순화는 실험동물이 운송으로 인한 스트레스가 심혈관, 내분비, 면역, 중추 신경 및 생식 시스템 등 생리학적 상태에 영향을 주어 연구 데이터에 영향을 끼치는 것을 완화시키는 과정입니다.

동물은 운송 과정 중 면역 기능이 억제되거나 변화되고 스트레스 호르몬인 코티솔의 증가, 혈청검사 결과의 변화, 사료 및 수분 섭취 감소, 체중감소, 심박수 그리고 체온 변화 등 많은 변화가 관찰됩니다.

보통 검역과 순화를 함께 진행하는 경우가 많으며 장기간 실험을 진행하거나 생존 수술을 진행하는 설치류는 최소 3일 이상의 순화 기관을 거쳐야 하며 개, 고양이, 토끼 등 설치류 이외의 동물들은 7일 이상의 순화 기간을 거치는 것이 바람직합니다.

따라서 동물을 반입하는 동물실험시행기관의 규정이나 표준작업서에 따라 적절한 순화 과정을 거쳐 동물을 충분히 안정화시키고 실험을 진행하시기 바랍니다. 
 

체외수정(IVF, In vitro fertilization) 등을 목적으로 마우스의 정자를 채취하기위해서는 마우스 정자 형성 과정에 대한 이해가 필요합니다. 

[정자 형성 과정]

- 고환, 정소(Testis): 정자의 형성, 수컷호르몬의 생성과 분비를 담당한다.  
- 부고환, 정소상체(Epididymis): 정소상체는 정액 중 수분을 흡수하여 정자 수를 농축시키고 정자를 수송하며, 이 과정 중 정자는 성숙하여 난자와 결합할 수 있는 수정능력을 획득한다. 성숙한 정자는 정소상체 미부(Cauda Epididymis)에 저장된다.
 

따라서 성숙한 정자가 저장되어 있는 정소상체 미부를 채취해야 합니다. 아래쪽의 사진에서 빨간 선으로 표시된 위치를 봉합사 등으로 묶은 후 그 윗부분을 자르면 정소상체 미부에 저장된 정자를 잘 보존하여 채취할 수 있습니다. 
 

[정자채취 방법]

정자 채취 방법은 다음과 같습니다.

1) 채취한 정소(Testis)를 해부 현미경 아래에 37 °C로 따뜻하게 준비해두고 한 쌍의 멸균된 겸자(forceps)를 사용하여 정소상체 미부를 고정합니다. 
2) 정소상체 미부(Cauda Epididymis)와 주변 조직에 멸균된 바늘(Needle)을 이용하여 부드럽게 구멍을 뚫어준 뒤 조직을 부드럽게 눌러 정자를 배출합니다. 부드럽고 빠르게 수행함으로써 각 정소상체 미부에서 가능한 많은 정자가 배출되도록 합니다. 
 

동물에게 고통이나 통증이 있을 것으로 예상되는 실험 과정이 있다면 고통 경감을 위하여 적절한 진통제 혹은 항생제를 처치해야 합니다. 연구의 목적에 맞게 적합한 약물을 선택하고 용량을 정해야 하겠습니다. 

일반적으로 사용할 수 있는 진통제는 Acetaminophen, Aspirin, Ibuprofen, Ketoprofen, Butorphanol, Buprenorphine 등이 있으며, 그 중에서 Butorphanol과 Buprenorphin는 마약성 진통제에 해당합니다. 일반적으로 관절염 발병시 나타날 수 있는 마우스의 고통에 대해 면역작용에 영향이 비교적 적다고 알려진 Acetaminophen을 사용할 수 있는데요. 이는 Acetaminophen이 NSAIDs와 COX-2 억제제보다 항염증 활성이 적기 때문입니다. 

