C. elegans에는 자웅동체와 수컷, 2가지 성이 존재합니다. 교배를 할 때는 자웅동체와 수컷을 각각 사용해야 합니다. 먼저 bacteria가 seeding 되지 않은 NGM(Nematode Growth Media) plate의 중앙에 OP50 박테리아를 약간 올려놓습니다. 이는 C. elegans가 섭취하는 먹이로 박테리아를 중앙에만 배치함으로써 자웅동체와 수컷이 더 자주 만나 교배 효율을 높일 수 있습니다. 이후, 교배를 위해 자웅동체 L4 stage 또는 prefertile adult stage 자웅동체 한 마리와 수컷 여섯 마리를 같은 plate에 올려놓습니다. 자웅동체의 stage가 중요한 이유는 자웅동체가 자신의 sperm을 사용하기 전에 수컷의 sperm을 우선적으로 사용하도록 하기 위해서입니다. Mating이 제대로 이루어지지 않을 상황에 대비해 최소 3개의 plate를 준비하는 것이 좋습니다.

다음 날, 자웅동체와 수컷을 새로운 plate로 옮기고 만약 수컷이 사라졌다면 추가로 수컷을 넣어줍니다. 그 다음 날도 동일하게 자웅동체와 수컷을 새 plate로 옮긴 후, 3일째 되는 날에는 남아 있는 자웅동체와 수컷을 모두 제거하고 자웅동체가 낳은 알만 남깁니다. 이렇게 하면 교배 1, 2, 3일차에 자웅동체가 낳은 알만 남은 plate가 남습니다. 1일차에는 교배가 잘 이루어지지 않았을 수 있어 되도록 사용하지 않고, 2일차 plate에서 수컷과 자웅동체가 섞여서 태어난다면 교배가 성공적으로 이루어진 것입니다. 이 plate에서 필요한 수컷이나 자웅동체를 골라서 사용하면 됩니다.

수컷을 얻는 기본적인 방법은 WT(Wild Type) 수컷과 교배하여 수컷 자손을 얻는 것입니다. 하지만 연구실에 수컷이 전혀 없어서 교배가 불가능하다면 heat shock을 이용해 낮은 확률로 수컷을 얻을 수 있습니다. 이를 위해 bacteria가 seeding된 NGM plate 5개를 준비하고, 각 plate에 L4 stage의 자웅동체를 4-5마리씩 올려놓습니다. 이 plate들을 31℃에서 5-6시간 동안 incubation한 후 다시 20℃로 옮기면 됩니다. 이렇게 하면 태어나는 F1 자손 중 약 2-5%가 수컷으로 태어나므로 이 수컷을 골라내어 사용합니다.

일반적으로 동물모델에서 실험 후 장기를 적출하여 다양한 실험을 진행해야할 때 혈액이 문제될 수 있습니다. 특히 혈액에는 알부민 등의 단백질이 많기 때문에 조직 내에 잔존혈액이 많을 경우, 자칫 원치않은 실험적인 오류가 발생할 수 있습니다.

따라서 조직을 적출할 때 장기에서 최대한 혈액을 제거하기 위하여 perfusion(관류)을 진행하게 됩니다. 간의 경우, 간으로 들어오는 portal vein(간문맥)이 가장 크기 때문에 perfusion을 진행할 수 있습니다. 그 외의 조직의 경우에는 대정맥 혹은 좌심실을 이용하여 관류를 진행할 수 있습니다.

일반적으로 조직에서 혈액을 제거하기 위해서는 동물모델을 마취한 후, PBS를 주입하면 충분한 관류가 진행될 수 있고, 만일 RNA를 추출하려 한다면 Rnase를 넣은 PBS를 투여할 수 있습니다. 또한 심장을 이용하여 perfusion을 진행한다면 횡경막을 자른 후 가슴을 열어야 하는데, 이럴 경우 마우스의 호흡이 빠르게 멈추기 때문에 모든 process를 매우 빠르게 진행해야 합니다.

간 조직에서 primary hepatocyte을 얻기 위해서는 살아있는 마우스를 마취한 후, 조직의 extracellular matrix 및 각 조직의 세포를 연결하는 콜라겐을 제거해야 합니다. 일반적으로 마우스를 마취시킨 후 배를 절개하여 간으로 들어오는 portal vein을 확인한 후, 정맥에 collagenase solution을 주입함으로써 간 조직에서 세포를 분리할 수 있도록 합니다. 이 때 collagenase solution이 효소반응을 잘 하여 간 조직에 존재하는 collagen을 분해할 수 있도록 온도를 37℃에 맞추는 것이 매우 중요합니다. 따라서 solution 온도를 맞춰줄 수 있는 pump를 이용하여 collagenase solution을 마우스의 portal vein에 주입합니다.

