제노프스 난자(oocyte)는 막 단백질의 발현량이 매우 적으며 이에 따라 낮은 기저 수송 활동(background transport activity)을 가지고 있습니다. 따라서 이온 수송 단백질 등과 같은 막단백질의 활성을 측정하기에 굉장히 유리한 조건을 가지고 있습니다. 연구하고자 하는 막 단백질을 제노프스 난자에서 발현시킨 후, 이들의 활성을 측정하는 것을 oocyte uptake assay라고 합니다. 

먼저, 제노프스 난자에 미세주입기법을 이용해 우리가 알고자 하는 막 단백질의 mRNA를 주입하여 단백질을 발현시킵니다. 이때 꼭 제노프스의 막 단백질 뿐만 아니라 식물 등 다른 종의 막 단백질을 발현시켜 활성을 측정하는 것도 가능합니다. 이후 제노프스 난자가 들어있는 배지에 방사성으로 표지되었거나 혹은 형광으로 표지된 물질을 함께 넣어주고  일정 시간이 지난 후, 제노프스 난자 내에 방사성으로 표지된 혹은 형광으로 표지된 물질이 얼마나 들어있는지를 분석함으로써 막 단백질의 활성을 측정할 수 있습니다.

최근에는 방사성 또는 형광 표지된 물질 대신 액체크로마토그래피와 질량분석(LC-MS)을 이용해서도 어떤 물질이 얼마나 흡수되고 이동했는지를 알 수 있습니다.
 

발톱개구리과(family)에 속하는 종들은 9개의 염색체를 기본으로 가지고 있지만, 전체 유전체 복제(whole genome duplication; WGD)를 통해서 다양한 배체수를 가지고 있습니다. 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 4배체 유전체를 가진 종으로 18개 염색체를 가지고 있습니다 (반면 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)는 이 가운데 한 개의 염색체가 나눠져서 총 10개의 염색체를 가지고 있습니다.) 하지만 유전체 복제로 이루어진 18개 염색체는 서로 상동유전체를 가지고 있는데, 이를 크기로 구분하여 상동유전체 가운데 큰 염색체를 L 염색체, 작은 염색체를 S 염색체로 부르고, 이는 염색체 이름에도 반영되어 있습니다 (chr1L, chr1S, chr2L, chr2S, …). 상동유전체가 복제되어 있으니 상동유전자(orthologous gene) 역시 두 개가 존재할 수 있습니다 (유전체 복제 이후 많은 유전자들이 선택적으로 사라져서 모든 유전자가 두 개가 존재하지는 않습니다). 이 경우 L 염색체에 존재하는 유전자와 S 염색체에 존재하는 유전자를 각각 .L 및 .S 를 뒤에 붙여서 표기합니다. 예를 들어 Pax6.L 과 Pax6.S 단백질의 경우 둘 다 Pax6 유전자와 상동 관계에 있는 유전자이며 각각 L/S 염색체에 존재하는 것입니다. 

이러한 정보는 XenBase 데이터베이스에 잘 정의되어 있는데 아래 예시와 같이 pax6 유전자의 경우 2배체인 서양 발톱 개구리(X. tropicalis)에는 4번 염색체에 하나의 유전자가 존재하며, 4배체인 아프리카 발톱 개구리(X. laevis)에는 4L 및 4S 염색체에 각각 유전자가 존재하는 것을 알 수 있습니다. 하지만 이들 복제된 유전자(pax6.S 및 pax6.L)들은 대부분 인간 및 다른 종의 상동유전자와 높은 상동성을 가지고 있어 비슷한 기능을 수행할 것으로 예측하고 있습니다. 제노프스 유전자에 대한 다른 종의 상동유전자는 XenBase 데이터베이스³ 및 Genome Alliance Resource 데이터베이스⁴에서 쉽게 확인할 수 있습니다. 

*그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/entry/gene/showgene.do?method=display&geneId=991974&

제노프스는 배아와 성체 모두 물 속에 살고 있으며, 모체의 영향과 무관하므로 외인성 호르몬이나 기타 화합물을 쉽게 흡수할 수 있습니다. 또한 기관발달, 생리학 및 유전자 발현 측면에서 다른 수생 모델보다 육지 척추동물에 진화적으로 더 가깝기 때문에 독성실험을 하는데 시간 및 비용적으로 효율적인 모델입니다.

Frog embryo teratogenesis assay Xenopus (FETAX) 테스트는 제노프스로 진행하는 발달 독성 스크리닝 테스트 입니다.  소량의 화합물로 짧은 시간(96시간)에 발달 독성을 볼 수 있어 약물 안전성 개발 초기에 실시할 경우 효율적으로 약물의 독성을 확인할 수 있습니다.

