우리나라에서는 한림대학교에서 제노프스 소재 은행을 운영하고 있습니다 ¹.  연구용으로 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis)를 이용하고자 하는 경우 소재은행을 운영하고 있는 김재봉 교수 연구실에 연락하여 분양 신청을 할 수 있습니다. 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)의 경우 정식 분양 서비스는 진행되지 않고 있지만 국내 연구하고 있는 연구자들에게 개인적으로 문의할 수 있습니다. 제노프스 연구자들의 모임인 한국 세포분자생물학회(KSMCB) 제노프스 분과² 에 개인적으로 연락해 보실 수 있습니다. 

외국의 경우 미국과 영국의 소재 은행, 미국의 상업 업체에서 제노프스를 수입할 수 있습니다. 미국 Marine Biological Laboratory (MBL)에 있는 National Xenopus Resource Center (NXR) ³, 영국 University of Portsmouth에 있는 European Xenopus Resource Center (EXRC) ⁴ 가 연구용 제노프스를 분양 및 판매하고 있습니다. 또한 이들 센터에서는 연구용으로 개발된 유전자 변형 transgenic 라인 및 inbred 개체(J-strain) 등도 판매하고 있습니다. 

상업적으로 제노프스를 판매하는 곳들도 있는데 미국의 Xenopus1⁵ 과 Xenopus Express⁶ 가 전세계 제노프스 연구자들이 많이 이용하는 업체입니다. 다만 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)의 경우 생태계 위해우려종으로 지정되어 있어⁷ 수입에 해당 지역의 지방 환경청의 별도 승인이 필요합니다. 관련해서 도움이 필요하신 경우 한국 세포분자생물학회(KSMCB) 제노프스 분과² 에 연락을 주시면 도움을 받으실 수 있습니다. 

제노프스는 물고기와 사육 방법이 비슷하여 집에서도 쉽게 키울 수 있습니다. 다만 위에서 언급한 바와 같이 아프리카 발톱 개구리는 우리나라에서 서식하는 종이 아니고, 추가로 생태계 위해우려종으로 지정되어 있어 환경에 노출시키면 안됩니다. 집에서 키우던 발톱 개구리를 더이상 키울 수 없게 되었을 때에는 한림대학교 제노프스 소재 은행이나 KSMCB 제노프스 분과에 연락주시면 가까운 곳에서 있는 제노프스 분과 연구자와 연결시켜 드릴 수 있습니다. 
 

실험에 주로 사용되는 제노프스는 아프리카 발톱 개구리 Xenopus laevis 가 주로 사용되고 최근 서양 발톱 개구리 Xenopus tropicalis 도 많이 사용되고 있습니다. 원래 아프리카 발톱 개구리가 실험에 많이 사용되었는데, 유전체 복제(genome duplication)로 인한 4배체 유전체를 가지고 있어서 유전체 기반 연구에 어려움이 있었습니다 (염색체를 각 부모에게서 물려받아 한 쌍(2N)씩 가지고 있는 인간에 비해, 아프리카 발톱 개구리는 각 부모에게서 비슷한 염색체 2개씩 물려받아 두 쌍(2N)을 가짐). 이를 해결하기 위해 인간과 유사한 2배체(2N) 유전체를 가지는 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)가 연구에 활용되기 시작했습니다. 두 종의 유전체 모두 완전히 해독이 끝나서 현재는 두 종 모두 다양한 연구에 활용되고 있습니다. 

*그림출처: https://www.eurekalert.org/multimedia/922783, 위키피디아

큰 크기와 특이한 모양으로 인하여 아프리카 발톱 개구리와 환경유해종인 황소개구리를 혼동하는 경우가 많이 있는데, 계통수(phylogenetic tree)를 확인해보면 제노프스가 속한 발톱개구리과(Pipidae)는 개구리과(Ranidae)에 속한 황소개구리 (Lithobates catesbeianus) 뿐만 아니라 그 외 다른 개구리들과 진화적으로 큰 차이가 있음을 알 수 있습니다. 특히 올챙이 시절 물 속에서 살다가 개구리가 되면 육지에서 사는 일반적인 개구리에 비해서 제노프스를 포함한 발톱개구리과에 속하는 개구리들은 물고기처럼 평생 물 속에서 생활합니다. 

제노프스는 양서류이기 때문에 사육할 때 무엇보다 중요한 것 중의 하나가 물입니다. Embryo의 사육을 위해서는 pH, 염분, 온도를 모두 고려해야 합니다. 이를 위해 pH와 염분이 적합한 Marc's Modified Ringer's solution을 희석하여 사용합니다. 일반적으로 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis)는 1/3X MMR을, 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)는 1/9X MMR을  사육용 buffer로 사용합니다.

