A-GAL4; B-RNAi line에서 A-GAL4 line을 만들려고 합니다.

A-GAL4 (2^nd)와 B-RNAi (3^rd)를 합쳐서 A-GAL4; B-RNAi line을 만들려고 합니다.

Am(2^nd)와 Bm(2^nd)를 이용해 Am, Bm double mutant line을 만들려고 합니다. 이 때, 두 돌연변이가 같은 염색체에 있기 때문에 recombination(재조합)을 시켜야 하며 이러한 과정을 통해 만들어진 line을 recombinant(재조합) line이라고도 부릅니다. 

참고로 A와 B를 double mutant line 대신 각각 GAL4, RNAi 형질전환체로 치환하면 GAL4, RNAi recombinant line을 만드는데 위의 방식을 활용할 수 있습니다.

만약에 GAL4와 RNAi를 교배할 때 phenotype(표현형)을 알고 있으면 genotyping(유전형 분석)을 거치지 않고 손쉽게 recombinant line을 확립을 할 수 있습니다. 이후에 immunohistochemistry staining 등의 기법을 통해 RNAi의 효과를 검증하는 것으로 line이 잘 만들어졌는지 확인합니다.

초파리를 새로운 배양배지로 옮겼을 때 알을 낳지 않으면 일단 male이나 virgin female이 들어있는지 확인해 봅니다. 새로운 배양배지에서 초파리를 교배시킬 때, virgin female과 male의 비율이 3:1정도로 하는 것이 이상적이므로 이 비율에서 많이 벗어났는지 확인합니다. 일반적으로 male의 경우 3일 이상 성숙하면 교미를 하게 됩니다. 하지만 너무 성숙한 초파리는 교미 능력이 감소하게 되므로 너무 나이가 든 개체는 쓰지 않는 것이 중요합니다. 

초파리를 배양하는 온도가 너무 높거나 낮으면 viability(생명력)나 fecundity(알 낳는 능력)이 감소합니다. 초파리를 사육할 때 18-30℃ 사이에서 키우는 것이 적절합니다. 배지 상태도 중요하므로 배가 상태가 안 좋다면 신선한 배지로 옮겨서 경과를 지켜봐야 합니다.

성즐(Sex-Comb)은 초파리 수컷에서 2차 성징으로 인해 첫번째 다리(1st tarsal segment of prothoracic pair of legs)에서 나타나는 굵직한 털(modified mechanosensory bristles)을 의미합니다 (그림 1). 

번데기 시기의 사진에서 성즐이 수컷의 다리에서만 존재함을 확인할 수 있습니다. 다만 이러한 방식으로 구분을 할 때는 late pupa에서 구분을 하는게 안전합니다 (그림 2). 

초파리 라인 제작 과정에서 다음 세대 교배에 사용될 virgin female을 고르기 여의치 않은 경우 성즐을 활용하여 수컷과 암컷을 구별할 수 있으며, 이 과정에서 virgin female을 비교적 쉽게 얻을 수 있습니다. 

그림 1: 성체 초파리의 성즐(Sex-Comb)¹ (B: 암컷, E: 수컷)

그림 2: 번데기 상태의 초파리의 성즐(Sex-Comb)¹

예쁜꼬마선충의 성체줄기세포는 선충의 생식계열에 존재합니다. 예쁜꼬마선충의 생식줄기세포(Germline Stem Cell, GSC)는 줄기세포의 미세환경(Stem Cell Niche)이 줄기세포의 유지와 분화에 어떻게 영향을 주는지, 그리고 생식계열의 발달 과정에서 체세포 분화가 어떻게 억제되는지 이해하는데 중요한 모델로서 작용합니다.

예쁜꼬마선충의 생식줄기세포 미세환경은 Distal Tip Cell(DTC)라는 중엽세포로 구성되어 있으며 자웅동체 선충은 2개의 DTC가 생식선(Gonad)에 존재합니다. DTC의 Delta Serrate LAG-2(DSL) 리간드인 LAG-2는 생식줄기세포의 Notch 수용체인 GLP-1을 cleavage합니다. 이후, GLP-1/Notch 수용체의 세포내 영역(Notch Intracellular Domain, NICD)이 LAG-1과 전사보조인자 LAG-3/SEL-8과 함께 전사를 촉진시킵니다. GLP-1/Notch 수용체의 제거는 DTC의 제거와 같은 작용을 하며 모든 생식줄기세포가 감수분열주기(Meiotic Cell Cycle)로 들어가 분화하는 결과를 보였습니다. glp-1 기능획득 돌연변이의 경우에서는 생식줄기세포의 감수분열이 일어나지 않았으며 생식세포가 tumorous한 특성을 보였고 체세포분열 중인 세포로 채워진 것을 확인할 수 있었습니다.

