제노프스의 배아 표피는 사람의 기관지와 매우 유사한 구조를 가지고 있습니다. 사람의 기관지에 존재하고 있는 세포를 배아 단계의 표피에서 확인할 수 있기 때문에 절개 과정이 필요없이 쉽게 in vivo로 연구를 진행할 수 있다는 장점이 있습니다.

최근 발표된 논문에 따르면 기관지에 존재하는 세포들을 대부분 포함하고 있기 때문에 사람의 기관지에 작용하는 질병과 약물에 대한 연구가 굉장히 쉬운 모델입니다.

* 그림출처: Walentek P. Genesis. 2021;59(1-2):e23406.

이런 제노프스의 표피는 당화(Glycosylation)되어 있는 점액질을 분비한다고 보고되어 있고 당화된 단백질을 탐지할 수 있는 렉틴(Lectin)을 이용하여 확인할 수 있습니다. 렉틴을 이용한 ELISA 기법을 이용하면 제노프스가 분비한 점액질의 양을 확인 가능하고 항체의 사용이 어려운 제노프스의 표피를 렉틴 단백질을 사용하여 염색하면 점액질을 염색하여 확인 가능합니다.

* 그림출처: Sim HJ et al. PLoS One. 2018;13(2):e0193310.

제노프스에서 in situ hybridization 수행을 위한 probe 제작 방법은 주로 in vitro transcription을 이용하여 만들어집니다. In vitro transcription은 Sp6, T7과 같은 promoter를 사용하여 RNA를 합성하는 방법으로 합성방법은 2가지로 나눌 수 있습니다.

  1) 목표로 하는 염기서열을 Sp6 또는 T7 promoter를 가지고 있는 plasmid에 클로닝하여 합성

  2) PCR primer에 Sp6 또는 T7 염기서열을 포함시켜 목표로 하는 유전자 염기서열을 증폭시킨 후 합성

* 그림출처: NIH. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techish/

In situ hybridization의 시각화는 주로 2가지 방법을 이용하여 진행하게 됩니다.

  1) CISH(Chromogenic Mount In Situ Hybridization): probe가 붙어있는 위치에 화학작용으로 염색하여 확인하는 방법

  2) FISH(Fluorescence In Situ Hybridization): 형광을 이용하여 직접적으로 probe가 붙어있는 위치를 확인하는 방법

FISH 기법을 사용 시 형광염색과 같이 in situ hybridization의 결과를 확인할 수 있습니다.

* 그림출처: Kumar A. Today's Clinical Lab. https://www.clinicallab.com/fish-fluorescence-in-situ-hybridization-22054

Microinjection을 통한 유전자의 조작은 유전자의 역할과 기능을 이해하는데 큰 도움을 줍니다. Microinjection을 하기 위해서는 원하는 DNA를 초파리 알에 넣을 수 있는 기계 및 용액 등을 먼저 준비해야 합니다. Microinjection 기계는 원하는 DNA를 알에 찔러 넣을 수 있는 injection 바늘, 소량의 DNA를 일정하게 나오게 하는 injection pump, 알을 확대해서 볼 수 있는 현미경 등이 필요합니다. 

그림 1. Microinjection 기계. (A) Microinjection 용 현미경, (B) Injection 바늘, (C) Injection Pump

초파리 알을 얻기 위해서는 대략 300마리 정도의 성충이 필요합니다. 성충을 egg lay plate가 놓인 embryo collection chamber에 넣고 약 30분간 방치시켜 초파리가 알을 낳도록 유도합니다. 최초로 알을 받은 plate는 embryo injection에 사용하지 않고 버린 후, 새로운 egg lay plate를 교체하여 상온에서(19-24 ºC)에서 30분간 다시 알을 받고 이 알로 injection을 진행해야 합니다. 알을 받는 시간이 30분을 경과하면 embryo의 발생단계가 late stage 2를 지나게 되고, DNA를 주입해야 하는 알의 posterior 방향에 pole cell(생식세포)의 발생도 시작됩니다. Pole cell의 발생이 시작되면 DNA를 알에 제대로 주입시킬 수 없기에 시간을 잘 지켜서 injection을 해야 합니다.
 

