제노프스 배아에 미세주입(microinjection)을 하기 위해서는 다음과 같은 3가지 장비가 필요합니다. 

1) Stereo-microscope : 배아를 눈으로 보기 위한 해부현미경.

2) Microinjector : 모세관 바늘에 담긴 유전자 또는 주입하고자 하는 물질을 주사와 같은 방식으로 밀어주기 위한 장비. 보통 질소를 이용함. 

3) Micromanipulator : 모세관 바늘을 장착한 뒤 배아에 원하는 곳에 주입할 수 있도록 섬세하게 움직임을 조정할 수 있는 장비. 

Microinjector의 경우 picoliter 수준의 부피를 조절할 수 있는 장비가 필요합니다. 

*그림출처: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J Vis Exp. 2016;(111):53799. 

제노프스에서 유전자를 주입하여 발현시키는 방법으로는 대표적으로 두 가지가 있습니다. 하나는 발현하고자 하는 유전자를 포함하는 DNA construct를 배아에 미세주입(microinjection)하여 유전자를 발현시키는 방법입니다. 이 방법은 DNA가 mRNA 보다 안정적이어서 보관이 쉽지만 제노프스 배아에 주입하였을 때 독성을 보이는 문제가 있습니다. 보통 주입하는 유전자의 효과적인 발현을 위해 CMV promoter가 같이 붙어있는 DNA construct를 주입하여 실험을 진행합니다. 또한, DNA 플라스미드를 주입할 경우 난할 과정에서 DNA가 할구에 균일하게 나뉘어 지지 않아 모자이크 형태의 발현을 보입니다. 다른 한 방법은 In vitro transcription을 통해 제작된 mRNA를 배아에 미세주입하여 유전자를 발현시키는 방법입니다. 이 경우 독성이 적어 많은 양을 주입할 수 있는 장점이 있지만 RNA를 보관하거나 실험을 진행하는 과정에서 쉽게 손상되는 문제를 주의해야 합니다.

제노프스는 초기 배아 세포가 어떠한 조직으로 발생하는지에 대한 세포 운명 지도(fatemap)가 잘 알려져 있어¹ 특정 조직에만 유전자를 발현시키거나, 저해시키는 injection 기법 또한 가능합니다. 
 

제노프스 연구자들을 위한 정보는 XenBase 데이터베이스에서 통합 관리되고 있습니다¹. 유전체 정보 이외에도 검증된 항체, morpholino, guide RNAs 정보 등 실험에 필요한 각종 reagents, 실험 프로토콜 등이 “Reagents & Protocols” 메뉴 아래 정리되어 있습니다. 또한 2000년에 CSHL Press 에서 발간된 “Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual”²은 20년이 넘은 현재까지도 표준적인 실험 방법들을 기록하고 있는 참고 서적으로 연구자들에게 받아들여지고 있어 많은 참고가 될 것입니다. 최근 유전체 연구와 같이 최신 기법들을 추가하여 해당 책의 내용들을 많이 업데이트해서 CSH Protocols³ 웹사이트에 공개하고 있습니다. 따라서 해당 웹사이트에서 하고자 하는 실험 프로토콜을 쉽게 찾을 수 있을 것입니다. 

수정된 배아에 미세주입(microinjection) 실험을 진행하거나 일부 조직을 수술적으로 가공하는 등의 실험을 진행하기 위해서는 배아를 감싸고 있는 jelly layer의 제거가 필수적입니다. 보통 날카로운 핀셋으로 잡아서 물리적으로 제거하게 되는데 이 jelly layer가 제거된 배아는 공기 노출에 매우 취약하므로 제거 이후 공기에 노출되지 않도록 조심하여야 합니다. 배아가 길어지기 시작하는 NF stage 20 시기가 지나가면 배아가 움직이게 되는데 이때 이미징 등 배아를 고정해서 진행해야 하는 경우 Benzocaine이나 MS-222와 같은 국소마취제를 포함한 버퍼에 배아를 담아 실험을 진행합니다. 이들 국소마취제는 사람에게도 사용되는 물질로 취급 시 보호구를 필수 착용하여야 합니다.