온도의 경우 일반적으로는 22~25°C 로 맞추지만 (일반적으로 상온(RT)으로 표현) 실험 계획에 따라 더 낮은 온도의 경우 천천히, 더 높은 온도의 경우 빠르게 발생합니다. 하지만 16 °C 미만, 28 °C 초과의 조건에서는 embryo가 죽을 수 있습니다. 온도에 따라 다르기는 하지만 두 달 정도 키우면 배아는 올챙이 과정과 변태 (metamorphosis) 과정을 거쳐 이후 두 다리가 모두 발생한 성체 개구리까지 도달할 수 있습니다. 발생학에서는 성체 개구리를 연구하는 경우가 많지는 않지만 조직 재생(tissue regeneration) 관련 연구나 유전학 연구에서 종종 활용되고 있습니다.

제노프스의 수정란은 수정 이후 세포분열을 거듭하여 형태를 바꾸는데 순차적으로 변하는 각각의 형태를 구분하여 stage 로 부릅니다. P. D. Nieuwkoop과 J. Faber가 1994년에 정리한 내용 ¹을 바탕으로 사용하여 “NF Stage” 라고도 부르며, 각 stage가 가지는 특징과 장기 형성 과정에 대한 특징은 제노프스의 정보를 관리하고 있는 Xenbase 데이터베이스에 해당 참고문헌에 나오는 이미지와 설명을 정리하여 공개하고 있습니다 ².

제노프스 배아는 수정 후 2-cell, 4-cell 등을 거쳐 안쪽에 빈 공간이 생기는 포배(blastula), 배엽을 형성하는 낭배(gastrula), 신경판이 나타나는 신경배(neurula), 꼬리싹기(tailbud-stage) 단계를 지나서 흔히 올챙이라고 부르는 tadpole 형태로 발생하게 됩니다. 그 이후 metamorphosis를 겪은 뒤 성체가 되기 까지 지속적으로 변화를 겪습니다. 발생 실험에서는 보통 NF stage 45 이전 단계를 주로 관찰하고 있습니다. 

* 그림출처: The Transcriptome of Xenopus Tropicalis; http://jason.chuang.ca/research/xenopus/

예쁜꼬마선충은 자웅동체와 수컷의 두 성별로 이루어져 있기 때문에 기본적으로는 자웅동체만으로도 strain을 유지할 수 있습니다. 하지만 실험의 필요에 따라 2개의 strain을 교배하여 특정 유전자의 기능을 살펴보아야 할 경우가 있습니다. 예를 들어, 실험 대상이 되는 형질전환 선충(transgenic worms)에 돌연변이(mutation)를 도입해서 그 효과를 살펴보는 경우나, 2개의 돌연변이를 포함한 선충(double mutants) 제작이 필요한 경우가 있습니다. 이 경우에는 하나의 strain으로부터 수컷을 얻어 다른 strain의 자웅동체와 교배함으로써 필요한 선충을 얻을 수 있습니다.

1. 수컷 만들기

일반적인 배양 조건에서 수컷은 아주 일부만 나타납니다 (~0.2%). XX염색체를 지닌 자웅동체와 달리 수컷은 XO염색체 상태로 X염색체를 1개만 가지고 있습니다. 따라서 감수분열 과정에서 염색체 분리가 제대로 일어나지 않았을 때 가끔 수컷이 출현합니다. 교배를 위해서는 많은 수의 수컷이 필요하며 다음과 같은 방법을 이용할 수 있습니다.

 1) 많은 수의 선충을 배양하여 자발적으로 생기는 수컷을 모아서 새로운 배지에 옮기고 자웅동체와 교배하면 더 많은 수컷 자손을 얻을 수 있습니다. 이후에는 수컷이 많이 포함된 배지를 주기적으로 배양함으로써 유지할 수 있습니다.

 2) 열충격(heat shock)을 이용해 수컷을 많이 얻을 수 있습니다. 막 성숙한 단계의 자웅동체 성체(young adult hermaphrodites) 10~20 마리를 배지에 옮기고 30˚C에서 16시간 이상 / 또는 34˚C에서 3-4시간 / 또는 37˚C에서 2시간 배양하면, 열충격에 의해 염색체 분리의 이상이 유도된다고 알려져 있습니다. 열충격을 받은 자웅동체가 낳은 자손에 포함된 수컷을 선별하여 키웁니다.