선충에서 DTC 미세환경이 GLP-1/Notch 신호전달을 통해 생식줄기세포를 유지한다는 이러한 연구결과를 토대로 많은 연구가 이루어졌으며, niche cell에서 발현되는 신호가 줄기세포의 유지에 영향을 주는 기전은 다른 포유류에서도 매우 잘 보존되어 있음이 밝혀졌습니다.
 

* 그림출처: Joshi PM et al. Dev Dyn. 2010;239(5):1539-1554.

* 그림출처: Kimble J et al. StemBook.

예쁜꼬마선충에서의 신경생리학적 실험에는 형광이미징, 체외(In Vitro) 실험방법과 전기생리학적 실험 등이 있습니다.

형광 이미징은 칼슘 다이나믹이 신경전달물질 분비에 직접적 영향을 미친다는 점을 이용한 현미경 이미징 테크닉으로 선충의 신경에 칼슘 센서 단백질(Cameloen, GCaMP)을 발현시켜 선충의 칼슘 유입을 형광을 통해 관찰함으로써 칼슘 다이나믹이 신경전달 물질의 분비에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하는 방법입니다.

체외실험법은 생체 외 환경에서 선충의 배아세포를 뉴런 및 근육 세포로 분화시켜 신경의 형태적, 전기생리적 변화를 확인하는 방법입니다. 

전기생리학적 실험방법은 예쁜꼬마선충을 해부하여 신경조직 또는 근육의 전기생리적 변화를 확인하는 방법입니다. 주로 센서신경은 신경조직을, 운동 신경의 경우는 근육의 전기적 변화를 관찰하여 신경 전달 물질의 분비 여부를 확인 합니다. 현미경 상에서 신경 조직의 형광 마커를 이용하여 신경조직 또는 근육을 찾은 후 패치 클램프(patch-clamp)와 전극을 이용하여 신경 조직의 전기적 변화를 확인할 수 있습니다.
 

예쁜꼬마선충에서 특정된 노화관련 마커들에는 미토콘드리아 활성도, 열충격 단백질(HSP), 활성산소(ROS)나 인슐린 유사 성장인자 경로(IGF Pathway) 등의 유전자들이 있습니다.

선충에서 ROS level을 감소시켜 수명을 증가시키고 기타 생리현상에 영향을 준다고 알려진 clk-1의 경우, 마우스 실험에서도 ROS level을 감소시키고 수명을 증가시킨다는 것이 밝혀졌습니다. 또한 IGF pathway 역시 마우스에서 수명에 영향을 준다는 것이 밝혀졌습니다.

ROS의 경우 사람에서도 중요하게 작용하는 노화 스트레스 마커로서 연구되고 있습니다. 이처럼 선충에서의 노화관련 유전자나 신경전달 경로들이 고등동물에서도 유사한 작용을 한다는 것이 연구되어지고 있고, 예쁜꼬마선충의 노화지표가 되는 스트레스 마커들 역시 인간을 비롯한 고등동물에서 적용이 된다는 것을 알 수 있습니다.

* 테이블 출처: Son HG et al. Aging Cell. 2019;18(2):e12853.

* 그림출처: Pandey KB, Rizvi SI. Oxid Med Cell Longev. 2010;3(1):2-12.

예쁜꼬마선충은 적응면역(Adaptive Immune System)은 갖고 있지 않으며 바이러스 방어를 위한 RNA 간섭작용과 박테리아 병원균 방어를 위한 선천면역(Innate Immune System) 시스템이 있습니다.

선충에서 바이러스 RNA는 RDE-1/4 dsRNA 결합 복합체에 의해 인식되어, 이후 RNA 헬리케이스인 DRH-1이 RNA 분자를 분해하고 DCR-1으로 전달합니다. Dicer 유사체인 DCR-1에 의해 생성된 소규모 바이러스 RNA는 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 증폭되어 대량의 안티센스 바이러스(siRNA)을 생성하며, 이 siRNA은 Argonaut 단백질과 RNase MUT-7의 작용으로 대상 바이러스에 대한 면역작용(RNA간섭작용, RNAi)을 합니다.

선충의 선천면역의 경우, p38 MAP kinase 관련 신호전달이 항균 작용에 중요한 역할을 합니다. 이 경로는 NSY-1, SEK-1, PMK-1(p38 MAPK)로 구성되며  PMK-1은 전사인자인 ATF-7과 함께 C-형 렉틴, CUB 도메인과 항균펩타이드 등의 면역물질들을 발현시킵니다.
 