배아를 다루는 위해서 일반적으로 날카로운 핀셋을 주로 사용하지만, 사람의 눈썹과 머리카락으로 만든 eyebrow knife와 hair loop라는 도구도 만들어서 많이 활용합니다. 오른쪽 그림에서 위쪽이 eyebrow knife로 보통 배아의 특정 조직을 섬세하게 잘라낼 때 사용하며, 아래쪽이 hair loop으로 배아를 원하는 위치로 이동할 때 사용합니다.

*그림출처: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus. J Vis Exp. 2018;(132):56035.

제노프스에 사용 가능한 항체를 구입하는 방법에는 크게 2가지가 있습니다. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)¹에서 발생학에 사용되는 다양한 항체들을 판매하는데 그 가운데 제노프스에서 사용이 검증된 제품을 구매하는 방법이 있고, XenBase 데이터베이스²의 “Reagents & Protocols” 메뉴에 정리되어 있는 제노프스에서 사용이 검증된 항체 제품을 이용하는 방법이 있습니다. 

제노프스 단백질의 경우 아미노산 서열이 인간이나 쥐와 크게 다르지 않은 경우도 많이 있어서 인간이나 쥐 단백질을 위해 개발된 항체를 사용했을 때 작용할 수 있는 가능성도 적지 않습니다. Xenopus는 약 80%정도의 단백질서열이 사람과 유사 한 것으로 알려져 있습니다. 따라서, DSHB, Xenbase에 사용 가능한 항체 정보가 없을 경우, 사람 또는 마우스의 항체의 항원(epitope) 정보를 확인하고, Xenopus 단백질의 서열과 비교하여 동일한 항원 서열일 경우 사용할 수 있습니다. 

다른 방법으로 미세주입(microinjection)이 쉬운 장점을 활용하여 발현을 확인하고자 하는 단백질 유전자에 많이 사용되는 표지자(tag; FLAG, His, HA, V5, GFP 등)를 결합시키고 해당 유전자의 mRNA 를 주입하여 해당 단백질의 세포 내 위치나 발현 정도를 확인할 수 있습니다.

제노프스 난자(oocyte)는 막 단백질의 발현량이 매우 적으며 이에 따라 낮은 기저 수송 활동(background transport activity)을 가지고 있습니다. 따라서 이온 수송 단백질 등과 같은 막단백질의 활성을 측정하기에 굉장히 유리한 조건을 가지고 있습니다. 연구하고자 하는 막 단백질을 제노프스 난자에서 발현시킨 후, 이들의 활성을 측정하는 것을 oocyte uptake assay라고 합니다. 

먼저, 제노프스 난자에 미세주입기법을 이용해 우리가 알고자 하는 막 단백질의 mRNA를 주입하여 단백질을 발현시킵니다. 이때 꼭 제노프스의 막 단백질 뿐만 아니라 식물 등 다른 종의 막 단백질을 발현시켜 활성을 측정하는 것도 가능합니다. 이후 제노프스 난자가 들어있는 배지에 방사성으로 표지되었거나 혹은 형광으로 표지된 물질을 함께 넣어주고  일정 시간이 지난 후, 제노프스 난자 내에 방사성으로 표지된 혹은 형광으로 표지된 물질이 얼마나 들어있는지를 분석함으로써 막 단백질의 활성을 측정할 수 있습니다.

최근에는 방사성 또는 형광 표지된 물질 대신 액체크로마토그래피와 질량분석(LC-MS)을 이용해서도 어떤 물질이 얼마나 흡수되고 이동했는지를 알 수 있습니다.
 

