제노프스 배아를 수정하는 방법은 크게 두 가지 방법이 있습니다. 자연 수정(natural mating)은 수정 효율을 높이기 위하여 수컷 개구리, 암컷 개구리 모두에 hCG(Human Chorionic Gonadotropin)를 주사하고 하루 정도 지난 이후 한 통에 넣어서 짝짓기를 하는 방식입니다. 이 경우, 일정 시간 간격으로 바닥에 떨어진 배아를 걷어서 실험에 사용하게 됩니다. 한 번 수정을 한 후에는 약 3개월 정도의 휴식기를 거친 뒤 다시 사용할 수 있습니다. 자연 수정 방법의 경우 체외 수정 방법에 비해 수컷 개구리를 희생시키지 않아도 된다는 장점을 가지고 있지만, 반면에 미세주입 기반 실험에 중요한 배아의 발생 단계를 동일하게 할 수 없다는 단점이 있습니다. 
 

체외수정(In Vitro Fertilization) 방법은 암컷 개구리만 hCG를 주사하여 배란을 유도하고 알을 모은 후, 수컷 개구리에게서 수술적 방법으로 채취한 정소를 잘게 부순 뒤 섞어주어 수정시키는 방법입니다. 이 방법은 수컷 개구리를 정소 채취를 위해 희생해야 한다는 단점이 있지만 많은 수의 배아를 동일한 발생 단계로 만들어 실험할 수 있다는 장점이 있습니다. 채취한 정소는 버퍼에 담아 냉장고에 보관할 경우 4-5일 정도 사용할 수 있습니다.
 

제노프스 암컷개구리에서 알을 받는 방법은 2가지가 있습니다. 가장 흔하게 사용하는 방법은 성숙한 암컷 개구리의 등쪽에 있는 림프낭에 생식선 자극 호르몬(hCG)을 주입하여 8-12시간 후 배란이 시작 되게 하는 것입니다. 일정한 간격으로 배를 문질러서 짜주면 알을 얻을 수 있습니다. 
 

* 그림출처: Shaidani NI, McNamara S, Wlizla M, Horb ME. Obtaining Xenopus laevis Embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2021;2021(3):pdb.prot106211. 

다른 방법은 성숙한 암컷 개구리를 마취한 후 하복부를 절개하여 복부 안에 있는 알을 꺼내고 시약으로 옮겨 성숙하도록 만들어 사용하는 방법입니다(Isolation of defolliculated oocytes). 하지만 이 방법은 특별한 목적이 있지 않으면 잘 사용하지 않습니다. 

Egg extract는 성숙한 제노프스 난자 안에 있는 단백질 및 생화학 물질들을 이용한 in-vitro 실험으로, 세포주기와 핵 수송, DNA 복제, 세포골격 등의 광범위한 세포생물학적 기작 연구에 이용됩니다. 난자(egg)는 난모세포(oocyte)가 성숙을 이루고 수정을 위한 상태를 말합니다. 난모(oocyte)의 경우 세포주기에서 G2기에서 M기로의 전환이 이루어지며 egg의 경우 생식세포로서의 M2 세포주기를 유지하게 됩니다. 

*그림출처: Gelens Lab. https://www.gelenslab.org/research/frog-egg-extracts/

실험을 위하여 난자의 표면에 있는 jelly coats를 제거하고 튜브에 모아줍니다. 튜브 속 버퍼를 제거해준 뒤 고속의 원심분리를 이용해 원심력을 가해 주면 시험관의 위부터 지질, 세포질, 난황(yolk) 및 세포핵을 포함한 세포막 찌꺼기 층으로 나뉩니다.  이 가운데 중간의 세포질층은 세포의 생명유지에 필요한 대부분의 물질을 포함하고 있습니다. 
 

Egg extract 는 세포 주기와 관련한 염색체의 다양한 현상을 세포 밖에서 구현할 수 있어 이와 관련된 기작 연구에 다양하게 활용되고 있습니다³. 하지만 보고자 하는 현상에 따라서 egg extract를 준비하는 조건이 다르기 때문에 실험 목적에 맞게 egg extract를 준비해야 합니다. 또한 egg의 품질이 좋지 않으면 배아를 이용한 실험과 마찬가지로 좋은 결과를 얻을 수 없기 때문에 좋은 품질의 egg를 이용하여 extract를 만드는 것이 중요합니다. 

