[마우스 복재정맥 채혈]

마우스에서 총 혈액량, 단회 채혈량은 아래 표와 같으며 채혈 시 안전한 지침은 단회 채혈 또는 2주 동안 여러 번 채혈 시 가능한 채혈량이 체중의 1%입니다. 예를 들어, 체중이 20g인 마우스는 단회 채혈에서 0.2ml의 혈액을 채혈하거나 2주 동안 여러 번의 채혈을 통해 총 0.2ml의 혈액을 채혈할 수 있습니다. 단일 샘플의 경우 최대 0.2ml이며, 일반적으로 혈액학적 상태에 지장을 주지 않는 범위 내에서 2주 간격으로 반복할 수 있습니다. 또는 검체량 제한을 고려하여 소량의 검체를 여러 번(예: 매일 0.01ml) 채취할 수 있습니다.

- 재료: 27G 혹은 25Gneedle 혹은 채혈침, 면도기, 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브) 등
- 동물을 부드럽게 다루면서  실험 과정에 대한 적응과 훈련을 시행하면 연구 중 스트레스 관련 행동을 감소시키며, 이는 연구 시작 전 몇 번의 짧은 교육 세션으로 달성할 수 있습니다.
- 참고 동영상 1 (훈련된 마우스): https://www.youtube.com/watch?v=q1NcleX9eiI
- 참고 동영상 2 (훈련되지 않은 마우스): https://youtu.be/Si34jfiso9k?si=p1DDxCoLWya0Schs 

[방법]

1. 모든 동물은 새로운 멸균 needle/채혈침이 필요합니다.
2. 뒷다리가 자유로운 상태로 마우스를 보정틀에 넣습니다. 
3. 면도기로 채혈 부위의 털을 제거합니다.
4. 알코올 스왑으로 채혈 부위를 소독합니다.
5. 채취부위에 바세린을 바르는 경우 혈액 방울이 크게 형성되는데 도움이 됩니다. (선택사항)
6. 허벅지와 꼬리 사이의 피부를 당깁니다. 복재정맥은 허벅지의 뒤쪽 표면에 위치합니다.
7. 허벅지 무릎 위에 압력을 가하고 25G needle이나 채혈침으로 정맥을 45° 각도로 찔러 채혈합니다. 
8. 채혈 용기에 혈액을 수집합니다.
9. 지혈이 될 때까지 거즈로 압력을 가합니다.

그림 1. 마우스 복재정맥

[랫드 미정맥 채혈]

랫드에서 총 혈액량, 단회 채혈량은 아래 표와 같으며, 채혈 시 안전한 지침은 단회 채혈 또는 2주 동안 여러 번 채혈 시 가능한 채혈량이 체중의 1%입니다. 예를 들어, 체중이 300g인 마우스는 단회 채혈에서 3.0ml의 혈액을 채혈하거나 2주 동안 여러 번의 채혈을 통해 총 3.0ml의 혈액을 채혈할 수 있습니다. 미정맥 채혈은 한 번 실시할 때 0.1~2ml 정도의 혈액을 채취하는데 적합합니다.

- 재료: 21-23G needle 혹은 butterfly needle 또는 채혈침, heating lamp 또는 따뜻한 물, 보정틀(혹은 마취), 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브) 등
- 혈액 샘플을 얻기 위해 메스로 꼬리를 자르는 것은 오래된 접근 방식으로 사용해서는 안 됩니다.
- 참고동영상: NC3Rs. Blood sampling: Rat. 

