다. 

2) 화학적 소독제 및 세제 종류 : BCMB(Benzalkonium Chloride + Methylene Blue Solution), SH(Sodium Hypochloride (6.15% Bleach)), PPSC(Potassium Peroxymonosulfate + Sodium Chloride (37g/1gallon RO water)) 등

3) 소독제 사용방법 : 소독제에 수조를 각각 BCMB-30분, SH-5분이상, PPSC-30분 정도 담근 후 물로 철저히 헹궈내야 합니다. 

4) 주의사항 : 소독제 및 세제를 사용하여 폴리카보네이트 탱크를 청소하는 경우, 수중 환경의 비누 잔류물이 제브라피쉬의 몸에 쉽게 흡수되어 질병과 사망을 유발할 수 있으므로 물로 철저히 헹궈야 합니다. 탱크를 다시 채우기 전에 탈염소 또는 역삼투를 거친 깨끗하고 차가운 물로 여러 번 철저히 헹궈야 합니다. 작업 표면은 사용 전후에 청소해야 하며 물고기가 청소된 표면과 접촉하거나 청소 제품의 냄새가 나는 곳에서도 동일한 주의가 적용됩니다. 

제브라피쉬는 수정 후 3개월에서 18개월 사이에 최적의 번식조건을 갖추게 되며, 근친교배와 유전적 결함을 최소화하고 유전적 다양성을 증가시키려면 육종을 관리해야 합니다.

1)  암수 짝짓기 시기 : 제브라피쉬의 배란은 주변 물에 있는 남성 생식선 페로몬의 존재를 통해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 일주주기 중 빛이 들어오면 그로부터 1~2시간 동안인 아침에만 물고기가 짝짓기를 하여 산란을 하게 되고 암주기가 되면 휴식을 취합니다. 

2) 짝짓기 방법 : 제브라피쉬 암컷은 거의 매일 산란이 가능하나 좋은 양의 알이나 양질의 알을 얻어 건강하고 번식력이 있는 번식 개체군을 유지하기 위해서는 암컷을 1~2주에 한 번 번식을 추천합니다. 번식 설정에는 암수 비율을 1:1보다 수컷보다 암컷이 더 많이 있는 것이 좋습니다. 제브라피쉬는 맨 바닥에 직접 난자와 정자를 방출하는 산란자이며, 자갈이나 대리석과 풀 형태으로 강화된 환경을 제공하는 플라스틱 수조 등의 인공 산란 장소나 사육 수조를 기울여 깊이 기울기를 생성함으로써 제브라피쉬의 자연 환경을 제공하는 것을 추천합니다.

3) 알 낳기: 암컷은 일반적으로 단일 산란에서 70-300개의 투명한 알을 생산하며 그 중 80% 이상이 수정됩니다. 건강한 난자와 배아는 반투명한 황색을 띄며, 알의 지름은 약 1.0-1.5mm 입니다. 양질의 배아를 얻는 것은 연구 목표를 달성하고 사용되는 어류의 수를 최소화 하는데 중요합니다. 제브라피쉬 배아와 관련된 대부분의 연구(예: 발달-정신 생물학, 해부학 및 유전학 연구)의 경우 높은 비율(>80%)의 난자가 성공적으로 수정되고 배아가 깨끗하고 균일한 첫 번째 과정을 거치는 것이 특히 중요합니다.

그림: (A) 수정된 알과 미수정된 알들(검정화살표)의 현미경사진 (8X). 수정된 알(B)와 미수정알(C)의 고배율 이미지. (사진출처: 김민정) 

제브라피쉬 암수는 대개 육안으로 구별됩니다. 제브라피쉬는 암수 교배를 통해 매주 100~200개 정도의 알을 생산할 수 있기 때문에 알을 낳을 수 있는 암컷은 수컷보다 배 주위가 부풀어 있어 구별할 수 있습니다. (그림 1.) 

또한 암컷은 알을 생산해야 하기 때문에 수컷보다 식성이 좋은 편이고 좀 더 공격적인 특징이 있습니다. 제브라피쉬 암수는 서로 몸색이 조금 다르게 보이므로 색깔에 의해서도 구별이 가능합니다.수컷은 다소 분홍색 혹은 노란색을 띄는 반면 암컷은 분홍색이 덜 합니다. 그러나 야생형(wild type)일지라도 AB, TU, WIL, EK 등 strain에 따라 조금씩 다를 수 있어서 주의가 필요합니다. 일반적으로 동물에서 암컷이 더 오래 생존하는 것으로 알려져 있는데, 제브리피쉬 암수의 수명차이에 대한 보고는 되어 있지 않습니다. 