*그림출처: Gibeaux R, Heald R. The Use of Cell-Free Xenopus Extracts to Investigate Cytoplasmic Events. Cold Spring Harb Protoc. 2019;2019(6).

다른 모델 시스템과 마찬가지로 제노프스의 유전체 정보는 잘 알려져 있어 RNA-seq¹과 ChIP-seq²같은 연구를 하는 데 전혀 다른 점이 없습니다. 아마 대부분의 분석 업체가 human/mouse/zebrafish와 같은 많이 사용되는 모델 동물 정보에 익숙하기 때문에 제노프스 실험 분석이 어렵다고 할 수 있는데, XenBase와 같은 데이터베이스에 있는 정보를 활용하면 어렵지 않게 유전체 분석을 할 수 있습니다.

최근 다양한 모델 동물의 유전체 정보를 통합하는 Alliance of Genome Resource에도 참여하게 되어³ 앞으로 더욱 손쉽게 제노프스 유전체 분석을 할 수 있고 더 나아가 사람이나 쥐와 같은 다른 모델과 비교도 쉬워질 것입니다. 단백질체(proteomics)의 경우 제노프스 배아에 yolk 단백질이 많이 있어서 초기 배아의 전체 단백질체를 분석할 때에는 이를 제거할 필요가 있습니다. 이 경우에도 프로토콜이 잘 정립되어 있어⁴ 다른 세포주나 모델동물과 비교했을 때 어렵지 않게 오믹스 실험을 진행할 수 있습니다. 
 

유전자의 기능을 알아보기 위해 제노프스에서 유전자 발현을 억제하여 표현형을 확인하는 실험을 할 수 있습니다. 제노프스를 사용한 유전자 발현 억제는 발생 초기,난할 과정의 배아 할구(blastomere)에 발현을 억제할 수 있는 시료를 미세주사(microinjection) 기법으로 직접 주입하는 방법을 주로 사용합니다¹. 유전자 발현 억제를 위해서 안정성을 높인 anti-sense oligonucleotide 인 morpholino를 사용하여 단백질 형성을 방해하거나 mRNA processing 을 방해하는 방식을 많이 사용하고(morpholino 는 Gene Tools사에서 판매합니다)², 최근에는 CRISPR/Cas9 을 이용하여 해당 유전자에 변이를 유도하여 기능을 억제하는 방법도 많이 사용하고 있습니다³.  다른 모델에서 사용되는 RNAi와 같은 small RNA 기반 발현 억제는 필요한 Ago 와 같은 단백질이 충분하지 않아 작동하지 않는 것으로 알려져 있습니다⁴. 

아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)는 유전체 복제로 인해서 같은 유전자가 2개씩 존재하는 경우가 많이 있습니다. 이들 유전자는 각각 L-form, S-form 으로 부르며 유전자 이름 뒤에 .L 또는 .S 로 표시합니다. 하지만 유전체 정보가 자세하게 알려져 있고 염기 서열의 차이도 정확하게 알고 있어서 CRISPR guide RNA 나 morpholino를 설계할 때 두 종류의 유전자를 모두 억제할 수 있는 것으로 설계를 하면 두 유전자를 동시에 억제할 수 있습니다. 유전자 염기 서열이 차이가 많이 나서 동시에 발현을 억제할 수 있는 설계가 어려울 때에는 각각 유전자를 억제하는 guide RNA 또는 morpholino를 설계하고 동시에 미세주사하는 방식으로 배아에 전달하면 두 유전자의 발현을 충분히 효과적으로 억제할 수 있습니다. 

제노프스 데이터베이스인 XenBase에서는 또한 유전자 정보 뿐만 아니라 다른 실험이 보고된 경우 해당 유전자의 발현을 억제하였을 때 관찰되는 형질(phenotype)을 체계적으로 정리해두고 있습니다. XenBase에서 관심 유전자를 검색한 후 “Phenotype” 부분을 확인하면 유전자 발현 억제 형질이 관찰된 경우 해당 정보를 확인할 수 있습니다.
 