그림 2. (A) Egg Lay Plate, (B) Embryo Collection Chamber, (C) Embryo 발생단계

* 그림출처: Gompel N, Schröder EA. Drosophila germline transformation. 2015. http://gompel.org/wp-content/uploads/2015/12/Drosophila-transformation-with-chorion.pdf

Egg lay plate에 받아진 알을 모아서 멸균수로 씻어준 후 egg의 chorion층을 제거하기 위해서 50% sodium hypochlorite 용액에 egg를 1분 동안 넣어준 후, 다시 멸균수를 이용하여 chorion이 제거된 egg를 씻어줍니다. 양면 테이프를 일정한 크기로 자른 후 Heptane 용액에 24-48시간 담구어 접착성 물질을 녹여낸 용액을 cover glass위에 도말하고 chorion이 제거된 egg를 일정한 방향으로 정렬한 후 상온에서 15-20분간 방치하여 건조 시킵니다. Chorion이 제거된 egg가 과도하게 건조되는 것을 방지하기 위해 Halocarbon oil (oil 700: oil 27 = 3:1)을 건조된 egg에 적당량을 도말하여 줍니다. Egg가 정렬되어 있는 cover glass를 테이프를 이용하여 slide glass 위로 다시 고정시킨 후 microinjection 장비에 고정시킵니다. 그리고 egg의 posterior 부위로 injection을 합니다. 

그림 3. Egg 정렬하는 방법

* 그림출처: Gompel N, Schröder EA. Drosophila germline transformation. 2015. http://gompel.org/wp-content/uploads/2015/12/Drosophila-transformation-with-chorion.pdf

Microinjection이 끝난 egg는 cover glass만 떼어내서 일반 배지로 옮겨 준 후 성체 초파리가 깨어날 때까지 24 °C에서 보관하면 됩니다. 깨어난 초파리는 목적에 맞게 스크리닝하여 원하는 초파리를 얻으면 됩니다.
 

그림 4. Injeciton 부위 및 방법

* 그림출처: (A) Ringrose L. Methods Mol Biol. 2009;561:3-19., (B) Gompel N, Schröder EA. Drosophila germline transformation. 2015. http://gompel.org/wp-content/uploads/2015/12/Drosophila-transformation-with-chorion.pdf

형질전환 초파리를 제작하기 위해서는 먼저 목적하는 초파리에 해당하는 벡터를 제작하고, 이 벡터를 초파리 egg에 microinjection을 한 후 성체가 깨어나면 특정 마커를 이용한 스크리닝을 통해서 목적하는 초파리를 얻으면 됩니다. 형질전환 초파리 제작을 위해 사용되는 벡터는 염색체에 삽입되는 방식에 따라 두 종류로 나눌 수 있습니다. 하나는 P-element를 이용하여 랜덤하게 염색체에 벡터를 삽입하여 다양한 insertion 라인을 얻는 방식 입니다. P-element는 야생 초파리에 존재하는 이동성 유전 요소(전이인자, transposon)로 초파리 염색체의 수천 개의 다른 위치에 무작위로 삽입될 수 있습니다. P-element의 전위를 촉매하는 transposase를 coding 하는 유전자와 transposase에 의해서 인식되는 P-element 말단의 특수 서열을 통해서 다양한 위치에 삽입될 수 있습니다(그림 1).
 

그림 1. P-element를 이용한 방법

* 그림출처: Szauter P. The Course BIOL 202 Genetics. https://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23.html

다른 한가지는 초파리 염색체의 특정 부위에 벡터를 삽입하는 방식입니다. PhiC31 recombination system은 bacteriophage에서 유래되었고 attP 와 attB 그리고 PhiC31 recombinase로 구성됩니다. pBPGUw 벡터에는 attB site가 내장되어 있고 injection 될 초파리에는 attP site가 삽입되어 있습니다. 관심 유전자를 attB donor 플라스미드에 클로닝하고 PhiC31 integrase 플라스미드를 같이 발현시켜주면 초파리 염색체의 attP 부위의 부위 특이적 재조합을 매개하면서 삽입이 이루어지게 됩니다(그림 2). 이 시스템은 attP landing site에 선택적으로 insertion 되는 특성으로 인해서 P-element와 달리 한번의 injection으로 한 종류의 형질전환 초파리 라인만 만들 수 있습니다.
 

