[암컷의 교배확인 및 날짜 계산]

1. Vaginal plug 를 통한 교배 확인

암컷과 수컷을 교배한 다음 날 아침 암컷의 질 입구에서 vaginal plug(질전)를 확인하여 교배여부를 판단할 수 있습니다. Vaginal plug는 수컷의 coagulating gland와 vesicular glands의 분비물로 인해 형성되는 하얀 응고물로서 교미한 암컷의 질 입구에서 관찰됩니다. Vaginal plug를 보려면 암컷의 꼬리 밑 부분을 들어 올려 질 입구를 검사하여 흰색 덩어리가 있는지 확인해야 합니다. 잘 보이지 않는다면 멸균된 면봉이나 포셉 등으로 외음부를 살짝 벌리면 더 잘 보일 수 있습니다. Vaginal plug는 일반적으로 시간이 지나면 탈락되기 쉬우므로 오전 중에 확인해야 합니다. 
 

2. 임신일령 또는 교배일령 계산

  1) Vaginal plug가 확인된 경우, 다음날이 수정 첫날이라고 간주됩니다. Vaginal plug가 있다고 해서 임신이 보장되는 것은 아니므로 교미 후의 암컷의 외양을 살펴볼 필요가 있습니다. 
  2) 대리모 제작 목적으로 교배한 경우, vaginal plug가 확인된 당일을 교배일로 간주하여 수정란을 이식합니다. 

*그림 1. Vaginal Plug 확인방법, 출처: Kumamoto University. http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/transfer.html

동물의 생존을 유지하면서 반복적인 소량 채혈이 가능한 방법에는 안면정맥 채혈, 복재정맥 채혈, 경정맥 채혈 등이 있으며 이 중 경정맥 채혈방법은 다음과 같습니다. 
 

[Jugular Vein Bleed (경정맥 채혈)]

마우스 머리 뒤쪽 피부를 잡아당겨 두경부가 과신전 되도록 보정합니다. 목 부분을 알코올로 소독하면 푸른색의 경정맥을 확인할 수 있습니다. 경정맥은 sternoclavicular junction(흉쇄관절: 흉골과 쇄골사이 관절)에서 2~4mm 떨어진 곳에 위치합니다. 25G 바늘을 뒤쪽에서 머리쪽 방향으로 접근하여 경정맥에서 채혈하는 방식입니다. 

* 그림출처:  Hoff J. Lab Animal. 2000;29(10):47-53.

마우스 안면정맥(Facial Vein or Submandibular Vein) 채혈은 마취 없이도 (또는 마취 권장), 경험이 많지 않은 연구자도 비교적 쉽게 채혈이 가능한 방법입니다. 채혈이 가능한 양은 마우스 체중에 따라 차이는 있지만 최대 300μl 정도 반복적으로 채혈이 가능합니다. 안면정맥은 하악골 뒤쪽 바로 위에 위치하고 있습니다. 혈관 위치를 파악하여 Animal Lancet과 같은 미세침으로 안면정맥을 찌른 후, 밖으로 나오는 혈액방울을 채혈용 튜브에 담는 방식입니다.  

[채혈 방법]

1. 준비물: 란셋(23~25G), 채혈 튜브, 지혈용 탈지면 (또는 거즈)
2. 엄지와 검지를 이용하여 마우스의 귀 뒷부분을 끌어 당겨 보정한다. 
3. 란셋을 이용하여 마우스 안구와 입 끝을 직선으로 연결 시 90˚에서 만나는 지점을 찌른다. 
4. 채혈 튜브를 이용하여 혈액을 채취한 후 탈지면 또는 거즈 등을 이용하여 지혈한다. 

* 그림출처: MEDIpoint. For Use on Mice. https://medipoint.com/for-use-on-mice/

마우스 암 전이 모델에는 1)자발적 전이(Spontaneous Metastasis) 모델, 2)실험적 전이(Experimental Metastasis) 모델, 3)유전자변형마우스(GEM) 모델로 나눌 수 있습니다. 자발적 전이 모델은 사람의 암 전이와 유사하게 원발 종양으로부터 전이가 일어나는 것을 확인할 수 있으며 전이의 전 과정을 확인할 수 있다는 장점이 있습니다. 실험적 전이 모델은 장기 특이적(Site Specific) 전이를 빠르게 유발할 수 있으며 사용 가능한 암세포와 종양 모델의 종류가 다양합니다. 유전자변형마우스 모델은 natural microenvironment에서 종양이 발달될 수 있으며, 종양 이질성(Tumor Heterogeneity)을 잘 나타내 주는 모델로 알려져 있습니다. 