투여 경로를 선택할 때에도 경구투여 혹은 주사를 이용할 경우에는 동물을 보정하는 과정에서 통증과 스트레스를 유발할 수 있으므로 음수나 사료에 섞어서 투여하는 것을 고려할 수 있습니다. 다만 이 방법을 이용할 경우 개체별로 섭취량이 다를 수 있으므로 장단점을 판단하여 선택해야 합니다.

그 외 관리방법으로 부드러운 깔짚을 이용하고 사료와 물에 접근이 용이하도록 cage 바닥에 내려주는 것도 도움이 될 수 있습니다. 

ARRIVE Guideline (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)

1) ARRIVE Guideline은 연구 결과에 대한 재현성(Reproducibility)을 높이고자 NC3Rs에서 개발한 가이드라인입니다. 재현성이란 같은 조건하에서 재실험하였을 때 기존 연구에서 보고되었던 결과가 동일하게 나타나는 것을 말하는데요. ARRIVE Guideline은 동물을 이용한 연구의 설계, 분석, 보고를 개선하여 재현성을 높이고자 동물실험 후 모든 과학 출판물에 포함되어야 할 최소한의 정보를 기술하는 20개의 항목으로 구성된 체크리스트 입니다. 

2) 이 가이드라인은 강제사항이 아니며 다양한 프로토콜에 따라 유연하게 사용될 수 있습니다. 

3) 실제 가이드라인은 Essential 10과 Recommended Set으로 구성되어 있습니다.  
  - Essential 10: 최소한의 기본 항목으로 이 정보가 없으면 결과의 신뢰성을 평가할 수 없다고 보고 있습니다. 
  - Recommended Set: 기본 항목 10가지를 보완하고 연구에 중요한 정보를 추가하는 데 사용할 수 있습니다. 

4) 동물 실험을 설계하는 단계에서 이 가이드라인을 참조하면 실험의 설계, bias 최소화, 표본 크기 및 통계 분석까지 신뢰할 수 있는 실험을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 논문 작성에 이 가이드라인을 적용할 경우 핵심적인 정보를 충분히 포함시킬 수 있어 중복실험을 방지하고 재현성을 높일 수 있습니다. 

5) 1,000개 이상의 journal과 단체가 ARRIVE Guideline을 적용할 것을 권장하고 있습니다. 

[Webinar: The ARRIVE guidelines 2.0 바로가기]

IPGTT 평가의 목적은 복강 내로 주사된 포도당이 체내에서 제거되는 정도를 측정하는 것으로 당 대사 이상 여부를 평가하는 것입니다. 이는 당뇨병이나 대사증후군과 같은 포도당 대사 장애를 감지하는 데 사용됩니다. 동물을 대략 16시간 동안 금식시키고, 복강내(IP) 주사로 포도당 용액을 투여하기 전에 공복 혈당 수준을 측정합니다. 그 후 다음 2시간 동안 다양한 시점에서 혈당 수치를 측정합니다.
 

1) 마우스를 사료나 분변 찌꺼기가 없는 깨끗한 cage에 옮겨 16시간 금식시키고 물만 공급한다.
2) 다음날 마우스를 실험실로 꺼내 와서 1두씩 깨끗한 cage로 옮기고, 각 마우스의 몸무게를 측정한다.
3) [개체별 포도당 주사액 준비] 각각 마우스에 복강 투여될 20% 포도당액이 2g glucose/kg으로 투여될 수 있도록 필요량을 계산하여 1ml 주사기에 뽑아 각 cage 앞에 둔다.

      volume (㎕) = 10 x body weight (g)

4) [마우스 꼬리 절단 및 공복 시 혈당 측정] 동물을 올릴 테이블을 알콜 스프레이하여 소독하고 마우스 꼬리를 알콜솜으로 소독한 후, 일회용 blade를 이용하여 마우스 꼬리 끝을 1mm 절단하면 나오는 혈액을 혈당측정 검사지의 노란창에 가져다 대어 혈액을 흡수시키고 5초 후 혈당 수치가 화면에 나타나면 기록한다.
5) [포도당 복강 투여] 미리 개체별로 뽑아 둔 포도당을 복강 투여한다.
6) [혈당측정] 투여 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후에 혈당을 측정, 매 측정 시 마다 마우스의 꼬리 끝부분의 응혈을 제거하고 마사지 하듯 눌러 다시 소량의 혈액이 나오도록 한다. 측정이 끝날 때마다 꼬리 끝부분을 거즈로 살짝 눌러주어 지혈한다.
7) 실험이 끝나고 출혈이 없는 것을 확인한 후, 마우스를 원래 케이지에 넣고 충분한 물과 사료를 공급한다.

