곤충에서의 사회성이라 하는 것은 크게 두 가지로 나누어 집니다. 진사회성 곤충 (Eusocial insect)와 독거성 곤충 (Solitary insect)입니다. 진사회성 곤충은 주로 여왕이 있는 개미나 벌에서 관찰이 되며 이들은 분류학 상으로 벌목 (Hymenopteran)에 해당합니다. 이 외에도 바퀴목 (Blattodea), 흰개미목 (Isoptera), 총채벌레목 (Thysanoptera), 노린재목 (Hemiptera), 딱정벌레목 (Coleoptera)가 진사회성을 갖는다고 알려졌고, 해당 곤충들은 표피탄화수소 (Cuticular hydrocarbons) 이라는 페로몬 물질이 암컷 특이적으로 분비되어 사회성이 생긴다고 알려져 있습니다. 하지만, 초파리의 경우에는 파리목 (Diptera)에 속하는 곤충으로써 지금까지 연구된 결과 이들은 독거성 곤충으로 알려져 있습니다¹. 따라서 초파리의 경우에는 사회성이 존재하지 않고, 서열도 존재하지 않는다고 알려져 있습니다.

하지만 최근 연구에 따르면 진사회성 이외에도 아사회성(Subsocial),  공동사회성(Communal) 등의 사회성이 곤충에서 발견되었고¹, 나아가 초파리에서도 시각정보와 후각정보에 의해 조절되는 뇌의 활동이 다른 초파리와 상호작용에 영향을 준다는 사실이 밝혀졌습니다². 따라서 초파리 사회에서도 서열이 있는지는 앞으로 연구가 더 필요합니다.

제노프스에서 유전자의 발현을 확인하는 방법은 여러가지가 있지만 대표적으로 다음 두 가지 방법이 많이 사용됩니다. 유전자가 어떤 조직에서 발현하는지 확인하는 방법인 in-situ hybridization assay^{1, 2}와 발생학적 stage에서 확인하는 방법인 RT-PCR입니다. 

[In-Situ Hybridization]

- 확인하고자 하는 유전자의 RNA 염기서열에 binding 하는 RNA probe를 사용하여 유전자의 발현을 확인하는 방법

- 주로 조직 발현을 확인하기 위해 사용하나, 시그널의 세기를 통해 정량적 분석도 가능함

*그림출처: Whole-Mount and Section In Situ Hybridization in Mouse Embryos for Detecting mRNA Expression and Localization. Methods Mol Biol. 2018;1752:123-131.

[RT(Reverse Transcriptase)-PCR]

- 발생 stage별로 추출한 RNA를 사용하여 어떤 stage에서 확인하고자 하는 유전자가 발현하는지 확인하는 방법

*그림출처: https://www.facebook.com/everythingaboutBiotech/photos/a.2035926766637950/2825927254304560/?type=3

In situ hybridization 의 경우 실험 단계가 복잡하지만 유전자 발현 정도와 함께 발생 단계의 조직/세포 특이적 발현을 확인할 수 있는 장점이 있고, RT-PCR 의 경우 실험 방법이 간단하지만 전체 배아에서 유전자의 발현 정도만 확인할 수 있는 단점이 있습니다. 단백질 수준에서 유전자 발현을 확인하고자 할 때에는 다른 모델 동물과 유사하게 western blot 또는 immunostaining 방법을 사용할 수 있습니다. 

XenBase 데이터베이스에서는 다양한 in situ hybridization 방법과 genome-wide transcriptome 정보를 통합하여 발생 단계 및 성체 장기에서 각 유전자의 발현 정도를 확인할 수 있는 정보를 제공하고 있습니다³.