Primary cell culture는 매우 정교한 프로토콜을 요구하기에 참고문헌을 잘 확인하시기 바랍니다.

골수세포 이식술(Bone Marrow Transplantation)은 마우스 면역 연구에서 주로 활용되는 연구방법으로 면역세포의 변화를 관찰할 수 있는 실험 기법 중 하나이다. 

Recipient 마우스에 UV irradiation을 통해 기존 골수세포 및 면역세포를 제거시킨 후 donor 마우스의 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cell; HSC)을 주입하면 donor의 HSC가 recipient의 골수에 자리잡아 면역세포나 혈구세포들의 donor 마우스 유래 세포로 완전히 바뀔 수 있는 방법이다. 

UV irradiation의 Gy 세기에 따라 recipient의 면역세포 사멸 정도가 다른데 예를들면 11 Gy 미만에서는 조직상주 대식세포에 대한 사멸이 나타나질 않는다. 이러한 방법들을 통해 특정 유전자변형 면역세포들이 recipient에 주입될 시 면역세포의 localization이나 maturation, chemotaxis의 경향이 다른지 관찰할 수 있는 유용한 실험 기법 중 하나이다.

간섬유화는 간 내에 콜라젠이 다량으로 축적되는 질환으로 크게 화학 독성 물질 혹은 식이요법 매개 유도방법으로 2가지로 나눌 수 있다. 

1. Chemical 모델 
사염화탄소(Carbon Tetrachloride; CCl4) 및 Thioacetamide(TAA)가 있으며 Intraperitoneal Injection을 통해 6~8주간 간경화 질환이 유도될 수 있다. 일반적으로, TAA보다는 CCl4가 더 많이 활용되고 있는 모델이다.

2. 식이요법 모델
아미노산 결핍 식이요법이 있는데 Methionine과 Choline Deficient(MCD) 식이요법을 6주간 시행하면 간 내 지방간과 콜라젠이 축적된다. 이외에도 MCD diet의 다른 부작용들을 보완하기 위해 Choline-Deficient High Fat Diet (CD-HFD), Choline-Deficient L-Amino Acid Defined High Fat Diet(CDAA-HFD) 등을 활용하고 있으며 최근에는 CDAA-HFD의 10주 식이요법으로 유도한 간섬유화 모델이 많이 활용되고 있다.
이외에도 cholestasis를 통해 간섬유화를 유발시키는 Bile Duct Ligation(BDL)이나 3,5-Diethoxycarbonyl-1,4-Dihydrocollidine(DDC) diet가 있으나 담관 염증 소견에 국한되므로 담관 질환 모델로만 인식되고 있다.

마우스 배아의 착상 전 배아 발달 단계는 다음과 같습니다.

1. Zygote: 난자와 정자가 수정된 직후의 단계로 각 정자와 난자 유래 전핵을 확인할 수 있는 단계로 주로 형질전환 마우스 모델 제작에 사용되는 배아 단계
2. 2-Cell Stage: 수정 후 1일 정도가 지나면 첫 번째 세포 분열이 일어나며 2세포기로 전환, 해당 단계도 세포질 미세주입 방법으로 형질전환 마우스 모델 제작에 사용 가능한 배아 단계
3) 4-Cell Stage: 추가적인 세포 분열을 거쳐 4세포기로 전환
4) 8-Cell Stage: 수정 후 약 2-3일이 지나면 8세포기에 도달
5) Morula Stage: 수정 후 약 3-4일 경으로 16세포 이상의 덩어리를 형성하는 시기
6) Blastocyst Stage: 착상 직전의 마지막 단계로 수정 후 4-5일이 지나면 발생하며 이 시점에 내부세포괴(Inner Cell Mass; ICM)와 외부세포층(Trophectoderm; TE)이 형성되는 단계로 이 단계에서 자궁 내에 착상이 시작

* 그림출처: Michel Cohen-Tannoudji. Early Mouse Development. http://stemcells.free.fr/?page_id=237

형질전환 마우스 모델 제작에서 일반적으로 사용되는 배아 단계는 zygote 또는 2-cell 단계입니다. 이 단계에서 미세주입(Microinjection) 또는 전기천공법(Electroporation) 방법으로 유전자 조작이 가능합니다.

마우스의 Estrous Cycle을 확인하는 방법은 주로 질 세포를 관찰하는 방식(Vaginal Cytology)으로 이루어집니다. 마우스의 Estrous Cycle은 4-5일 주기로 발생하며 Proestrus, Estrus, Metestrus, Diestrus의 4가지 주요 단계를 포함합니다. 각 단계에서의 질 세포 변화를 확인하는 방법은 아래와 같습니다.