[방법]

1. 채혈 시 모든 동물은 각각 새로운 멸균 needle/채혈침을 사용하여 채혈해야 하며 한 개의 주사바늘을 여러 개체에 재활용하지 않습니다.
2. 랫드를 보정틀에 넣거나 마취하고 꼬리를 알코올로 닦습니다.
3. heating lamp 또는 따뜻한 물을 사용하여 혈관 확장을 위해 5~10초 동안 꼬리에만 열을 쬐어주거나 꼬리를 따뜻한 물에 담궈 줍니다.
4. 꼬리를 잡고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다 (그림 참조). 필요시 마취 크림(EMLA cream)을 꼬리에 적용하고 15분간 기다립니다.
5. 혈관의 경로를 따라 needl이 위를 향하는 것처럼 정맥을 찔러 채혈합니다.
6. 주사바늘을 빼고 모세혈관 튜브에 혈액 방울을 수집합니다. 더 많은 양을 채혈하려면 주사기에 needle 혹은 butterfly needle 삽입하여 정맥 천자 후, 정맥이 collaps되지 않게 주사기를 천천히 당깁니다.
7. 지혈이 될 때까지 거즈로 채혈부위에 부드럽게 압력을 가합니다.

그림 1. 랫드 꼬리 단면 모식도

[마우스 미정맥 채혈]

마우스에서 총 혈액량, 단회 채혈량은 아래 표와 같으며 채혈 시 안전한 지침은 단회 채혈 또는 2주 동안 여러 번 채혈 시 가능한 채혈량이 체중의 1% 입니다. 예를 들어, 체중이 20g인 마우스는 단회 채혈에서 0.2ml의 혈액을 채혈하거나 2주 동안 여러 번의 채혈을 통해 총 0.2ml의 혈액을 채혈할 수 있습니다. 미정맥 채혈은 한 번 실시할 때 50µl 정도의 혈액을 채취하는데 적합합니다.

- 재료: 25G needle 또는 butterfly needle 또는 채혈침, heating lamp 또는 따뜻한 물, 보정틀, 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브) 등
- 혈액 샘플을 얻기 위해 메스로 꼬리를 자르는 것은 오래된 접근 방식으로 사용해서는 안 됩니다.
- 참고 동영상: Liu X et al. J Vis Exp. 2019;(144):10.3791/59136. 

[방법]

1. 채혈 시 모든 동물은 각각 새로운 멸균 needle/채혈침을 사용하여 채혈해야 하며, 한 개의 주사바늘을 여러 개체에 재활용하지 않습니다.
2. 마우스를 보정틀에 넣고 꼬리를 알코올로 닦습니다.
3. heating lamp 혹은 따뜻한 물을 사용하여 혈관 확장을 위해 5~10초 동안 꼬리에만 열을 쬐어주거나 꼬리를 따뜻한 물에 담궈 줍니다.
4. 꼬리를 잡고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. (그림 참조)
5. 25G needle을 10° 각도로 삽입하여 정맥을 천자합니다. 주사바늘을 빼고 모세혈관 튜브에 혈액 방울을 수집합니다. 혹은 25G butterfly needle을 10° 각도로 삽입하여 정맥 천자 후 채혈 용기에 혈액을 수집합니다.
6. 지혈이 될 때까지 거즈로 채혈부위에 부드럽게 압력을 가합니다.
 

그림 1. 마우스 꼬리 단면 모식도

[방법]

1. 랫드를 마취하고 그림에서와 같이 목 뒤쪽을 잡고 엄지와 검지로 눈주위의 느슨한 피부를 당겨 팽팽하게 합니다. 
2. 모세관/피펫은 눈의 내안각(내측 눈구석)에 코와 30-45° 각도로 넣습니다. 
3. 안구를 지나 약간 저항이 있는 정맥동 막(Sinus Membrane)에 들어가기 위해 밀어 넣습니다.
4. 모세관/피펫을 회전시켜 정맥총/ 정맥동(Plexus/Sinus)을 파열하면 혈액이 통해 흘러나옵니다. 
5. 필요한 양의 혈액을 정맥총에서 채취한 후, 모세관/피펫을 부드럽게 제거하고 멸균된 면으로 닦아냅니다. 경우에 따라 부드럽게 눈에 압력을 가해 지혈합니다. 