제노프스는 유전체 정보가 잘 알려져 있습니다. XenBase (https://www.xenbase.org)¹ 가 유전체 뿐만 아니라 제노프스 연구에 필요한 다양한 정보를 관리하고 있으며, 유전자 서열 정보와 발현, 변이 형질에 대해 체계적으로 정리되어 있습니다. UCSC Genome Browser^{2, 3} 와 NCBI 데이터베이스^{4, 5} 에서도 해당 정보를 얻을 수 있으며, EnsEMBL 데이터베이스에는 Xenopus tropicalis 정보만 얻을 수 있습니다⁶. 제노프스가 포함된 양서류는 진화적으로 약 3억 6천만년 전에 포유류 및 조류의 공통 조상에서 분리된 것으로 추측되고 있으며 약 14,000 개의 유전자를 인간 및 다른 포유류 모델 동물과 공유하고 있습니다⁷.

*그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/entry/anatomy/intro.do

우리나라에서는 한림대학교에서 제노프스 소재 은행을 운영하고 있습니다 ¹.  연구용으로 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis)를 이용하고자 하는 경우 소재은행을 운영하고 있는 김재봉 교수 연구실에 연락하여 분양 신청을 할 수 있습니다. 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)의 경우 정식 분양 서비스는 진행되지 않고 있지만 국내 연구하고 있는 연구자들에게 개인적으로 문의할 수 있습니다. 제노프스 연구자들의 모임인 한국 세포분자생물학회(KSMCB) 제노프스 분과² 에 개인적으로 연락해 보실 수 있습니다. 

외국의 경우 미국과 영국의 소재 은행, 미국의 상업 업체에서 제노프스를 수입할 수 있습니다. 미국 Marine Biological Laboratory (MBL)에 있는 National Xenopus Resource Center (NXR) ³, 영국 University of Portsmouth에 있는 European Xenopus Resource Center (EXRC) ⁴ 가 연구용 제노프스를 분양 및 판매하고 있습니다. 또한 이들 센터에서는 연구용으로 개발된 유전자 변형 transgenic 라인 및 inbred 개체(J-strain) 등도 판매하고 있습니다. 

상업적으로 제노프스를 판매하는 곳들도 있는데 미국의 Xenopus1⁵ 과 Xenopus Express⁶ 가 전세계 제노프스 연구자들이 많이 이용하는 업체입니다. 다만 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)의 경우 생태계 위해우려종으로 지정되어 있어⁷ 수입에 해당 지역의 지방 환경청의 별도 승인이 필요합니다. 관련해서 도움이 필요하신 경우 한국 세포분자생물학회(KSMCB) 제노프스 분과² 에 연락을 주시면 도움을 받으실 수 있습니다. 

제노프스는 물고기와 사육 방법이 비슷하여 집에서도 쉽게 키울 수 있습니다. 다만 위에서 언급한 바와 같이 아프리카 발톱 개구리는 우리나라에서 서식하는 종이 아니고, 추가로 생태계 위해우려종으로 지정되어 있어 환경에 노출시키면 안됩니다. 집에서 키우던 발톱 개구리를 더이상 키울 수 없게 되었을 때에는 한림대학교 제노프스 소재 은행이나 KSMCB 제노프스 분과에 연락주시면 가까운 곳에서 있는 제노프스 분과 연구자와 연결시켜 드릴 수 있습니다. 
 

실험에 주로 사용되는 제노프스는 아프리카 발톱 개구리 Xenopus laevis 가 주로 사용되고 최근 서양 발톱 개구리 Xenopus tropicalis 도 많이 사용되고 있습니다. 원래 아프리카 발톱 개구리가 실험에 많이 사용되었는데, 유전체 복제(genome duplication)로 인한 4배체 유전체를 가지고 있어서 유전체 기반 연구에 어려움이 있었습니다 (염색체를 각 부모에게서 물려받아 한 쌍(2N)씩 가지고 있는 인간에 비해, 아프리카 발톱 개구리는 각 부모에게서 비슷한 염색체 2개씩 물려받아 두 쌍(2N)을 가짐). 이를 해결하기 위해 인간과 유사한 2배체(2N) 유전체를 가지는 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)가 연구에 활용되기 시작했습니다. 두 종의 유전체 모두 완전히 해독이 끝나서 현재는 두 종 모두 다양한 연구에 활용되고 있습니다. 