그림 1. 제브라피쉬 암수 (출처: https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS4_eQ4hgxNFDjZm3n-wUJmxMiPuxmDOSpxxw&usqp=CAU)

[제브라피쉬 발달 단계]
 

제브라피쉬 수정 후 발달 단계는 Kimmel et al. 이 발표한 논문(제브라피쉬의 배아발생 단계; Stages of embryonic development of the zebrafish)에 잘 설명되어 있으니 참조하면 됩니다. 크게 배아(embryo), 유충(larva), 유어(juvenile), 성체(adult)시기로 구분할 수 있고, 배아 시기는 대략  수정 후 72시간(3일) 이전 (다만, 수정 후 5일까지를 배아시기로 사용하는 경우도 있음), 유충은 약 1개월 이전, 유어는 3개월까지를 일컫고 그 후를 성체라고 부릅니다. 다만, 초기 배아 시기에서의 형태적인 특징에 따른 세부 단계를 제외하고는 유충, 유어와 성체 시기는 먹이섭취 정도와 환경에 따라 성장 속도가 다를 수 있기 때문에 주로 크기로 구분하고 있습니다. 세부적인 내용은 위 논문이나 ZFIN 웹페이지를 참고하시기 바랍니다. 

제브라피쉬는 수정 후 48시간(2일)이 되면 알막(chorion)이 분해됩니다. 알막은 perivitelline fluid(PVF) 를 함유하여 탈수 방지, 삼투압 균형, 압력에 의한 손상 및 세균 방어(Biomolecules 참고) 등 초기 배아를 보호하는 막입니다 (Zygote 참조).

제브라피쉬는 대략 3년 이상(평균 42개월) 살 수 있는 것으로 알려져 있으나 길게는 5년 이상 생존할 수 있습니다. 제브라피쉬의 성장은 환경에 의해 많은 영향을 받습니다. 예를 들어, 실험 유형에 따라 제브라피쉬를 밀도 높게 사육하는 경우(다수의 제브라피쉬를 좁은 어항에서 사육하기)에는  성장이 느리게 일어나며, 반대로 저밀도 환경 혹은 높은 칼로리 식이는 매우 빠른 성장을 유도할 수도 있습니다. 따라서 성체가 된 후에도 성장을 매우 느리게 혹은 그 반대로 유도가 가능하며 이러한 방법이 해당 제브라피쉬의 건강에 호의적일 수 없을 것으로 예상되지만 아직까지 관련 연구는 미비한 실정입니다. 

[제브라피쉬 발달 단계별 형태]

* 그림출처: The Zebrafish in Biomedical Research. Academic Press; 2020: 559-591.
 

인간을 포함한 모든 척추 동물은 종 분화에서 두 번의 전체 게놈 복제를 거친 조상으로부터 진화하였고, 제브라피쉬를 포함한 경골어류는 추가로 3차 복제를 거치게 되어서 포유류보다 게놈 복제가 한번 더 일어났기 때문에, 어떠한 포유류 유전자 하나에 대해 제브라피쉬 해당 유전자가 추가적인 사본/패러로그(paralogue)를 가지게 되어서 각각을 a형, b형으로 나누었습니다.

[전체 게놈 복제(WGD)]

 종이 분화될 때 원시 조상 종으로부터 게놈 전체가 2배 혹은 4배 복제되는 형태로 진화합니다. 이후 게놈의 여러 영역에서 유전자의 소실과 수정 등이 이뤄지면서 새로운 종으로 분화됩니다.

[타겟 유전자 복제(TGD)]

 환경 변화에 따른 새로운 종이 분화되는 과정 중에 특정 환경에 적합하도록 해당 유전자가 증폭되거나 사라지는 식으로 유전자 복제가 진행되었습니다. 

제브라피쉬 database인 ZFIN에 따르면, 현재까지 알려져 있는 제브라피쉬 strain은 다음과 같습니다.

주로 언급되는 strain에 대한 설명을 아래 표에 나타냈습니다. 각각의 strain은 유전체의 구성이 조금씩 다른 것으로 알려져 있습니다.

[제브라피쉬의 무늬와 외형]

제브라피쉬는 외형적인 특징으로 얼룩말과 같은 줄무늬를 가지고 있습니다. 간혹 드물게 사육 중인 제브라피쉬 중에는 줄무늬 패턴이 비정상적이거나 점무늬를 가진 개체들이 발견되고 있는데, 이는 줄무늬 패턴을 나타내는 유전자나 색소세포 형성 및 배열과 관련된 돌연변이체로 많이 알려져 있습니다. 또한 멜라닌 색소 생성에 이상이 있는 알비노 종류도 있습니다.

무늬와는 별개로 지느러미가 길고 아름답게 뻗어 나온 TL strain의 경우에도 K+ channel과 관련된 유전자의 돌연변이로 알려져 있습니다. 이러한 돌연변이체는 자연적으로 나타날 수 있습니다.