* 전이(Metastasis)란 원발 종양(Primary Tumor)에서 암세포가 분리되어(또는 떨어져 나와) 멀리 떨어져 있는 다른 장기에서 종양이 형성(Secondary Tumor) 되는 것을 의미하며 전이의 단계는 Invasion -> Intravasation -> Circulation ->                        Extravasation -> Micrometastasis -> Colonization 과정(그림 1.)을 거치게 됩니다.

[전이 모델에 대한 세부 내용은 아래 표 참고]
  - 모델별 장단점: 표 1., 전이 모델 예: 표 2.

* 그림 1.: 암 전이 단계

* 표 출처:  Gómez-Cuadrado et al. Dis Model Mech. 2017;10(9):1061-1074.

무균동물(Germ-free Animal)이란 검출 가능한 미생물(바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충 등)이 없는 동물을 의미합니다. 무균시설에서 제왕절개나 자궁절제술에 의해 생산되어 Isolator 환경에서 사육되어야 합니다. 
참고로 미생물 상태에 따른 동물은 아래와 같이 분류할 수 있습니다.  

*그림출처: University of Michigan. Germ-Free Mouse Facility. https://animalcare.umich.edu/business-services/germ-free-mouse-facility

눈, 고환과 같은 장기는 Bouin’s solution 또는 Davidson’s solution을 이용하여 고정해야 합니다. 

1. 영장류 채혈 전후 고려사항 
  - 채혈 전 동물의 건강상태(탈수 및 빈혈, 비만, 질병 등)를 확인한다.
  - 10% 이상 채혈을 하는 경우에는 등장성 수액 (Isotonic Fluids: 0.9% saline 이나 Hartmann 수액  등)을 처치해주는 것이 좋다.

2. 채혈부위
 - 대퇴 정맥(Femoral Vein)
 - 요골측피부정맥(Cephalic Vein)
 - 복재정맥(Saphenous Vein)

3. 채혈량과 휴지기
 

[영장류 생애주기(유아기, 청소년기, 성인기, 노령기)]

1. 원숭이 번식군 구성
 - 마모셋 원숭이(Common Marmoset)는 일부일처제(수컷1+암컷1, Monogamy)로 번식하고, 게잡이원숭이(Cynomolgus Monkey)나 붉은털원숭이(Rhesus Monkey)는 일부다처제 (수컷1+암컷 >2, Multigamy)로 번식합니다.
 

2.  원숭이 번식생리 

3. 임신 진단방법
  1) 복부촉진(마모셋원숭이): 하복부 복부촉진을 통해 임신유무를 확인(대장 내 소화물과 감별 필요)
  2) 영상진단
    - 초음파 검사: 임신초기 진단에 유용하며, 산자수  및 태아지표(심장박동, Biparietal Diameter 등) 확인
    - 방사선 검사: 산자수 확인 및 태아의 골반 통과 평가 등에 활용

1. 영장류 정의   

 - 평편한 발톱이 있고(유조류), 쇄골이 있고, 태반을 갖는 포유류
 - 적어도 한 쌍의 사지에서 가장 안쪽의 발가락이 서로 마주 볼 수 있어야함
 - 뼈로 안와가 형성되어 있음

2. 영장류 분류  

 - Non-Human Primate : 사람을 제외한 영장류
 - 연구 활용 영장류 : 구세계 원숭이, 신세계 원숭이

3. 영장류 실험 전 점검 사항

 1) 정말 영장류 실험이 필요한지? 다른 설치류나 dog, rabbit 등으로 가능한지 확인
    - In silico 분석이나 문헌조사 : DNA, RNA, and/or protein sequence homology, MOA(mode of action)  문헌 분석 
    - In vitro 분석이나 면역조직학적 분석 : MOA(mode of action) 기전 및 시료 분석법 검증
 2) 관계법령에 대한 이해
    - 환경부 : 야생생물 보호 및 관리에 관한 법률
    - 농림축산식품부 : 동물보호법, 가축전염병 예방법, 영장류 수입위생 조건
    - 식약처 : 실험동물에 관한 법률
 3) 어디 시설에서 진행할 것인지? (자체 시설 또는 외부 시설)
 4) 연구기간과 예산 고려  
 5) 영장류 실험 종료 신고 : 환경부