Grip Strength 평가의 목적은 마우스 앞다리의 잡는 힘과 앞다리와 뒷다리의 결합된 잡는 힘을 측정하여 마우스의 근력을 분석하는 것입니다.

1. 앞다리 근력 측정

 1) 오직 앞발로만 격자(Grid)를 잡을 수 있도록 마우스를 격자(Grid)위로 부드럽게 낮춥니다.
 2) 몸통을 수평으로 유지시키고 격자(Grid)에서 발이 풀어질 때까지 일정하게 지속적으로 잡아 당깁니다. (갑자기 세게 잡아당기지 않도록 주의) 
 3) 동물이 격자를 놓았을 때, 동물의 최대 근력치가 화면에 나타납니다. 
 4) 3회 반복하여 평균값을 구하고 몸무게로 보정합니다.

2. 앞다리-뒷다리 근력 측정

 1) 앞발과 뒷발로 동시에 격자를 잡을 수 있도록 마우스를 격자의 꼭대기 위로 부드럽게 낮춥니다.
 2) 몸을 격자에 평행하게 유지시키고 격자에서 완전히 발이 풀어질 때까지 일정하게 지속적으로 잡아 당깁니다. (갑자기 세게 잡아당기지 않도록 주의) 
 3) 동물이 격자를 놓았을 때, 동물의 최대 근력치가 화면에 나타납니다. 
 4) 3회 반복하여 평균값을 구하고 몸무게로 보정합니다.

이 평가는 동물에게 환경적 맥락(Context)과 조건자극(CS, 톤 사운드)을 전기쇼크(US, 가벼운 발 전기충격)와 함께 주어(공포학습), 공포 조건에 대한 학습을 평가하는 검사입니다. 검사는 맥락조건화(Contextual Fear Conditioning)와 단서조건화(Cued Fear Conditioning)로 나누어 평가합니다. 공포 학습 후에, 전기쇼크(US) 없이 환경적 맥락(Context) 혹은 조건자극(CS, 톤 사운드)을 주게 되면, 공포 상태가 움직임이 없는 혹은 감소된 형태로 나타납니다. 움직임이 없는 시간(Freeze Time)은 학습/기억 행동을 평가하는데 사용됩니다.

1. 평가 장비
 1) Fear Conditioning System
   - 챔버(방음상자): 챔버는 shock generator, 카메라, light, 스피커, metal floor grid가 있는 평가용 cage를 포함
   - 바닥이 그리드(Grid)로 구성되어 전기쇼크를 전달할 수 있는 조건화 평가용 cage가 chamber 안에 위치
   - 챔버에는 전기쇼크(US)를 전달하기 위한 장치(Shock Generator)와 조건자극(CS)을 전달할 수 있는 장치(소리자극 전달 스피커) 있음

2. 평가 방법 
 1) DAY 1 (공포 학습)
   - 적응: 120초 → Tone(80dB, 3600Hz): 30초 → Foot Shock(0.6mA): 2초 (tone의 마지막 2초에 같이 자극되어 같이 종료됨) → 30초간 머무른 후, 원래 cage로 위치
 2) DAY 2 (Contextual Fear Conditioning, 맥락 조건화 평가): 마우스 조건화 상자에 둔 상태에서 소리 자극을 제시하지 않고 동결 반응을 측정하여 장소에 대한 공포 기억 평가
 3) DAY 3 (Cued Fear Conditioning, 단서 조건화 평가): 장소에 대한 공포 기억의 요소를 제거하기 위해, 새로운 환경이 조성된 챔버에 동물을 넣고, 소리 자극을 제시하여 나타나는 동결 반응을 측정

