Parabiosis(병체결합)는 외과적 수술을 통해 두 생물의 혈관을 연결하고 순환계를 공유하도록 하는 실험기법입니다. 혈액 속 다양한 분자와 세포를 교환하는 parabiosis 실험모델은 노화, 대사질환, 감염 등의 다양한 연구에 이용됩니다.

Isochronic parabiosis(등시성 병체결합)은 같은 종의 동일 연령의 동물모델을 연결하는 반면, heterochronic parabiosis(이종성 병체결합)은 서로 다른 연령의 동물모델을 연결하는 실험방법입니다. 특히, heterochronic parabiosis 동물모델은 노화 진행 및 노인성 질환 연구에 이용됩니다.

Parabiosis에는 유전적으로 동일한 isogenic 또는 하나의 대립유전자만 차이나는 congenic 마우스 모델이 사용되기 때문에 면역 거부반응이 일어나지 않습니다.

* 그림출처:  Scholand KK et al. Int J Mol Sci. 2023;24(5):4897.

염증성 장질환 마우스모델은 유전자 조작 마우스 및 약물 투여를 활용한 모델이 있습니다. 가장 대표적인 유전자 조작 마우스로는 Interleukin 10 knockout 마우스 모델이 있습니다. 이 마우스는 염증반응을 억제할 수 있는 interleukin 10 유전자가 제거되어 있기 때문에 염증반응이 활발하게 일어납니다. 장에는 특히 많은 염증세포가 존재하기 때문에 IL-10 knockout 마우스는 심한 염증성 장질환이 발생합니다. 이외에도 Interleukin 2 knockout 마우스 모델 역시 염증성 장질환 모델로 많이 사용됩니다.

약물 투여를 활용한 마우스로는 Dextran Sodium Sulfate(DSS)을 2~5% 농도로 음수에 타서 제공하는 방법이 있습니다. 이 경우에는 보통 5~10일 안에 염증성 장질환이 유발됩니다. DSS 이외에도 TNBS(Trinitrobenzene Sulphonic Acid)를 투여하여 대장에서 염증반응을 유도하는 모델도 있습니다. DSS 및 TNBS 등의 약물은 마우스 뿐만 아니라 랫드에서도 사용됩니다. 
 

ADHA 동물모델은 대부분 과잉행동, 부주의, 충동행동을 보이는 모델입니다. 따라서 ADHD와 관련된 행동실험을 수행할 때 개체의 보행활동, 시공간 주의능력, 긴장 수준을 측정하는 것이 필요합니다. 또한 주의에 따른 학습능력 검사와 성행동 검사를 병행하는 것이 추천됩니다. ADHD 동물모델에서 사용하는 검사에는 다음의 표와 같은 검사들이 사용됩니다. 

마우스 및 랫드 비강 내 점적 방법은 다음과 같습니다.

1) 비강 내 투여 전에는 마취가 추천되며, 마취 후에는 마취 모니터링이 필요합니다. 
2) 동물의 목덜미를 잡고 코가 위를 향하게 보정합니다. 
3) 파이펫을 사용하여 투여물질을 한방울씩 주입하며, 주입 시 동물이 잘 흡입하는지 확인합니다.
4) 마취 회복 전 동물이 정상적으로 호흡하고 있는지 확인합니다. 

UCSF IACUC 가이드라인에 따른 비강 내 투여 용량은 다음과 같습니다. 

피부 자극시험의 경우, 과거에는 알비노 토끼의 피부에 시험물질을 도포하여 1~3일 내 홍반, 가피형성 및 부종의 유무를 관찰해 점수를 매기는 방식으로 실험을 진행하였습니다. 현재는 이러한 동물실험을 수행하지 않고 인체피부모델을 사용하여 실험을 진행할 수 있습니다. 특히, OECD에서 채택하여 국제적으로 이용되고 있는 피부 모델은 아래와 같습니다.
 