발톱개구리과(family)에 속하는 종들은 9개의 염색체를 기본으로 가지고 있지만, 전체 유전체 복제(whole genome duplication; WGD)를 통해서 다양한 배체수를 가지고 있습니다. 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 4배체 유전체를 가진 종으로 18개 염색체를 가지고 있습니다 (반면 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)는 이 가운데 한 개의 염색체가 나눠져서 총 10개의 염색체를 가지고 있습니다.) 하지만 유전체 복제로 이루어진 18개 염색체는 서로 상동유전체를 가지고 있는데, 이를 크기로 구분하여 상동유전체 가운데 큰 염색체를 L 염색체, 작은 염색체를 S 염색체로 부르고, 이는 염색체 이름에도 반영되어 있습니다 (chr1L, chr1S, chr2L, chr2S, …). 상동유전체가 복제되어 있으니 상동유전자(orthologous gene) 역시 두 개가 존재할 수 있습니다 (유전체 복제 이후 많은 유전자들이 선택적으로 사라져서 모든 유전자가 두 개가 존재하지는 않습니다). 이 경우 L 염색체에 존재하는 유전자와 S 염색체에 존재하는 유전자를 각각 .L 및 .S 를 뒤에 붙여서 표기합니다. 예를 들어 Pax6.L 과 Pax6.S 단백질의 경우 둘 다 Pax6 유전자와 상동 관계에 있는 유전자이며 각각 L/S 염색체에 존재하는 것입니다. 

이러한 정보는 XenBase 데이터베이스에 잘 정의되어 있는데 아래 예시와 같이 pax6 유전자의 경우 2배체인 서양 발톱 개구리(X. tropicalis)에는 4번 염색체에 하나의 유전자가 존재하며, 4배체인 아프리카 발톱 개구리(X. laevis)에는 4L 및 4S 염색체에 각각 유전자가 존재하는 것을 알 수 있습니다. 하지만 이들 복제된 유전자(pax6.S 및 pax6.L)들은 대부분 인간 및 다른 종의 상동유전자와 높은 상동성을 가지고 있어 비슷한 기능을 수행할 것으로 예측하고 있습니다. 제노프스 유전자에 대한 다른 종의 상동유전자는 XenBase 데이터베이스³ 및 Genome Alliance Resource 데이터베이스⁴에서 쉽게 확인할 수 있습니다. 

*그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/entry/gene/showgene.do?method=display&geneId=991974&

제노프스는 배아와 성체 모두 물 속에 살고 있으며, 모체의 영향과 무관하므로 외인성 호르몬이나 기타 화합물을 쉽게 흡수할 수 있습니다. 또한 기관발달, 생리학 및 유전자 발현 측면에서 다른 수생 모델보다 육지 척추동물에 진화적으로 더 가깝기 때문에 독성실험을 하는데 시간 및 비용적으로 효율적인 모델입니다.

Frog embryo teratogenesis assay Xenopus (FETAX) 테스트는 제노프스로 진행하는 발달 독성 스크리닝 테스트 입니다.  소량의 화합물로 짧은 시간(96시간)에 발달 독성을 볼 수 있어 약물 안전성 개발 초기에 실시할 경우 효율적으로 약물의 독성을 확인할 수 있습니다.

*그림출처: FETAX Assay for Evaluation of Developmental Toxicity. Methods Mol Biol. 2017;1641:311-324.

제노프스는 완전 수생생물로 사육 시 깨끗한 수질과 사육환경을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 기존에는 물이 크게 순환하는 flow-through식 사육장이나 폐쇄식(closed) 사육장이 사용되곤 했으나 현재는 모듈식 구조가 다양한 장점으로 인해 많이 쓰이고 있으며 쉽게 구매도 가능합니다. 모듈식 구조는 기존 방식에 비해 비용면에서는 좀 더 비싼 편이나 더 정교한 수질 관리와 공간적으로 효율적이란 이점을 제공합니다. 

*그림출처: Green SL. The Laboratory Xenopus sp. CRC Press; 2018.

제노프스의 사육을 위한 거시적인 환경과 미시적인 환경 유지에 다음과 같은 시설들이 필요합니다. 