그림 1. 랫드 안와 채혈 방법

* 그림출처: Parasuraman S et al. J Pharmacol Pharmacother. 2010;1(2):87-93. 

[주의사항]

1. 모세관/피펫이 신경에 닿아 시신경 손상될 경우 실명할 수 있습니다. 
2. 잘못된 기술이나 동물의 움직임을 통제하지 못할 경우, 안구 궤양, 천공, 유리체액 손실, 감염 또는 각막염이 발생할 수 있습니다.
3. 문헌에 따라 반복이 권장되지 않고 두 번째 채혈 시 2주 간격이 필요하다고 언급하나 NC3Rs에서는 안락사 전제 하에서 수행하여야 한다고 이야기 하고 있습니다.

[반복 채혈시 가능한 채혈양 (NIH Guideline)]

[방법]

1. 마우스를 마취하고 그림에서와 같이 테이블 위에 옆으로 눕히거나, 머리를 아래로 향하게 하고 손으로 잡습니다. 
2. 엄지와 검지(검지는 눈 위, 엄지는 눈 아래에 위치)를 사용하여 눈 위와 아래의 피부를 당겨서 눈이 안구 밖으로 돌출되도록 합니다.  이 때, 엄지로  마우스의 기관을 막지 않도록 주의하십시오.
3. 모세관 또는 피펫을 안구 옆쪽 또는 아래쪽으로 삽입하고, 끝을 45° 각도로 안구 중간을 향해 삽입합니다.
4. 모세관/피펫을 손가락 사이에서 회전시킵니다.
5. 부드럽게 아래로 압력을 가한 후 풀어주면 혈관이 파열되고 혈액이 모세관/피펫에 들어가는 것이 보입니다.
6. 모세관/피펫에 소량의 혈액이 채워지기 시작하면 모세관/피펫을 약간 뒤로 빼서 혈액이 찰 수 있도록 합니다. 
7. 혈액을 확보한 뒤 모세관/피펫을 제거하고 경우에 따라 부드럽게 눈에 압력을 가해 지혈합니다. 

그림 1. 마우스 안와 채혈 방법

* 그림출처: Hoff J. Lab Anim. 29(10):47–53.

[주의사항]

1. 모세관/피펫이 신경에 닿아 시신경 손상될 경우 실명할 수 있습니다. 
2. 잘못된 기술이나 동물의 움직임을 통제하지 못할 경우, 안구 궤양, 천공, 유리체액 손실, 감염 또는 각막염이 발생할 수 있습니다.
3. NIH 가이드라인에서는 반복채혈 방법으로 소개하고 있으나, NC3Rs 에서는 안락사 전체 하에서 수행하여야 한다고 이야기 하고 있습니다. 

[채혈양 (NIH Guideline)]

1. 뇌내 투여를 위한 도구를 멸균하여 준비하고 투여부위인 두개부를 제모합니다. 
2. 통증 경감을 위해 마취를 실시하고 충분히 마취가 되었다고 판단되면 stereotaxic apparatus에 두부를 고정시킵니다. 마취 후에는 가능하면 열판을 제공하여 체온을 유지할 수 있도록 합니다.
3. 투여부위 소독을 실시합니다.
4. 두개부의 표피를 세로로 절개하여 두개골을 노출시킨 후, 멸균 면봉을 이용하여 골막을 제거합니다.
5. 해부학적 지표(예: 브레그마)를 기준으로 하여 stereotaxic 장비를 약물을 주입하고자 하는 부위에 맞게 manipulator X, Y를 조정합니다. 그 후 주입 부위에 골절기를 사용하여 두개골을 직접 천공하고, 매우 얇은 골층만 남았을 때 또는 두개골 전체를 관통했을 때 천공을 멈춥니다. (드릴이 경막을 뚫지 않도록 주의)
6. 멸균된 바늘(27G)을 두개골 표면에 평행하게 눕혀 경막을 절개한 후 바늘 끝 부분을 위치시킵니다. Manipulator Z를 조정하여 경막을 통해 뇌 조직 내 원하는 깊이까지 천천히 내려 투여 준비를 마칩니다. 
7. Injector(50-100 nL/min)를 사용하여 일정한 속도로 약물을 투여합니다. 투여 완료 후 투여량이 50 nL를 초과한 경우, 역류의 위험을 줄이기 위해 바늘을 최대 5분 동안 유지합니다.
8. 바늘을 제거하고 멸균된 면봉을 이용하여 출혈을 닦아낸 후 피부를 봉합하거나 클립 또는 조직 접착제를 이용하여 절개 부위를 봉합합니다. 
9. 봉합 부위를 소독하고 동물이 회복할 때까지 관찰합니다.