 3) 가능한 경우, 유전적으로 많은 수의 수컷을 만들 수 있는 Him(high incidence of males) 유전자의 돌연변이 strain을 이용하기도 합니다. 대표적으로 이용하는 strain은 him-5 또는 him-8 돌연변이 선충이며, 이 경우 전체 자손 중 20~40%의 개체가 수컷입니다.
 

2. 교배하기

위 방법을 통해 하나의 strain에서 많은 수컷을 얻었다면 다른 strain의 자웅동체와 교배를 시킵니다. 원하지 않는 유전자가 섞이는 상황을 방지하기 위해 아직 교미하기 이전의 L4단계의 자웅동체와 젊은 수컷 성체를 배지에 옮겨서 교배를 합니다. 보통 자웅동체보다 많은 수의 수컷을 넣어주며 (1:3 이상의 비율로), 이 때 알이나 유충이 함께 옮겨오지 않도록 주의해야 합니다.
 

[예쁜꼬마선충 생애주기]

배아(Embryo) -> L 1, 2, 3, 4 -> 성체(Adult)

배아 발생은 20℃에서 약 16시간이 소요되며, 자웅동체 배아는 부화하여 L1이 됩니다. L1 이후 L2, L3, L4가 되기까지 각각의 단계는 새로운 큐티클이 만들어지는 수면과 같은 비활성기간으로 끝나고, 비활성기간은 오래된 큐티클을 제거하며 끝나게 됩니다. 각각의 단계에서 다음 단계까지는 약 12시간이 소요됩니다. L4에서 12시간 후 성체로 자라나며, 자웅동체(hermaphrodites)의 경우 자체 생산한 정자를 모두 활용할 때까지 2~3일 동안 번식을 합니다. 정자가 고갈된 자웅동체는 수컷과 짝짓기를 할 경우 추가로 자손을 생성할 수 있습니다. 생식 기간이 지나고 자웅동체는 노화로 죽기 전에 몇 주 더 생존할 수 있습니다. 다우어(Dauer)는 먹이가 부족할 경우 입을 막아 먹이를 먹는 것을 방해하는 큐티클을 분비하며, 화학물질 내성을 강화시켜 환경적 스트레스로부터 보호합니다. 먹이가 생기면 큐티클을 벗은 후 L4 단계로 성장합니다. 숙련된 연구자의 경우 광학현미경을 이용하여 육안으로도 생애주기를 구별하는 것이 가능합니다. 각각의 실험 목적에 따라 적용 가능한 단계가 다르기 때문에 선행연구를 참고하여 준비하는 것을 권장합니다. 먹이가 풍부한 곳으로 예쁜꼬마선충을 옮긴 후 성체 단계에서 알을 품은 상태가 되기까지 2일이 소요됩니다. 알들을 모은 이후 선충을 다시 원하는 성장 단계로 맞추는데 2-3일 정도 소요되니 실험 날과 맞춰 준비하시면 됩니다.

예쁜꼬마선충은 외형적으로 인간과 상당히 다른 형태를 지니고 있지만 자세히 알아보면 반대로 인간과 유사한 점을 많이 지니고 있습니다. 

1. 유전자: 예쁜꼬마선충의 전체 유전자 염기서열은 이미 전부 밝혀져 있는 상태이고 인간의 유전자 수와 비슷한 약 19,000개의 유전자(gene)가 존재하며 인간 유전자의 약 60~80%가, 그리고 인간 질병과 관련된 유전자의 약 40%가 예쁜꼬마선충의 유전자에도 존재합니다.

2. 기관: 예쁜꼬마선충은 입, 인두, 신경계, 감각기관, 생식기관, 내장과 같은 인간에게도 존재하는 기관을 가지고 있습니다. 

3. 질병 연구: 예쁜꼬마선충은 인간과 유사한 유전자 및 기관을 가지고 있는 것을 기반으로 실제로 인간에게 적용할 수 있는 여러 가지 질병 연구에 사용됩니다. 예를 들면, 인간을 대상으로 실험을 할 수는 없지만 예쁜꼬마선충의 유전자를 변형하거나 파괴하여 그에 따른 개체의 변화를 보는 것은 가능하기에 예쁜꼬마선충은 인간 대체 실험 모델로 유용하게 사용됩니다. 현재 아래와 같은 많은 분야의 연구들이 진행되고 있습니다.

  - 에너지 대사 증후군 연구: 당뇨병, 비만 등

  - 암 연구: 폐암, 위암, 췌장암 등

  - 신경 변성 및 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative disease)연구: 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등

  - 유전병 연구: 근위축증 등

  - 노화연구

예쁜꼬마선충은 진핵 생물 생물학의 실험대상으로써 많은 고유한 이점을 가지고 있습니다.