1) 질 세포 채취: 세포를 채취하기 위해 소량의 식염수(0.9% NaCl)를 질 내에 주입한 후 피펫으로 흡입하여 세포를 수집
2) 세포 염색: 채취한 세포를 슬라이드에 놓고 고정한 후, Giemsa 염색 또는 Diff-Quick 염색 등을 사용해 세포를 염색
3) 현미경 관찰: 현미경으로 세포를 관찰하여 주기를 평가

* 그림출처: Sari GP et al. Sci Rep. 2022;12(1):21985.

각 단계에서 보이는 세포 유형은 다음과 같습니다.

- Proestrus: 대부분의 세포가 핵이 큰 핵세포(Nucleated Epithelial Cell) 존재
- Estrus: 각질화된 비핵 세포(Cornified Epithelial Cell)가 대부분 존재
- Metestrus: 비핵세포와 함께 백혈구(Leukocyte)가 존재
- Diestrus: 백혈구(Leukocyte)가 다수 존재하며 소수의 핵세포가 존재

* 그림출처: Byers SL et al. PLoS One. 2012;7(4):e35538.

DTR(Diphtheria Toxin Receptor)과 DTA(Diphtheria Toxin A Fragment) 마우스 시스템은 특정 세포를 제거(Ablating)하거나 기능을 연구하기 위해 사용됩니다. 이들은 세포의 선택적 제거를 통해 생리적 또는 병리적 현상을 분석하는데 유용합니다.  

[DTR 마우스 시스템 (Diphtheria Toxin Receptor)]

- 기본 원리: 사람의 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 특정 세포에 발현시켜 디프테리아 독소(DT)에 감수성을 부여합니다.
- 마우스 세포는 원래 DT에 저항성을 가지지만 DTR을 발현하도록 조작된 세포는 DT 처리시 선택적으로 죽습니다.

[DTA 마우스 시스템 (Diphtheria Toxin A Fragment)]

- 기본 원리: DTA는 디프테리아 독소의 활성 부위로 단백질 합성을 억제하여 세포 사멸을 유도합니다.
- DTA 발현 유전자를 특정 세포 특이적 promoter와 연결해 표적 세포를 영구적으로 제거합니다.

[DTR / DTA 시스템 비교]

Lineage tracing(계보 추적)은 세포가 어떻게 분화하고 조직을 형성하는지 또는 특정 세포 집단의 후손이 어떻게 변화하고 위치하는지를 추적하기 위해 사용되는 유전학적/화학적 방법입니다. 세포에 표지를 남겨 후속 세포들까지 그 흔적을 볼 수 있게 하며 이를 통해 세포의 운명을 이해할 수 있습니다. 특히 마우스 모델은 이 연구에 많이 사용됩니다. 이를 통해 특정 세포가 조직 내에서 어떤 역할을 하는지 파악할 수 있으며 암, 재생, 발달 연구 등 다양한 분야에 활용됩니다.

[Lineage tracing 마우스 모델의 구성 요소 및 방법]

주로 유전자 조작을 통해 형질주입된 마우스를 사용합니다. 일반적으로 Cre-LoxP 시스템을 사용합니다.

- Cre Recombinase: 특정 DNA 서열(LoxP) 사이의 유전자를 제거하거나 활성화합니다.
- LoxP 서열: Cre가 인식하는 DNA 위치입니다. 두 LoxP 사이에 있는 유전자는 Cre에 의해 제거됩니다.

[작동 방식]

1. 세포 특이적인 프로모터(예: Villin 프로모터)는 Cre 유전자를 조절합니다.
2. 특정 시점에서 Cre가 발현되면 LoxP로 둘러싸인 구간의 유전자가 절단되거나 활성화됩니다.
3. 이로써 세포가 특정 유전자를 발현하거나 형광 단백질(GFP, tdTomato 등)로 표지됩니다.

[동위원소 추적 실험을 위한 영양소 주입방법]

생체 내 동위원소 추적(In Vivo Isotope Tracing)은 다세포 생물체 수준에서 장기별 및/또는 전신 대사를 평가하는 실험 기법입니다.  
성공적인 생체 내 추적 실험을 수행하기 위해서는 사용되는 영양소 추적 물질과 해결하고자 하는 질문에 따라 적절한 전달 방법을 신중하게 고려하는 것이 중요합니다. 

예를 들어, 포도당이 생리적으로 어떻게 사용되는지 이해하는 것을 목표로 한다면 경구 섭취가 가장 이상적입니다. 왜냐하면 포도당은 위장관을 통해 흡수되며 신속하게 대사되기 때문입니다. 반면에 글루타민의 이용을 조사하려면 정맥 주사가 더 이상적일 수 있습니다 (그림).  이는 글루타민이 식단에서 유래하기보다는 주로 말초 조직에서 생산되고 방출되기 때문입니다.