그림 1. 뇌내 투여시 필요한 도구

그림 2. 랫드 뇌내 투여시 주의사항

* 그림출처: Puntel M et al. Curr Protoc Neurosci. 2010;Chapter 4:Unit-4.24.

1. 뇌내 투여를 위한 도구를 멸균하여 준비하고 투여부위인 두개부를 제모합니다. 
2. 통증 경감을 위해 마취를 실시하고 충분히 마취가 되었다고 판단되면 stereotaxic apparatus에 두부를 고정시킵니다. 마취 후에는 가능하면 열판을 제공하여 체온을 유지할 수 있도록 합니다.
3. 투여부위 소독을 실시합니다.
4. 두개부의 표피를 세로로 절개하여 두개골을 노출시킨 후, 멸균 면봉을 이용하여 골막을 제거합니다.
5. 해부학적 지표(예: 브레그마)를 기준으로 하여 stereotaxic 장비를 약물을 주입하고자 하는 부위에 맞게 manipulator X, Y를 조정합니다. 그 후 주입 부위에 골절기를 사용하여 두개골을 직접 천공하고 매우 얇은 골층만 남았을 때 또는 두개골 전체를 관통했을 때 천공을 멈춥니다. (드릴이 경막을 뚫지 않도록 주의)
6. 멸균된 바늘(27G)을 두개골 표면에 평행하게 눕혀 경막을 절개한 후 바늘 끝 부분을 위치시킵니다. Manipulator Z를 조정하여 경막을 통해 뇌 조직 내 원하는 깊이까지 천천히 내려 투여 준비를 마칩니다. 
7. Injector(50-100 nL/min)를 사용하여 일정한 속도로 약물을 투여합니다. 투여 완료 후 투여량이 50 nL를 초과한 경우, 역류의 위험을 줄이기 위해 바늘을 최대 5분 동안 유지합니다.
8. 바늘을 제거하고 멸균된 면봉을 이용하여 출혈을 닦아낸 후 피부를 봉합하거나 클립 또는 조직 접착제를 이용하여 절개 부위를 봉합 합니다. 봉합 부위를 소독하고 동물이 회복할 때까지 관찰합니다.

그림 1. 뇌내 투여시 필요한 도구

그림 2. Stereotaxic 수술 개요도

* 그림출처: Park JH et al. STAR Protoc. 2022;3(3):101607.

그림 3. Stereotaxic 장치의 실제 장착 모습

* 그림출처: Mathon B et al. Neurosci Bull. 2015;31(6):685-696.