*그림출처: FETAX Assay for Evaluation of Developmental Toxicity. Methods Mol Biol. 2017;1641:311-324.

제노프스는 완전 수생생물로 사육 시 깨끗한 수질과 사육환경을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 기존에는 물이 크게 순환하는 flow-through식 사육장이나 폐쇄식(closed) 사육장이 사용되곤 했으나 현재는 모듈식 구조가 다양한 장점으로 인해 많이 쓰이고 있으며 쉽게 구매도 가능합니다. 모듈식 구조는 기존 방식에 비해 비용면에서는 좀 더 비싼 편이나 더 정교한 수질 관리와 공간적으로 효율적이란 이점을 제공합니다. 

*그림출처: Green SL. The Laboratory Xenopus sp. CRC Press; 2018.

제노프스의 사육을 위한 거시적인 환경과 미시적인 환경 유지에 다음과 같은 시설들이 필요합니다. 

- 거시적인 환경: 충분히 통풍이 되며 수온과 평형을 이루는 기온을 위한 공기 순환장치, 방수/미끄럼 방지 처리가 되어있는 바닥, 방수/누전처리가 되어있는 전기시설 등 

- 미시적인 환경: 수돗물 속의 오존/염소/클로라민을 제거하기 위한 필터 시스템, 적절한 염도를 유지하기 위한 염수펌프/삼투 시스템, 일정한 수질을 유지하기 위한 여과/수질 모니터링 시스템, 수온을 유지하기 위한 냉각기, 펌프 등

수질을 유지하는 방법에도 질소분해 박테리아를 이용하는 생물학적 여과법, 화학 여과법, 자외선 살균, 기계적 여과 등 다양한 방법이 있으며 각각의 장단점이 있어서 보통 사육 시설에는 이러한 방법들을 복합적으로 사용하고 있습니다. 

제노프스는 일반적인 펠렛 형태의 물고기 사료와 냉동 장구벌레를 잘 먹습니다. 영양을 고려한 특수 사료 역시 외국의 제노프스 판매 업체를 통해서 구입할 수 있으나 일반적인 물고기 사료와 비교해서 큰 차이는 없습니다. 보통 일주일에 2-3차례 먹이를 주며 이후 물이 많이 오염되지 않도록 관리가 필요합니다.

제노프스의 질병 원인에는 비병원성/세균성/바이러스성 등 여러가지가 있으며 다양한 원인만큼 증상도 다양한 편 입니다. 이상 현상이 발견되면 일단 같은 수조에 있는 개체들에 비슷한 증상이 있는지를 살피고, 증상이 있는 개체를 신속하게 격리해야 합니다. 

제노프스에서 가장 흔한 질병 중 하나는 Red Leg Syndrome이라 불리는 세균성 피부 감염입니다. 이 병에 대한 임상 징후로는 무기력, 사지의 부기 및 점상 출혈 및 반상출혈의 출현이 포함되며 종종 배 쪽으로 퍼지기도 합니다. Red Leg Syndrome의 치료는 초기에는 제노프스를 격리 후 Amphibian Ringer’s solution에 넣거나 약한 염기의 소금물로 소독을 하는 등의 방법으로 할 수 있습니다. 추가로 광범위한 항생제의 경구 투여나 물에 녹여 사용하는 등의 방법으로 치료가 가능하다는 보고도 있습니다. 하지만 Red Leg Syndrome의 원인균에는 다양한 균이 있으니 효과적인 치료를 위해서는 치료에 앞서 병원체의 식별이 선행되어야 합니다.

Chryseobacterium 감염의 경우에는 패혈증과 동일한 증상을 보이며 각막 혼탁, 복수, 피하 부종, 잠수 불능, 무기력, 울혈, 전신 점상 출혈등의 증상을 보입니다. 치사율이 매우 높은 질병이며 방치하면 다른 제노프스에 쉽게 전염되기에 빠른 안락사가 최선의 처리 방법입니다.

제노프스에서도 전세계 양서류에 큰 위협이 되고 있는 항아리곰팡이(Batrachochytrium dendrobatidis)의 감염이 일어날 수 있습니다. 이 감염의 징후로는 표피 증식 및 피부 변색, 비정상적인 탈피, 피부 염증, 무기력 및 탈수가 포함됩니다. 2차 세균성 또는 기타 진균 감염이 존재할 수 있으며 궤양, 점상 및 반상출혈을 유발할 수 있습니다.

25ppm의 포르말린 약욕으로 치료가 가능했다는 보고가 있으나 B. dendrobatidis는 쉽게 전염 가능하기에 치료는 권장되지 않습니다. 감염된 제노프스는 오히려 빠르게 안락사 하는 것이 권장되며 감염된 제노프스를 담은 수조 및 장비는 감염 지속 및 잠재적인 전파를 막기 위해 향진균제로 청소 후 소독하여야 합니다.

