제브라피쉬 연구를 시작하기 위해서는 우선 필수 기자재를 갖춰야 합니다. 장비의 규모와 종류에 따라 가격은 천차만별입니다만 초반에는 상당한 비용이 소비됩니다.
[제브라피쉬 사육시설]
제브라피쉬는 열대성 어류이기 때문에 28.5°C로 온도를 맞춰줄 수 있는 사육시설이 꼭 필요합니다. 또한 일정수준의 산소포화도가 유지되어야 하기때문에 물을 지속적으로 순환시켜줘야 합니다. 물의 pH도 중요합니다. 이 모든 것을 갖춘 사육시설을 반드시 가지고 있어야 합니다. 현재 다양한 국내외 회사에서 꼭 필요한 모든 시스템을 갖춘 아파트형 사육시설을 판매하고 있습니다.
그림 1. 국산 제브라피쉬 사육시설 (회사명: S&F)
[제브라피쉬 급여장치]
제브라피쉬 급여장치는 치어용 로티퍼 배양장치와 성어용 brine shrimp(artemia) 배양장치로 나눌 수 있습니다. 치어와 성어 모두 건조 먹이를 통해 급여할 수도 있지만 생존율과 영양상태를 고려한다면 하루에 최소 1 ~ 2회는 로티퍼 또는 brine shrimp를 급여하는 것이 좋습니다.
[로티퍼 생육 프로토콜]
1. Rotifer는 1% 천일염 / 28~29℃ 조건에서 생육한다. 치어는 salt shock를 방지하기 위해 0.1% 해수염(sea salt)에서 생육한다.
2. 이때 온도는 항온기를 이용한 중탕방식으로 정확하게 맞춰준다.
3. 공기펌프를 이용하여 약한 강도로 에어레이션(aeration)을 해준다(산소공급).
(강한 에어레이션은 오히려 rotifer에게 좋지 않다.)
4. Rotifer는 클로렐라를 먹이로 하며 급여는 스포이트 또는 혈청분리관을 이용하여 일정량 분주한다.
(너무 많은 잉여 클로렐라는 해로운 생육 환경을 조성하므로 배양액이 연두색 정도가 될 정도만 주는 것이 좋다.)
5. 대사산물과 잉여 클로렐라는 바닥에 가라앉게 되어 생육에 안좋은 영향을 미치므로 제거한다.
6. 수득은 수요에 따라 다르지만 일반적으로 전체 배양액의 10%~30% 정도를 알맞은 거름망을 통해 분리하는 방식으로 진행한다.
(이때 바닥에 대사산물을 함께 제거하는 것이 좋다.)
7. 사용한 배양액만큼 신선한한 배양액을 다시 넣어주어 생육한다.
8. 대사산물을 제거하는데 한계가 있으므로 2주에 한번은 새로운 배양 용기에 접종하는 것이 좋다.
생육환경이 좋으면 rotifer는 알을 2개~5개 가지고 다니지만, 환경이 좋지 않을 경우 알을 가지고 다니지 않는 개체가 많아진다.
그림 2. Rotifer: 아래 동그란 것은 로티퍼 알입니다. (그림출처: https://www.intrafish.com/aquaculture/zooplankton-week-part-debunking-the-myths-about-rotifers/1-1-1221092)
그림 3. 로티퍼 생육장치 (사진출처: 노현주)
[Brine Shrimp 생육 프로토콜]
Brine shrim는 적절한 온도, 소금 농도 그리고 강한 에어레이션이 주어지면 부화하게 됩니다 (18시간 정도 소요). 이 부화된 개체를 급여합니다.
1. 20L Hatchery에 정수된 물 18L를 채운다.
2. Hatchery에 에어펌프와 히터를 연결한다. (온도 28℃ 유지)
3. 물 1L당 일반 굵은 소금(천일염) 20~25g을 넣은 후 소금을 녹인다.
4. 소금을 다 녹인 후 brine shrimp를 물 1L당 2~2.5g을 넣는다.
5. Brine shrimp를 넣은 후 백열등을 켜준다.
6. 정상적으로 18시간 내에 부화가 시작되며, 24∼30시간이 되면 거의 (80%~90%) 부화한다.
7. 24시간이 지나서 부화가 완성되었다고 판단될 때, 에어펌프와 히터를 분리한 후 백열등을 끈다.
8. 부화된 후 공기공급을 멈추면 부화된 유생은 밑으로 가라앉고 껍질은 수면에 뜨게 된다.
9. 가라앉은 유생을 껍질과 섞이지 않게 빼내어 소금물을 제거시킨 후 스포이드로 적당량을 급여 한다.
10. 2~3일 정도 냉장고에 유지 보관이 가능하다.
(더욱 자세한 내용은 지노믹디지인 홈페이지 참고: http://zebrafish.co.kr/)
그림 4. Brine Shrimp (그림출처: Brinannica. https://www.britannica.com/animal/brine-shrimp)
그림 5. 대형 배양장치 (사진: 노현주)
[배양기]
배아 배양을 위해서는 28.5°C 를 유지할 수 있는 배양기(인큐베이터)가 필요합니다. 더운 여름에는 일반 인큐베이터를 사용하면 온도 조절이 어려울 수 있기때문에 저온 인큐베이터를 구매하여 사용하는 것이 좋습니다. 또한 광주기(약 14시간)와 암주기(약 10시간)을 지켜주는 것이 좋기 때문에 배양기 내부에 타이머를 설치하여 빛(형광등, LED)을 공급해 주는 것을 추천합니다. 백열전구처럼 강한 열을 낼 수 있는 광원은 피하기 바랍니다.
그림 6. 저온 인큐베이터 (사진출처: 노현주)
[물고기 교배장치]
제브라피쉬는 교배장치에 전날 저녁시간에 넣어둡니다. 암수는 동수로 넣어주고 중간에 칸막이를 설치하여 상호 접촉을 막아 놓습니다. 다음날 불이 켜지면 칸막이를 제거하여 자연교배를 유도합니다. 제브라피쉬 egg는 아래로 가라앉게 되고 이 egg를 수거하여 실험에 이용합니다.
그림 7. 물고기 교배장치 (출처: Techniplast. https://www.tecniplast.it/uk/product/07l-tank.html)
[미세조작도구]
제브라피쉬 배아 미세조작을 위해서는 우선 micropipette puller를 이용하여 매우 가느다란 주사바늘을 직접 만들어야 합니다. (주로 WPI제품 미세유리관을 사용)
그림 8. Micropipeete Puller 와 유리관
Egg의 미세조작을 위해서는 1. Micromanipulator, 2. Injector, 3. 해부현미경이 필요합니다.
그림 9. 미세조작도구