그림 2. PhiC31 Recombination System을 이용한 방법

* 그림출처: BioCat. PhiC31 Integrase Vector System. https://www.biocat.com/categories/cloning-expression/mammalian-expression/phic31-integrase-system

Gal4-UAS 시스템은 효모로부터 도입된 전사 활성화 시스템으로 초파리 모델 연구에서 널리 사용되고 있습니다. 이 시스템은 특정 조직, 세포, 시기에서 정밀하게 유전자 발현을 조절할 수 있습니다.

Gal4-UAS 시스템의 작동 방식은 다음과 같습니다. Gal4인자는 특정한 DNA 서열인 Upstream Activation Sequence(UAS)를 인식하는 효모 전사 인자입니다. Gal4 단백질은 UAS 서열을 인식하고 UAS 서열에 특이적으로 결합합니다. Gal4 전사 인자가 특정 promoter에 의해 제어되는 초파리를 만들어서 사용하게 됩니다. UAS는 다수의 Gal4 결합 부위를 포함하는 짧은 DNA서열입니다. UAS 뒤에 과발현을 시키고 싶은 유전자(e.g. 특정ORF), knock-down을 하고 싶은 유전자(e.g. ORF-RNAi), 형광물질을 발현하는 유전자(e.g. GFP, RFP) 등을 위치시킨 후 초파리를 만들어 사용하게 됩니다.

Gal4 초파리와 UAS 초파리를 교배한 F1은 특정 promoter에 의해서 특정 조직, 시기에 발현되는 Gal4가 UAS에 결합하여 UAS 뒤에 위치한 관심 유전자를 발현할 수 있게 됩니다.
 

초파리의 생활사는 알, 유충, 번데기, 성체의 4단계를 거치게 됩니다. 유충은 또다시 1령, 2령, 3령의 3단계로 나눌 수 있습니다. 알에서 성충으로 깨어나기까지 25°C에서 10일정도가 걸립니다. 초파리의 생활사는 알(egg)에서 시작하게 됩니다. 초파리 암컷과 수컷이 만나 교배를 하면 암컷이 알을 낳게 되고, 알의 크기는 대략 0.5mm정도로 아주 작습니다. 알에서 태어난 초파리는 유충(Larva) 단계로 넘어가게 됩니다. 유충은 외부 표면에서 내부로 향하는 내장을 가지고 있고 먹이를 찾아 바로 먹으면서 급격한 생장을 하게 됩니다. 두 번의 탈피를 하면서 대략 3일동안 생장과 발달을 하게 됩니다.  번데기(pupa) 동안에는 대부분의 유충 조직은 분해되고, 성체기관은 미분화된 세포 주머니인 상상원반세포(imaginal disc cell)에서 발생합니다. 상상원반세포는 변태를 겪는 곤충의 유충 내부에서 발견되는 주머니 모양의 상피구조로 머리, 흉부, 사지 및 생식기의 외부구조로 변하게 됩니다. 번데기에서 탈피를 하게 되면 성충(adult)이 되고 이들은 대략 3~5일 이후부터 생식능력을 가지게 되고 평균 60~80일을 살다 죽게 됩니다. 
 

그림 1. 초파리의 생활사

그림 2. 초파리의 발달단계별 사진: (A) 알(Egg), (B) 유충(Larva), (C) 번데기(Pupa), (D) 성충(Adult)

그림 3. 초파리 3령 유충의 imaginal discs

* 그림출처: Blair S. Encyclopedia of Insects. 2009:489-492.

초파리도 뇌가 있습니다. 초파리 유충의 뇌는 성충의 뇌에 비해 작고 먹이를 찾고 기본적인 기능을 조절하는데 집중되어 있습니다.  반면, 성충은 복잡한 행동과 학습 능력을 수행하기 위해 더 크고 복잡한 뇌 구조를 가지고 있습니다. 최근 연구는 초파리 유충에서 3,016개의 뉴런과 54만 8천개의 시냅스를 하나하나 찾아내 분류하여 신경세포(뉴런)와 뉴런의 연결점인 시냅스를 전부 규명한 뇌 지도를 완성하기도 하였습니다.
 