제노프스 배아를 수정하는 방법은 크게 두 가지 방법이 있습니다. 자연 수정(natural mating)은 수정 효율을 높이기 위하여 수컷 개구리, 암컷 개구리 모두에 hCG(Human Chorionic Gonadotropin)를 주사하고 하루 정도 지난 이후 한 통에 넣어서 짝짓기를 하는 방식입니다. 이 경우, 일정 시간 간격으로 바닥에 떨어진 배아를 걷어서 실험에 사용하게 됩니다. 한 번 수정을 한 후에는 약 3개월 정도의 휴식기를 거친 뒤 다시 사용할 수 있습니다. 자연 수정 방법의 경우 체외 수정 방법에 비해 수컷 개구리를 희생시키지 않아도 된다는 장점을 가지고 있지만, 반면에 미세주입 기반 실험에 중요한 배아의 발생 단계를 동일하게 할 수 없다는 단점이 있습니다. 
 

체외수정(In Vitro Fertilization) 방법은 암컷 개구리만 hCG를 주사하여 배란을 유도하고 알을 모은 후, 수컷 개구리에게서 수술적 방법으로 채취한 정소를 잘게 부순 뒤 섞어주어 수정시키는 방법입니다. 이 방법은 수컷 개구리를 정소 채취를 위해 희생해야 한다는 단점이 있지만 많은 수의 배아를 동일한 발생 단계로 만들어 실험할 수 있다는 장점이 있습니다. 채취한 정소는 버퍼에 담아 냉장고에 보관할 경우 4-5일 정도 사용할 수 있습니다.
 

제노프스 암컷개구리에서 알을 받는 방법은 2가지가 있습니다. 가장 흔하게 사용하는 방법은 성숙한 암컷 개구리의 등쪽에 있는 림프낭에 생식선 자극 호르몬(hCG)을 주입하여 8-12시간 후 배란이 시작 되게 하는 것입니다. 일정한 간격으로 배를 문질러서 짜주면 알을 얻을 수 있습니다. 
 

* 그림출처: Shaidani NI, McNamara S, Wlizla M, Horb ME. Obtaining Xenopus laevis Embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2021;2021(3):pdb.prot106211. 

다른 방법은 성숙한 암컷 개구리를 마취한 후 하복부를 절개하여 복부 안에 있는 알을 꺼내고 시약으로 옮겨 성숙하도록 만들어 사용하는 방법입니다(Isolation of defolliculated oocytes). 하지만 이 방법은 특별한 목적이 있지 않으면 잘 사용하지 않습니다. 

Egg extract는 성숙한 제노프스 난자 안에 있는 단백질 및 생화학 물질들을 이용한 in-vitro 실험으로, 세포주기와 핵 수송, DNA 복제, 세포골격 등의 광범위한 세포생물학적 기작 연구에 이용됩니다. 난자(egg)는 난모세포(oocyte)가 성숙을 이루고 수정을 위한 상태를 말합니다. 난모(oocyte)의 경우 세포주기에서 G2기에서 M기로의 전환이 이루어지며 egg의 경우 생식세포로서의 M2 세포주기를 유지하게 됩니다. 

*그림출처: Gelens Lab. https://www.gelenslab.org/research/frog-egg-extracts/

실험을 위하여 난자의 표면에 있는 jelly coats를 제거하고 튜브에 모아줍니다. 튜브 속 버퍼를 제거해준 뒤 고속의 원심분리를 이용해 원심력을 가해 주면 시험관의 위부터 지질, 세포질, 난황(yolk) 및 세포핵을 포함한 세포막 찌꺼기 층으로 나뉩니다.  이 가운데 중간의 세포질층은 세포의 생명유지에 필요한 대부분의 물질을 포함하고 있습니다. 
 

Egg extract 는 세포 주기와 관련한 염색체의 다양한 현상을 세포 밖에서 구현할 수 있어 이와 관련된 기작 연구에 다양하게 활용되고 있습니다³. 하지만 보고자 하는 현상에 따라서 egg extract를 준비하는 조건이 다르기 때문에 실험 목적에 맞게 egg extract를 준비해야 합니다. 또한 egg의 품질이 좋지 않으면 배아를 이용한 실험과 마찬가지로 좋은 결과를 얻을 수 없기 때문에 좋은 품질의 egg를 이용하여 extract를 만드는 것이 중요합니다. 

*그림출처: Gibeaux R, Heald R. The Use of Cell-Free Xenopus Extracts to Investigate Cytoplasmic Events. Cold Spring Harb Protoc. 2019;2019(6).