1. 마취된 랫드의 등이 바닥을 향하도록 양와위 자세로 눕힙니다. 랫드 당 하나의 다리만 사용할 수 있습니다. 
2. 슬개골 부위를 면도한 뒤 면도 부위를 4% 클로르헥시딘 용액 또는 베타딘으로 1차 소독하여 유분과 단백질을 제거합니다.  
3. 면도 부위를 2% 클로르헥시딘과 70% 알코올 또는 10% 포비돈요오딘과 70% 알코올을 이용하여 번걸아가며 2번 연속으로 닦아냅니다. 
4. 멸균된 2'x 2' 거즈 중앙에 구멍을 뚫고 소독한 무릎 위에 얹습니다. 
5. 포셉을 이용하여 피부를 잡고 피부에 2mm의 작은 수평 절개창을 만듭니다. 
6. 경골에 부드러운 압력을 가하여 무릎을 구부립니다. 
7. 슬개건의 중간 지점을 통해 대퇴골 골수강에 22G 바늘을 삽입하여 최대 200μL 를 투여합니다. 주입 속도가 빠르거나 주입량이 많으면 누출이 발생하거나 근육이나 피부층의 붓기가 관찰될 수 있습니다. 이 때는 실패한 것으로 간주합니다. 
8. 절개 부위의 혈액을 거즈나 면봉으로 부드럽게 닦아내고 절개부위에 조직 접착제를 바릅니다. 
9. 마취에서 회복하여 보행이 가능해지면 사육 케이지로 돌려보냅니다. 
 

* 랫드는 투여 후 6시간 동안 모니터링 해야하고 최소 2일동안은 매일 동물상태를 모니터링해야 합니다. 투여받은 동물이 불규칙한 걸음걸이 등 보행장애가 있다면 수의사와 상의해야 합니다. 
 

1. 마취된 마우스의 등이 바닥을 향하도록 양와위 자세로 눕힙니다. 마우스 당 하나의 다리만 사용할 수 있습니다. 
2. 슬개골 부위를 면도한 뒤 면도 부위를 4% 클로르헥시딘 용액 또는 베타딘으로 1차 소독하여 유분과 단백질을 제거합니다.  
3. 면도 부위를 2% 클로르헥시딘과 70% 알코올 또는 10% 포비돈 요오딘과 70% 알코올을 이용하여 번갈아가며 2번 연속으로 닦아냅니다. 
4. 멸균된 2'x 2' 거즈 중앙에 구멍을 뚫고 소독한 무릎 위에 얹습니다. 포셉을 이용하여 피부를 잡고 피부에 1~2mm의 작은 수평 절개창을 만듭니다. 
5. 경골에 부드러운 압력을 가하여 무릎을 구부립니다. 무릎의 구부러짐은 그림 1과 같이 한쪽 손의 엄지와 검지를 이용하여 대퇴골을 바닥면과 90° 수직을 이루도록 배치한 뒤 반대쪽 손의 손가락으로 경골을 구부리거나, 그림 2 또는 3과 같이 대퇴골과 경골이 90° 를 이루도록 하여 유도할 수 있습니다. 
6. 25G 바늘을 사용하여 슬개건의 중간 지점을 통해 대퇴골 골수강에 삽입합니다. 약간의 압력을 가하면서 바늘을 약간 회전하듯이 비틀어 움직이면 물질을 주입할 수 있는 충분한 공간이 확보됩니다. 바늘 각도는 대퇴골 방향과 일치해야 합니다. 각도가 바르지 않으면 바늘이 뼈를 뚫고 근육으로 들어가거나 뼈가 깨질 수 있습니다.
7. 바늘을 회전시키면서 대퇴골의 2/3지점까지 삽입했다가 바늘을 다시 천천히 빼냅니다. 이 때 다리가 움직이지 않도록 주의합니다. 
8. 주입하려는 물질이 들어 있는 주사기와 30G 바늘을 이용하여, 25G 바늘을 빼낸 자리로 물질을 천천히 주입합니다. 최대 투여량은 30μL 입니다. 25G의 바늘을 삽입한 상태에서 해밀턴 주사기를 사용하여 물질을 주입할 수도 있습니다. 
9. 주입 속도가 빠르거나 주입량이 많으면 그림 4와 같이 누출이 발생하거나, 근육이나 피부층의 붓기가 관찰 될 수 있습니다. 이때는 실패한 것으로 간주합니다. 
10. 절개 부위의 혈액을 거즈나 면봉으로 부드럽게 닦아내고 절개부위에 조직 접착제를 바릅니다. 
11. 마취에서 회복하여 보행이 가능해지면 사육 케이지로 돌려보냅니다. 
12. 마우스는 회복 후 6시간 동안 모니터링해야 하고 최소 2일동안은 매일 동물상태를 모니터링해야 합니다. 
13. 동물이 불규칙한 걸음걸이 등 보행 장애가 있다면 수의사와 상의해야 합니다. 