그림 1. 초파리의 유충의 뇌(A)와 성충의 뇌(B)

* 그림출처: (A) Lu W and Gelfand VI. 2018 Photomicrography Competition, Nikon. 2018., (B) Long X, et al. Nat Methods. 2017;14(7):703-706.

초파리도 기억을 할 수 있습니다. 특정 물질을 찾아가거나 2가지 이상의 물질 중에서 한가지를 선택할 때 기존에 학습된 기억에 의존합니다. 특히 초파리는 후각 기억형성에 대해서 연구가 잘 되어 있습니다.  후각 기억형성을 단기기억(short-term memory, STM), 중간기억(intermediate-term memory, ITM), 마취 저항성 기억(anesthesia-resistant memory, ARM) 및 장기기억(long-term memory, LTM)의 4가지 단계로 구분할 수 있습니다. 특정 정보를 인코딩하게 되는 학습(Acquisition, LRN)을 하게 되면 이후 단기기억이 시간이 지남에 따라 장기기억으로 안정화 하거나 망각하는 프로세스를 거치게 됩니다. STM은 훈련 후 높은 학습수준을 유지하다 60분 이내에 사라지는 기억을 말하며 LTM과 ARM은 오래 지속되는 기억을 말합니다. 유전적 해석으로 볼 때 ASM을 STM과 ITM으로 분해할 수 있고, ARM과 LTM을 기능적으로 독립된 기억단계로 분해할 수 있음이 밝혀졌습니다. 또한 LTM은 단백질 합성을 요구하는 반면 ARM은 그렇지 않다는 차이가 있습니다.
 

그림 2. 초파리 기억의 일시적인 단계: (a) 기억 저장의 시간적 단계, (b) 특정 유전자 돌연변이로 인해 해당 단계가 중단될 수 있음을 나타냄.

*그림출처: Tully T, et al. Nat Rev Drug Discov. 2003;2(4):267-277.

A-GAL4; B-RNAi line에서 A-GAL4 line을 만들려고 합니다.

A-GAL4 (2^nd)와 B-RNAi (3^rd)를 합쳐서 A-GAL4; B-RNAi line을 만들려고 합니다.

Am(2^nd)와 Bm(2^nd)를 이용해 Am, Bm double mutant line을 만들려고 합니다. 이 때, 두 돌연변이가 같은 염색체에 있기 때문에 recombination(재조합)을 시켜야 하며 이러한 과정을 통해 만들어진 line을 recombinant(재조합) line이라고도 부릅니다. 

참고로 A와 B를 double mutant line 대신 각각 GAL4, RNAi 형질전환체로 치환하면 GAL4, RNAi recombinant line을 만드는데 위의 방식을 활용할 수 있습니다.

만약에 GAL4와 RNAi를 교배할 때 phenotype(표현형)을 알고 있으면 genotyping(유전형 분석)을 거치지 않고 손쉽게 recombinant line을 확립을 할 수 있습니다. 이후에 immunohistochemistry staining 등의 기법을 통해 RNAi의 효과를 검증하는 것으로 line이 잘 만들어졌는지 확인합니다.

초파리를 새로운 배양배지로 옮겼을 때 알을 낳지 않으면 일단 male이나 virgin female이 들어있는지 확인해 봅니다. 새로운 배양배지에서 초파리를 교배시킬 때, virgin female과 male의 비율이 3:1정도로 하는 것이 이상적이므로 이 비율에서 많이 벗어났는지 확인합니다. 일반적으로 male의 경우 3일 이상 성숙하면 교미를 하게 됩니다. 하지만 너무 성숙한 초파리는 교미 능력이 감소하게 되므로 너무 나이가 든 개체는 쓰지 않는 것이 중요합니다. 

초파리를 배양하는 온도가 너무 높거나 낮으면 viability(생명력)나 fecundity(알 낳는 능력)이 감소합니다. 초파리를 사육할 때 18-30℃ 사이에서 키우는 것이 적절합니다. 배지 상태도 중요하므로 배가 상태가 안 좋다면 신선한 배지로 옮겨서 경과를 지켜봐야 합니다.