- 거시적인 환경: 충분히 통풍이 되며 수온과 평형을 이루는 기온을 위한 공기 순환장치, 방수/미끄럼 방지 처리가 되어있는 바닥, 방수/누전처리가 되어있는 전기시설 등 

- 미시적인 환경: 수돗물 속의 오존/염소/클로라민을 제거하기 위한 필터 시스템, 적절한 염도를 유지하기 위한 염수펌프/삼투 시스템, 일정한 수질을 유지하기 위한 여과/수질 모니터링 시스템, 수온을 유지하기 위한 냉각기, 펌프 등

수질을 유지하는 방법에도 질소분해 박테리아를 이용하는 생물학적 여과법, 화학 여과법, 자외선 살균, 기계적 여과 등 다양한 방법이 있으며 각각의 장단점이 있어서 보통 사육 시설에는 이러한 방법들을 복합적으로 사용하고 있습니다. 

제노프스는 일반적인 펠렛 형태의 물고기 사료와 냉동 장구벌레를 잘 먹습니다. 영양을 고려한 특수 사료 역시 외국의 제노프스 판매 업체를 통해서 구입할 수 있으나 일반적인 물고기 사료와 비교해서 큰 차이는 없습니다. 보통 일주일에 2-3차례 먹이를 주며 이후 물이 많이 오염되지 않도록 관리가 필요합니다.

제노프스의 질병 원인에는 비병원성/세균성/바이러스성 등 여러가지가 있으며 다양한 원인만큼 증상도 다양한 편 입니다. 이상 현상이 발견되면 일단 같은 수조에 있는 개체들에 비슷한 증상이 있는지를 살피고, 증상이 있는 개체를 신속하게 격리해야 합니다. 

제노프스에서 가장 흔한 질병 중 하나는 Red Leg Syndrome이라 불리는 세균성 피부 감염입니다. 이 병에 대한 임상 징후로는 무기력, 사지의 부기 및 점상 출혈 및 반상출혈의 출현이 포함되며 종종 배 쪽으로 퍼지기도 합니다. Red Leg Syndrome의 치료는 초기에는 제노프스를 격리 후 Amphibian Ringer’s solution에 넣거나 약한 염기의 소금물로 소독을 하는 등의 방법으로 할 수 있습니다. 추가로 광범위한 항생제의 경구 투여나 물에 녹여 사용하는 등의 방법으로 치료가 가능하다는 보고도 있습니다. 하지만 Red Leg Syndrome의 원인균에는 다양한 균이 있으니 효과적인 치료를 위해서는 치료에 앞서 병원체의 식별이 선행되어야 합니다.

Chryseobacterium 감염의 경우에는 패혈증과 동일한 증상을 보이며 각막 혼탁, 복수, 피하 부종, 잠수 불능, 무기력, 울혈, 전신 점상 출혈등의 증상을 보입니다. 치사율이 매우 높은 질병이며 방치하면 다른 제노프스에 쉽게 전염되기에 빠른 안락사가 최선의 처리 방법입니다.

제노프스에서도 전세계 양서류에 큰 위협이 되고 있는 항아리곰팡이(Batrachochytrium dendrobatidis)의 감염이 일어날 수 있습니다. 이 감염의 징후로는 표피 증식 및 피부 변색, 비정상적인 탈피, 피부 염증, 무기력 및 탈수가 포함됩니다. 2차 세균성 또는 기타 진균 감염이 존재할 수 있으며 궤양, 점상 및 반상출혈을 유발할 수 있습니다.

25ppm의 포르말린 약욕으로 치료가 가능했다는 보고가 있으나 B. dendrobatidis는 쉽게 전염 가능하기에 치료는 권장되지 않습니다. 감염된 제노프스는 오히려 빠르게 안락사 하는 것이 권장되며 감염된 제노프스를 담은 수조 및 장비는 감염 지속 및 잠재적인 전파를 막기 위해 향진균제로 청소 후 소독하여야 합니다.