제노프스는 원래 1930년대 임신 진단을 위해 사용되었습니다. 임신한 여성의 소변에 존재하는 chorionic gonadotropin이라는 호르몬이 제노프스에 작용하여 알을 낳을 수 있도록 했기 때문입니다. 손쉽게 많은 양의 배아를 얻을 수 있고 인간 호르몬이 작용하는 것처럼 인간과 유사성이 높아 과학자들은 제노프스를 실험 동물 모델로 사용하게 되었습니다¹. 제노프스는 실험 동물 모델로서 다음과 같은 많은 장점이 있습니다².

1) Chorionic gonadotropin 주사를 통해 필요할 때 배아를 얻을 수 있다.

2) 체외수정을 통해 stage control이 가능하다.

3) 난자의 크기가 다른 모델동물과 비교하여 매우 크기 때문에 manipulation이 쉽다.

4) Cell fatemap을 통해 특정 조직에서 유전자 발현의 조절이 가능하다.

5) 발생 속도가 빨라 수정 후 일주일 내에 대부분의 장기를 관찰할 수 있다.

6) 한번에 몇 천 마리의 배아를 얻을 수 있어 대량분석이 가능하다.

또한 CRISPR/Cas9 기술의 발전과 함께 다양한 질병 동물 모델을 만들 수 있게 되었습니다. 유전적 변이 뿐만 아니라 인간 질병 연관 변이를 포함하는 유전자의 기능에 대해서도 빠르게 그 기능을 확인할 수 있는 장점으로 바이오메디컬 연구에 다양하게 활용이 되고 있습니다. 커뮤니티에서 정기적으로 작성하고 있는 백서(white paper)³에는 최근 질병 관련 제노프스 연구 결과를 정리되어 있습니다. 
 

제노프스 배아에 미세주입(microinjection)을 하기 위해서는 다음과 같은 3가지 장비가 필요합니다. 

1) Stereo-microscope : 배아를 눈으로 보기 위한 해부현미경.

2) Microinjector : 모세관 바늘에 담긴 유전자 또는 주입하고자 하는 물질을 주사와 같은 방식으로 밀어주기 위한 장비. 보통 질소를 이용함. 

3) Micromanipulator : 모세관 바늘을 장착한 뒤 배아에 원하는 곳에 주입할 수 있도록 섬세하게 움직임을 조정할 수 있는 장비. 

Microinjector의 경우 picoliter 수준의 부피를 조절할 수 있는 장비가 필요합니다. 

*그림출처: Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J Vis Exp. 2016;(111):53799. 

제노프스에서 유전자를 주입하여 발현시키는 방법으로는 대표적으로 두 가지가 있습니다. 하나는 발현하고자 하는 유전자를 포함하는 DNA construct를 배아에 미세주입(microinjection)하여 유전자를 발현시키는 방법입니다. 이 방법은 DNA가 mRNA 보다 안정적이어서 보관이 쉽지만 제노프스 배아에 주입하였을 때 독성을 보이는 문제가 있습니다. 보통 주입하는 유전자의 효과적인 발현을 위해 CMV promoter가 같이 붙어있는 DNA construct를 주입하여 실험을 진행합니다. 또한, DNA 플라스미드를 주입할 경우 난할 과정에서 DNA가 할구에 균일하게 나뉘어 지지 않아 모자이크 형태의 발현을 보입니다. 다른 한 방법은 In vitro transcription을 통해 제작된 mRNA를 배아에 미세주입하여 유전자를 발현시키는 방법입니다. 이 경우 독성이 적어 많은 양을 주입할 수 있는 장점이 있지만 RNA를 보관하거나 실험을 진행하는 과정에서 쉽게 손상되는 문제를 주의해야 합니다.

제노프스는 초기 배아 세포가 어떠한 조직으로 발생하는지에 대한 세포 운명 지도(fatemap)가 잘 알려져 있어¹ 특정 조직에만 유전자를 발현시키거나, 저해시키는 injection 기법 또한 가능합니다. 
 