* 그림출처: Ermolaeva MA et al. Semin Immunol. 2014;26(4):303-309.

첫째, 예쁜꼬마선충 신경세포의 퇴행은 형광 단백질을 이용해 신경세포에 표지하여 신경세포의 손상 정도, 구조적/양적 변화를 관찰하여 신경퇴행의 정도를 평가할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충에서 보이는 신경 퇴행은 신경세포의 세포체가 결손되거나 신경돌기(축삭과 수상돌기)가 가늘어지며 물집처럼 구형을 이루는 양상을 나타냅니다. 신경퇴행이 더 악화되면 신경세포 간의 신경돌기가 끊어져 있는 모습을 관찰할 수 있습니다^{1, 2}. 

* 그림출처: Huang X et al. Nat Commun. 2023;14(1):6137.

둘째, 신경퇴행과 연관된 유전체 및 단백체 분석을 통하여 신경퇴행에 따른 분자적인 변화를 평가함으로써 신경퇴행을 감지합니다³. 

* 그림출처: Koopman M et al. MicroPubl Biol. 2023;2023:10.17912/micropub.biology.000766.

셋째, 신경세포의 퇴행은 예쁜꼬마선충의 인지능력, 움직임 그리고 운동능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 신경퇴행에 따른 예쁜꼬마선충은 먹이가 있음에도 이를 인지하지 못하고 계속 먹이를 찾기 위해 배지를 이동하거나 좋아하는 냄새와 싫어하는 냄새를 구별하지 못하는 등의 행동변화를 보입니다. 또한 예쁜꼬마선충의 운동 신경세포의 퇴행은 액체 배지 안에서 수영 능력의 감소와 고체 배지 위에서 이동하는 속도의 저하, 불규칙한 이동방향 등의 행동 표현형으로도 나타납니다 ^4-6. 
 

예쁜꼬마선충을 이용한 신경퇴행성 질환모델은 다른 모델 시스템에 비해 많은 장점이 있습니다. 척추동물의 신경계와 뇌는 매우 복잡하고 다른 조직으로 둘러싸여 있기 때문에 신경퇴행성 질환을 이해하는 연구는 해부학적으로 많은 제약이 있습니다. 예쁜꼬마선충은 302개의 신경세포로 이루어진 단순한 신경계를 가지고 있으며 이에 대한 연구가 잘 이루어져 있기 때문에 신경퇴행성 질환 환자에서 관찰되는 유전자 및 단백질의 도입 이후 신경계의 변화를 쉽게 분석할 수 있습니다¹.
 

* 그림출처:  Cook SJ et al. Nature. 2019;571(7763):63-71.

둘째, 예쁜꼬마선충은 유전학 연구에 많은 장점을 갖는 모델생물입니다. 예쁜꼬마선충에 신경퇴행성 질환 관련 유전자 또는 단백질의 형질전환 그리고 CRISPR/Cas9, RNAi 등의 적용을 통한 신경퇴행성 질환의 분자적 경로를 탐구하기에 적합합니다^2-5. 다른 모델생물과 비교하여 예쁜꼬마선충은 생애주기가 매우 빨라 신경퇴행성 질환 연관 유전자 스크리닝에 용이하고 자웅동체이기 때문에 돌연변이의 동형접합성이 자가수정을 통하여 쉽게 유지될 수 있습니다⁶.

* 그림출처: (왼) Hayden AN et al. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2022;267:111166., (오) Li J, Le W. Exp Neurol. 2013;250:94-103.

셋째, 예쁜꼬마선충은 몸이 투명하기 때문에 신경세포를 형광 단백질로 표지하여 시각화가 가능합니다. 이러한 이점을 활용하여 점진적인 신경세포의 퇴행을 연구자가 쉽게 관찰할 수 있습니다. 또한, 예쁜꼬마선충은 광유전학적 기술을 활용할 수 있는 모델로 활용이 가능합니다. 예쁜꼬마선충은 광센서 유전자와 광반응성 이온 채널을 활용한 신경세포의 활성을 조절할 수 있으며 세포 내 광반응성 단백질을 통하여 원하는 단백질을 물리적으로 제어할 수 있습니다^{7, 8}. 유기체인 예쁜꼬마선충에서 광유전학적 기술의 적용은 유전자, 단백질 그리고 세포의 변화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 이에 의해 나타나는 생물학적 표현형 분석도 가능한 유용한 모델로 활용될 수 있습니다.

* 그림출처: Koopman M et al. BMC Biol. 2021;19(1):170.