1. 경제성 : 작은 크기(성체 몸길이 약 1mm), 용이한 배양조건(E. coli가 들어있는 한천 판에서 자라며 12~25℃ 범위의 온도에서 성장 가능), 장기 동결 보존이 가능함에 따라 유지 보수가 간단하고 이에 관한 비용이 낮습니다. 

2. 투명성 : 예쁜꼬마선충은 투명성이 있어 형광 단백질 리포터를 활용한 연구를 가능하게 합니다. 타겟 유전자에 형광유전자를 주입함으로써 타겟 유전자의 발현이 잘 되는지(형광이 강하게 발현됨) 아닌지의 여부를 쉽게 식별할 수 있습니다.

3. 빠른 생장 시간 : 예쁜꼬마선충이 성체가 되는 데 걸리는 시간은 약 3일입니다. 따라서 실험을 시작하기까지의 준비시간이 다른 실험체에 비해 적다는 장점이 있습니다. 

예쁜꼬마선충도 다른 모델생물에서 흔히 쓰는 qPCR과 같은 방법을 통해 유전자 발현 정도를 측정할 수 있습니다. 그러나 이보다 더 많이 쓰는 방법은 보고자 하는 유전자의 프로모터로 형광단백질을 발현하는 형질전환종을 제작하여 형광의 정도를 측정하여 유전자 발현을 보는 것입니다. 이 방법의 장점은 살아있는 선충에서 발현 양의 변화를 손쉽게 볼 수 있다는 것과 몸 속에 어느 특정 기관이나 세포에서 그 변화가 일어나는지도 볼 수 있는 것입니다. 심지어 해당 유전자에 형광단백질을 붙여 fusion protein을 발현하는 형질전환종을 만들면 살아있는 선충에서 단백질의 위치까지 파악할 수 있습니다.  워낙 형질전환종 제작이 용이하고 선충의 몸이 투명하기 때문에 가능한 방법들이기도 하고, 선충 크기가 워낙 작아 각각의 조직을 해부하기 어려운 단점을 보완하는 방법이기도 합니다. 

형질전환종은 직접 제작할 수도 있지만 많이 연구된 유전자의 경우 이미 제작된 것들도 있기 때문에 CGC에서 구입하거나 제작자에게 직접 연락하여 받을 수 있습니다. 이 외에 RNAseq(Next-Generation Sequencing)라던지 single cell RNAseq도 시도되고 있습니다.

선충도 강한 빛이나 진동을 감지할 수 있다는 보고는 있지만 우리가 생각하는 시각이나 청각이라고 하기는 어렵습니다. 따라서 선충은 주로 후각과 미각, 촉각 등을 사용하여 주변을 감지합니다. 이들 감각 작용에 대한 연구는 오랫동안 이루어져, 감각에 사용되는 수용체와 하위신호들이 꽤 연구가 된 편입니다. 먹이의 경우, 후각, 미각, 촉각 모두를 사용하여 감지할 수 있고 박테리아 주변의 공기중 이산화탄소나 산소 농도 또한 감지할 수 있어서 이러한 여러 정보를 종합하여 먹이를 찾게 됩니다. 

자연환경에서 선충이 맞닥뜨릴 수 있는 위험의 경우, 생존에 불리한 환경, 포식자, 해로운 병원성 박테리아 등의 경우를 들 수 있습니다. 먹이가 감소해서 굶게 되거나 주변 개체수가 많아지면 선충은 먹이 없이 몇 달 간 생존할 수 있는 ‘다우어’라는 발달 형태로 전환하게 됩니다. 이를 위해서는 체내 영양 상태를 판단할 수 있어야 하고 개체 수 증가의 경우 다른 선충에게서 발생하는 페로몬을 후각/미각을 통해 감지할 수 있어야 합니다. 포식자나 병원성 박테리아의 경우, 특정 냄새를 선천적으로 피한다는지 등의 선충의 방어기작이 있지만 이들을 냄새만으로 구분할 수 없는 경우도 많습니다. 오히려 때로는 박테리아나 곰팡이균이 선충이 좋아하는 냄새를 내뿜어 선충을 유인하기도 합니다. 이 경우에는 기억에 의존하여 다음 번에는 같은 위험을 피하도록 하는 방어 방법이 있습니다. 해로웠던 박테리아 등의 관한 감각적 자극을 해당 위험과 연관지어서 형성되는 연관 기억은 경험의 길이와 빈도에 따라 더 강하게 형성되고 오래 지속된다는 것이 여러 연구를 통해 보여진 바 있습니다.