이러한 피부모델들은 약한 자극성 물질인 GHS 범주3 물질들은 평가할 수 없으나 자극성 물질인 GHS 범주 2물질은 평가할 수 있기에 동물실험의 대체방법으로 활용할 수 있습니다.
 

[동물자원의 기탁∙등록] 

국가연구개발 사업을 통해 확보된 생물자원 연구성과물은 기탁등록보존기관에 생명연구자원을 기탁등록해야 합니다. 생물자원 연구성과란 국가연구개발사업으로 창출된 미생물, 동물, 식물, 유전체자원 등의 실물 및 자원정보 등을 의미하며, 이 중 동물자원은 인간세포주, 동물세포주, 융합세포주, 수정란 등을 말합니다. 

대표적인 기탁등록보존기관은 한국생명공학연구원으로 '생물자원 연구성과 기탁 및 활용 지원 홈페이지' (https://biorp.kribb.re.kr/)에서 자세한 사항의 확인이 가능합니다. 생명자원 관리 및 유통은 주로 한국생명공학연구원이 담당하지만 생명자원의 다양성을 고려하여 중앙행정기관이 지정한 기관에 자원을 기탁∙등록할 수 있습니다. 연구자는 수행한 연구개발사업의 주관기관으로부터 지정기탁 ∙ 등록처를 확인하여 기탁 ∙ 등록을 진행해야 합니다. 관련 법조항은 [국가연구개발혁신법] 제33조, [생명연구자원의 확보 ∙ 관리 및 활용에 관한 법률] 제8조, 제11조 등 입니다. 
 

[동물자원 기탁등록 및 보존을 위한 마우스자원뱅킹]

1. 마우스자원뱅킹: 마우스 뱅킹은 정자나 수정란을 액체 질소로 동결하여 유용한 모델 동물 자원을 실제로 육성하지 않고 필요할 때 살아 있는 마우스로 재생산할 수 있도록 하는 장기적인 자원 보존 방법입니다. 이 방법은 특히 희소하거나 특수한 유전자변형마우스(GEM)와 같은 모델동물 계통을 유지하는데 필수적이며, 교배 실패로 인한 GEM의 손실을 방지할 수 있습니다. 또한 다른 연구 기관으로의 이전이나 청정화가 필요한 경우 IVF(체외수정) 진행 시에도 사용할 수 있습니다. 

2. 국가연구개발사업에 따른 연구성과물이 아니더라도 장기적인 연구자원의 보존을 위해 (재)국가마우스표현형분석사업단의 Mouse One Portal(https://mouseinfo.kr/) 또는 한국생명공학연구원의 실험동물자원센터(https://mouse.kribb.re.kr/)를 포함하여 마우스자원 뱅킹기술을 가지고 있는 기관과 시설에서 마우스 동물자원을 보존할 수 있습니다. 

[유전자변형생물체의 정의와 유전자변형마우스의 확인방법]

‘유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률’에 따른 관리대상이 되는 “유전자변형생물체”란 다음의 ‘현대생명공학기술’을 이용하여 ‘새롭게 조합된 유전물질’을 포함하고 있는 생물체를 말합니다. 

  - 인위적으로 유전자를 재조합하거나 유전자를 구성하는 핵산을 세포 또는 세포 내 소기관으로 직접 주입하는 기술
  - 분류학에 의한 과(科)의 범위를 넘는 세포융합기술

 따라서 자발적으로 발생한 돌연변이(Spontaneous Mutant)는 유전자변형동물에 해당하지 않습니다.  하지만 유전자변형생물체의 범위에 속하지 않는 spontaneous mutant라고 하더라도 변형된 유전자가 미치는 영향이 완전히 밝혀지지 않은 경우, 유전자변형생물체와 동일하게 관리할 것을 권장할 수 있습니다.  마우스 게놈 인포메틱스(Mouse Genome Informatics: MGI) 에서 마우스의 돌연변이 정보를 확인할 수 있습니다. 