다른 모델 시스템과 마찬가지로 제노프스의 유전체 정보는 잘 알려져 있어 RNA-seq¹과 ChIP-seq²같은 연구를 하는 데 전혀 다른 점이 없습니다. 아마 대부분의 분석 업체가 human/mouse/zebrafish와 같은 많이 사용되는 모델 동물 정보에 익숙하기 때문에 제노프스 실험 분석이 어렵다고 할 수 있는데, XenBase와 같은 데이터베이스에 있는 정보를 활용하면 어렵지 않게 유전체 분석을 할 수 있습니다.

최근 다양한 모델 동물의 유전체 정보를 통합하는 Alliance of Genome Resource에도 참여하게 되어³ 앞으로 더욱 손쉽게 제노프스 유전체 분석을 할 수 있고 더 나아가 사람이나 쥐와 같은 다른 모델과 비교도 쉬워질 것입니다. 단백질체(proteomics)의 경우 제노프스 배아에 yolk 단백질이 많이 있어서 초기 배아의 전체 단백질체를 분석할 때에는 이를 제거할 필요가 있습니다. 이 경우에도 프로토콜이 잘 정립되어 있어⁴ 다른 세포주나 모델동물과 비교했을 때 어렵지 않게 오믹스 실험을 진행할 수 있습니다. 
 

유전자의 기능을 알아보기 위해 제노프스에서 유전자 발현을 억제하여 표현형을 확인하는 실험을 할 수 있습니다. 제노프스를 사용한 유전자 발현 억제는 발생 초기,난할 과정의 배아 할구(blastomere)에 발현을 억제할 수 있는 시료를 미세주사(microinjection) 기법으로 직접 주입하는 방법을 주로 사용합니다¹. 유전자 발현 억제를 위해서 안정성을 높인 anti-sense oligonucleotide 인 morpholino를 사용하여 단백질 형성을 방해하거나 mRNA processing 을 방해하는 방식을 많이 사용하고(morpholino 는 Gene Tools사에서 판매합니다)², 최근에는 CRISPR/Cas9 을 이용하여 해당 유전자에 변이를 유도하여 기능을 억제하는 방법도 많이 사용하고 있습니다³.  다른 모델에서 사용되는 RNAi와 같은 small RNA 기반 발현 억제는 필요한 Ago 와 같은 단백질이 충분하지 않아 작동하지 않는 것으로 알려져 있습니다⁴. 

아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 유전체 복제로 인해서 같은 유전자가 2개씩 존재하는 경우가 많이 있습니다. 이들 유전자는 각각 L-form, S-form 으로 부르며 유전자 이름 뒤에 .L 또는 .S 로 표시합니다. 하지만 유전체 정보가 자세하게 알려져 있고 염기 서열의 차이도 정확하게 알고 있어서 CRISPR guide RNA 나 morpholino를 설계할 때 두 종류의 유전자를 모두 억제할 수 있는 것으로 설계를 하면 두 유전자를 동시에 억제할 수 있습니다. 유전자 염기 서열이 차이가 많이 나서 동시에 발현을 억제할 수 있는 설계가 어려울 때에는 각각 유전자를 억제하는 guide RNA 또는 morpholino를 설계하고 동시에 미세주사하는 방식으로 배아에 전달하면 두 유전자의 발현을 충분히 효과적으로 억제할 수 있습니다. 

제노프스 데이터베이스인 XenBase에서는 또한 유전자 정보 뿐만 아니라 다른 실험이 보고된 경우 해당 유전자의 발현을 억제하였을 때 관찰되는 형질(phenotype)을 체계적으로 정리해두고 있습니다. XenBase에서 관심 유전자를 검색한 후 “Phenotype” 부분을 확인하면 유전자 발현 억제 형질이 관찰된 경우 해당 정보를 확인할 수 있습니다.
 

제노프스는 유전체 정보가 잘 알려져 있습니다. XenBase (https://www.xenbase.org)¹ 가 유전체 뿐만 아니라 제노프스 연구에 필요한 다양한 정보를 관리하고 있으며, 유전자 서열 정보와 발현, 변이 형질에 대해 체계적으로 정리되어 있습니다. UCSC Genome Browser^{2, 3} 와 NCBI 데이터베이스^{4, 5} 에서도 해당 정보를 얻을 수 있으며, EnsEMBL 데이터베이스에는 Xenopus tropicalis 정보만 얻을 수 있습니다⁶. 제노프스가 포함된 양서류는 진화적으로 약 3억 6천만년 전에 포유류 및 조류의 공통 조상에서 분리된 것으로 추측되고 있으며 약 14,000 개의 유전자를 인간 및 다른 포유류 모델 동물과 공유하고 있습니다⁷.

*그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/entry/anatomy/intro.do