제노프스 연구자들을 위한 정보는 XenBase 데이터베이스에서 통합 관리되고 있습니다¹. 유전체 정보 이외에도 검증된 항체, morpholino, guide RNAs 정보 등 실험에 필요한 각종 reagents, 실험 프로토콜 등이 “Reagents & Protocols” 메뉴 아래 정리되어 있습니다. 또한 2000년에 CSHL Press 에서 발간된 “Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual”²은 20년이 넘은 현재까지도 표준적인 실험 방법들을 기록하고 있는 참고 서적으로 연구자들에게 받아들여지고 있어 많은 참고가 될 것입니다. 최근 유전체 연구와 같이 최신 기법들을 추가하여 해당 책의 내용들을 많이 업데이트해서 CSH Protocols³ 웹사이트에 공개하고 있습니다. 따라서 해당 웹사이트에서 하고자 하는 실험 프로토콜을 쉽게 찾을 수 있을 것입니다. 

수정된 배아에 미세주입(microinjection) 실험을 진행하거나 일부 조직을 수술적으로 가공하는 등의 실험을 진행하기 위해서는 배아를 감싸고 있는 jelly layer의 제거가 필수적입니다. 보통 날카로운 핀셋으로 잡아서 물리적으로 제거하게 되는데 이 jelly layer가 제거된 배아는 공기 노출에 매우 취약하므로 제거 이후 공기에 노출되지 않도록 조심하여야 합니다. 배아가 길어지기 시작하는 NF stage 20 시기가 지나가면 배아가 움직이게 되는데 이때 이미징 등 배아를 고정해서 진행해야 하는 경우 Benzocaine이나 MS-222와 같은 국소마취제를 포함한 버퍼에 배아를 담아 실험을 진행합니다. 이들 국소마취제는 사람에게도 사용되는 물질로 취급 시 보호구를 필수 착용하여야 합니다.

배아를 다루는 위해서 일반적으로 날카로운 핀셋을 주로 사용하지만, 사람의 눈썹과 머리카락으로 만든 eyebrow knife와 hair loop라는 도구도 만들어서 많이 활용합니다. 오른쪽 그림에서 위쪽이 eyebrow knife로 보통 배아의 특정 조직을 섬세하게 잘라낼 때 사용하며, 아래쪽이 hair loop으로 배아를 원하는 위치로 이동할 때 사용합니다.

*그림출처: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus. J Vis Exp. 2018;(132):56035.

제노프스에 사용 가능한 항체를 구입하는 방법에는 크게 2가지가 있습니다. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)¹에서 발생학에 사용되는 다양한 항체들을 판매하는데 그 가운데 제노프스에서 사용이 검증된 제품을 구매하는 방법이 있고, XenBase 데이터베이스²의 “Reagents & Protocols” 메뉴에 정리되어 있는 제노프스에서 사용이 검증된 항체 제품을 이용하는 방법이 있습니다. 

제노프스 단백질의 경우 아미노산 서열이 인간이나 쥐와 크게 다르지 않은 경우도 많이 있어서 인간이나 쥐 단백질을 위해 개발된 항체를 사용했을 때 작용할 수 있는 가능성도 적지 않습니다. Xenopus는 약 80%정도의 단백질서열이 사람과 유사 한 것으로 알려져 있습니다. 따라서, DSHB, Xenbase에 사용 가능한 항체 정보가 없을 경우, 사람 또는 마우스의 항체의 항원(epitope) 정보를 확인하고, Xenopus 단백질의 서열과 비교하여 동일한 항원 서열일 경우 사용할 수 있습니다. 

다른 방법으로 미세주입(microinjection)이 쉬운 장점을 활용하여 발현을 확인하고자 하는 단백질 유전자에 많이 사용되는 표지자(tag; FLAG, His, HA, V5, GFP 등)를 결합시키고 해당 유전자의 mRNA 를 주입하여 해당 단백질의 세포 내 위치나 발현 정도를 확인할 수 있습니다.