* 그림출처

 - 그림 1: University Animal Care Committee Standard Operating Procedure SOP 7.26 - Intrafemoral Injections in Mice. 2019.

 - 그림 2-4: Animal Ethics Committee – Standard Operating Procedure: LAB_040 Injections – Intra-femoral in Mice. 2022.

[Retro-orbital Injection의 유용성]
Adult 및 neonatal rat에서 어려운 미정맥 주사 대신 쉽고 빠르게 재현 가능한 투여 방법입니다. 단, neonatal rat에서 생후 2일 이상 되었을 때는 피부가 어두워지고 정맥이 보이지 않게 되어 투여가 어렵습니다. 

[Adult 랫드에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 27G(Gauge)정도의 작은 바늘로 최대 0.15 ml 투여 가능합니다.
2. 호흡마취 하고 횡와위자세로 눕힌 후 점안마취제인 proparacaine을 점안하고 최소 30초 동안 둡니다 (그림 1). 
3. 안구가 조금 튀어나오도록 보정합니다.
4. 눈 표면을 손상시키지 않도록 아래로 비스듬히 바늘을 내안각 (medial canthus)쪽으로 45° 각도로 삽입합니다. 이 때 안구와 안와 뼈 사이로 삽입합니다 (그림 2). 
5. 바늘 끝이 눈 밑부분에 올 때까지 안구 가장자리를 따라 바늘을 접근합니다.
6. 흡인 없이 부드럽게 주사하고 바늘을 천천히 뺍니다.

그림 1. Adult Rat에서 점안 마취 예시 사진

* 그림출처: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

그림 2. Adult Rat에서 Retro-orbital Injection 예시 사진

* 그림출처: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

[Neonatal Rat에 대한 Retro-orbital Injection 방법]
1. 29-31G 바늘로 g당 최대 5μL를 투여 가능합니다.
2. 오른손잡이의 경우, 평평한 표면에 좌측 횡와위자세로 눕히고 호흡마취 합니다 (단, 호흡마취 장비가 눈꺼풀과 눈물관 부위를 가려서는 안됨).
3. Paw withdrawal reflex를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 
4. 머리 아래에 광원을 사용하여 정맥동을 쉽게 볼 수 있도록 하고 바늘을 eye socket(내안각: Medial Canthus와 동일)에 바늘사면을 아래로 향하게 하여 40°의 각도로 삽입합니다 (그림 3). 
5. 바늘의 1/3을 eye orbit 뒤쪽에 위치한 retro-orbital sinus 부위로 2mm정도 밀어 넣습니다.
6. 흡인 없이 부드럽게 주사하고 역류를 방지하게 위해 잠시 기다렸다가 바늘을 천천히 뺍니다.
7. 투명한 용액을 주사 하였을 때는 정맥이 잠시 투명해져야 합니다. 만약 주사 후 눈이 부어 오르면 바늘이 정맥에 삽입되지 않았음을 의미합니다. Neonatal 두개골은 매우 부드러워서 바늘이 두개골을 뚫으면 용액이 수막이나 뇌실질에 들어갈 수 있습니다.
8. 랫드를 보온 장치에 올려놓아 체온을 유지하면서 회복시킵니다.
9. 어미에게 새끼를 돌려보내기전에 통증 반응이 있는지 확인합니다. 
10. 오염을 피하기 위하여 각 동물마다 새로운 멸균 주사기를 사용합니다.

그림 3. Neonatal Rat에서 Retro-orbital Injection 예시 사진

* 그림출처: Rocha-Ferreira E et al. J Vis Exp. 2024;(204):10.3791/65386.