MGI에서 마우스의 돌연변이 정보 확인의 예시입니다. 관련 법령은 유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률 제2조 등 입니다. 

[암컷의 교배확인 및 날짜 계산]

1. Vaginal plug 를 통한 교배 확인

암컷과 수컷을 교배한 다음 날 아침 암컷의 질 입구에서 vaginal plug(질전)를 확인하여 교배여부를 판단할 수 있습니다. Vaginal plug는 수컷의 coagulating gland와 vesicular glands의 분비물로 인해 형성되는 하얀 응고물로서 교미한 암컷의 질 입구에서 관찰됩니다. Vaginal plug를 보려면 암컷의 꼬리 밑 부분을 들어 올려 질 입구를 검사하여 흰색 덩어리가 있는지 확인해야 합니다. 잘 보이지 않는다면 멸균된 면봉이나 포셉 등으로 외음부를 살짝 벌리면 더 잘 보일 수 있습니다. Vaginal plug는 일반적으로 시간이 지나면 탈락되기 쉬우므로 오전 중에 확인해야 합니다. 
 

2. 임신일령 또는 교배일령 계산

  1) Vaginal plug가 확인된 경우, 다음날이 수정 첫날이라고 간주됩니다. Vaginal plug가 있다고 해서 임신이 보장되는 것은 아니므로 교미 후의 암컷의 외양을 살펴볼 필요가 있습니다. 
  2) 대리모 제작 목적으로 교배한 경우, vaginal plug가 확인된 당일을 교배일로 간주하여 수정란을 이식합니다. 

*그림 1. Vaginal Plug 확인방법, 출처: Kumamoto University. http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/transfer.html

동물의 생존을 유지하면서 반복적인 소량 채혈이 가능한 방법에는 안면정맥 채혈, 복재정맥 채혈, 경정맥 채혈 등이 있으며 이 중 경정맥 채혈방법은 다음과 같습니다. 
 

[Jugular Vein Bleed (경정맥 채혈)]

마우스 머리 뒤쪽 피부를 잡아당겨 두경부가 과신전 되도록 보정합니다. 목 부분을 알코올로 소독하면 푸른색의 경정맥을 확인할 수 있습니다. 경정맥은 sternoclavicular junction(흉쇄관절: 흉골과 쇄골사이 관절)에서 2~4mm 떨어진 곳에 위치합니다. 25G 바늘을 뒤쪽에서 머리쪽 방향으로 접근하여 경정맥에서 채혈하는 방식입니다. 

* 그림출처:  Hoff J. Lab Animal. 2000;29(10):47-53.

마우스 안면정맥(Facial Vein or Submandibular Vein) 채혈은 마취 없이도 (또는 마취 권장), 경험이 많지 않은 연구자도 비교적 쉽게 채혈이 가능한 방법입니다. 채혈이 가능한 양은 마우스 체중에 따라 차이는 있지만 최대 300μl 정도 반복적으로 채혈이 가능합니다. 안면정맥은 하악골 뒤쪽 바로 위에 위치하고 있습니다. 혈관 위치를 파악하여 Animal Lancet과 같은 미세침으로 안면정맥을 찌른 후, 밖으로 나오는 혈액방울을 채혈용 튜브에 담는 방식입니다.  

[채혈 방법]

1. 준비물: 란셋(23~25G), 채혈 튜브, 지혈용 탈지면 (또는 거즈)
2. 엄지와 검지를 이용하여 마우스의 귀 뒷부분을 끌어 당겨 보정한다. 
3. 란셋을 이용하여 마우스 안구와 입 끝을 직선으로 연결 시 90˚에서 만나는 지점을 찌른다. 
4. 채혈 튜브를 이용하여 혈액을 채취한 후 탈지면 또는 거즈 등을 이용하여 지혈한다. 

* 그림출처: MEDIpoint. For Use on Mice. https://medipoint.com/for-use-on-mice/