제노프스 난자(oocyte)는 막 단백질의 발현량이 매우 적으며 이에 따라 낮은 기저 수송 활동(background transport activity)을 가지고 있습니다. 따라서 이온 수송 단백질 등과 같은 막단백질의 활성을 측정하기에 굉장히 유리한 조건을 가지고 있습니다. 연구하고자 하는 막 단백질을 제노프스 난자에서 발현시킨 후, 이들의 활성을 측정하는 것을 oocyte uptake assay라고 합니다. 

먼저, 제노프스 난자에 미세주입기법을 이용해 우리가 알고자 하는 막 단백질의 mRNA를 주입하여 단백질을 발현시킵니다. 이때 꼭 제노프스의 막 단백질 뿐만 아니라 식물 등 다른 종의 막 단백질을 발현시켜 활성을 측정하는 것도 가능합니다. 이후 제노프스 난자가 들어있는 배지에 방사성으로 표지되었거나 혹은 형광으로 표지된 물질을 함께 넣어주고  일정 시간이 지난 후, 제노프스 난자 내에 방사성으로 표지된 혹은 형광으로 표지된 물질이 얼마나 들어있는지를 분석함으로써 막 단백질의 활성을 측정할 수 있습니다.

최근에는 방사성 또는 형광 표지된 물질 대신 액체크로마토그래피와 질량분석(LC-MS)을 이용해서도 어떤 물질이 얼마나 흡수되고 이동했는지를 알 수 있습니다.
 

발톱개구리과(family)에 속하는 종들은 9개의 염색체를 기본으로 가지고 있지만, 전체 유전체 복제(whole genome duplication; WGD)를 통해서 다양한 배체수를 가지고 있습니다. 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 4배체 유전체를 가진 종으로 18개 염색체를 가지고 있습니다 (반면 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)는 이 가운데 한 개의 염색체가 나눠져서 총 10개의 염색체를 가지고 있습니다.) 하지만 유전체 복제로 이루어진 18개 염색체는 서로 상동유전체를 가지고 있는데, 이를 크기로 구분하여 상동유전체 가운데 큰 염색체를 L 염색체, 작은 염색체를 S 염색체로 부르고, 이는 염색체 이름에도 반영되어 있습니다 (chr1L, chr1S, chr2L, chr2S, …). 상동유전체가 복제되어 있으니 상동유전자(orthologous gene) 역시 두 개가 존재할 수 있습니다 (유전체 복제 이후 많은 유전자들이 선택적으로 사라져서 모든 유전자가 두 개가 존재하지는 않습니다). 이 경우 L 염색체에 존재하는 유전자와 S 염색체에 존재하는 유전자를 각각 .L 및 .S 를 뒤에 붙여서 표기합니다. 예를 들어 Pax6.L 과 Pax6.S 단백질의 경우 둘 다 Pax6 유전자와 상동 관계에 있는 유전자이며 각각 L/S 염색체에 존재하는 것입니다. 

이러한 정보는 XenBase 데이터베이스에 잘 정의되어 있는데 아래 예시와 같이 pax6 유전자의 경우 2배체인 서양 발톱 개구리(X. tropicalis)에는 4번 염색체에 하나의 유전자가 존재하며, 4배체인 아프리카 발톱 개구리(X. laevis)에는 4L 및 4S 염색체에 각각 유전자가 존재하는 것을 알 수 있습니다. 하지만 이들 복제된 유전자(pax6.S 및 pax6.L)들은 대부분 인간 및 다른 종의 상동유전자와 높은 상동성을 가지고 있어 비슷한 기능을 수행할 것으로 예측하고 있습니다. 제노프스 유전자에 대한 다른 종의 상동유전자는 XenBase 데이터베이스³ 및 Genome Alliance Resource 데이터베이스⁴에서 쉽게 확인할 수 있습니다. 

*그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/entry/gene/showgene.do?method=display&geneId=991974&