일반적인 활동 수준, 총 운동활동 및 탐색습관을 결정하는 데 사용되는 간단한 감각 운동 테스트입니다. 이를 통해 불안 정도와 탐험 욕구를 평가할 수 있습니다. 마우스가 open field arena에서 중앙(불안한 위치)보다는 주변 부위에서 더 많은 시간을 보내며 자신을 보호하려는 본능에 기반하여 평가합니다.
 

1. 평가 장비
  1) arena
     크기: 44.5 x 44.5 cm , 장비 사양에 따라 activity 센터 부착 
  2) 장비 자체 기록 혹은 video tracking system을 이용한 움직임 기록
 

2. 평가 방법
   실험을 수행하는 마우스를 arena 내의 center 앞의 periphery 영역에 마주보게 놓은 후, 20분간 움직임을 기록합니다. 기록된 영상을 통해 중심부 및 주변부에 따른 이동거리, 이동시간, rearing 등을 측정할 수 있습니다. 

Rotarod 평가는 마우스에서 운동 조화를 평가하기 위하여 사용됩니다. 마우스는 돌아가는 막대기(Rod) 위에서 균형을 유지해야만 합니다. 일정한 속도(10rpm)로 유지되거나 계속적으로 가속(4-40rpm)되며 돌아가는 막대기에서 마우스가 떨어질 때까지 걸리는 시간(Latency Time)을 측정합니다.

- 가속도 평가: 3일 동안 3개 set의 실험을 연속으로 진행

* Accelerating Rota Rod with Touchscreen: Model No.LE8505 (Harvard Apparatus, USA)

Y Maze Spontaneous Alternation는 마우스가 새로운 환경을 탐험하려는 의지를 측정하는 행동평가 방법입니다. 마우스는 일반적으로 이전에 방문한 곳으로 돌아가는 것보다 새로운 공간을 탐험하는 것을 선호합니다. Hippocampus, septum, basal forebrain, prefrontal cortex 등 뇌의 많은 부분이 이 작업에 관여합니다.
  

1. 평가 장비
  1) Y자 모양의 미로
    - 총 3개의 동일한 통로가 각각 120°각도를 이루며 위치해 있음 (통로 규격: 35cm[길이] X 5cm[넓이] X 10cm[높이])
    - 흰색 (검정색 계통 마우스에 사용), 검정색 (흰색 계통 마우스에 사용)
  2) Video Tracking System
    - 카메라는 천장에 달려 있고, 컴퓨터에 연결되어 프로그램을 이용해서 조절, 촬영 후 분석

2. 평가 방법
  1) 동물을 행동평가실로 이동시킨 후 실험실 환경에 두어 30분간 적응, 행동 평가실의 조도는 가장 어둡게 설정
  2) Y자형 아크릴 미로의 경우, 평가하는 마우스 계통의 색상과 대비되는 색상을 선택 (흰색: 검정색 계통 마우스에 사용, 검정색: 흰색 계통 마우스에 사용)
  3) 마우스의 꼬리를 잡아 cage에서 꺼낸 후, 마우스를 하나의 arm 통로 끝 벽을 보도록 위치
  4) 8분(실험설정에 따라 변경 가능) 간 마우스가 Y자형 미로를 자유롭게 이동할 수 있도록 하며 측정

3. 평가 분석
 - 미로 중앙으로 들어간 후, 동물은 세 개의 통로을 자유롭게 탐색할 수 있는데 진행하는 동안 마우스는 최근에 방문 하지 않은 통로(새로운 통로)에 들어가는 경향을 보여야 합니다. 이 테스트는 형질전환 마우스의 인지 결핍을 정량화하고 평가하는데 사용됩니다.