*그림출처: https://www.eurekalert.org/multimedia/922783, 위키피디아

큰 크기와 특이한 모양으로 인하여 아프리카 발톱 개구리와 환경유해종인 황소개구리를 혼동하는 경우가 많이 있는데, 계통수(phylogenetic tree)를 확인해보면 제노프스가 속한 발톱개구리과(Pipidae)는 개구리과(Ranidae)에 속한 황소개구리 (Lithobates catesbeianus) 뿐만 아니라 그 외 다른 개구리들과 진화적으로 큰 차이가 있음을 알 수 있습니다. 특히 올챙이 시절 물 속에서 살다가 개구리가 되면 육지에서 사는 일반적인 개구리에 비해서 제노프스를 포함한 발톱개구리과에 속하는 개구리들은 물고기처럼 평생 물 속에서 생활합니다. 

제노프스는 양서류이기 때문에 사육할 때 무엇보다 중요한 것 중의 하나가 물입니다. Embryo의 사육을 위해서는 pH, 염분, 온도를 모두 고려해야 합니다. 이를 위해 pH와 염분이 적합한 Marc's Modified Ringer's solution을 희석하여 사용합니다. 일반적으로 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis)는 1/3X MMR을, 서양 발톱 개구리(Xenopus tropicalis)는 1/9X MMR을  사육용 buffer로 사용합니다.

온도의 경우 일반적으로는 22~25°C 로 맞추지만 (일반적으로 상온(RT)으로 표현) 실험 계획에 따라 더 낮은 온도의 경우 천천히, 더 높은 온도의 경우 빠르게 발생합니다. 하지만 16 °C 미만, 28 °C 초과의 조건에서는 embryo가 죽을 수 있습니다. 온도에 따라 다르기는 하지만 두 달 정도 키우면 배아는 올챙이 과정과 변태 (metamorphosis) 과정을 거쳐 이후 두 다리가 모두 발생한 성체 개구리까지 도달할 수 있습니다. 발생학에서는 성체 개구리를 연구하는 경우가 많지는 않지만 조직 재생(tissue regeneration) 관련 연구나 유전학 연구에서 종종 활용되고 있습니다.

제노프스의 수정란은 수정 이후 세포분열을 거듭하여 형태를 바꾸는데 순차적으로 변하는 각각의 형태를 구분하여 stage 로 부릅니다. P. D. Nieuwkoop과 J. Faber가 1994년에 정리한 내용 ¹을 바탕으로 사용하여 “NF Stage” 라고도 부르며, 각 stage가 가지는 특징과 장기 형성 과정에 대한 특징은 제노프스의 정보를 관리하고 있는 Xenbase 데이터베이스에 해당 참고문헌에 나오는 이미지와 설명을 정리하여 공개하고 있습니다 ².

제노프스 배아는 수정 후 2-cell, 4-cell 등을 거쳐 안쪽에 빈 공간이 생기는 포배(blastula), 배엽을 형성하는 낭배(gastrula), 신경판이 나타나는 신경배(neurula), 꼬리싹기(tailbud-stage) 단계를 지나서 흔히 올챙이라고 부르는 tadpole 형태로 발생하게 됩니다. 그 이후 metamorphosis를 겪은 뒤 성체가 되기 까지 지속적으로 변화를 겪습니다. 발생 실험에서는 보통 NF stage 45 이전 단계를 주로 관찰하고 있습니다. 

* 그림출처: The Transcriptome of Xenopus Tropicalis; http://jason.chuang.ca/research/xenopus/

예쁜꼬마선충은 자웅동체와 수컷의 두 성별로 이루어져 있기 때문에 기본적으로는 자웅동체만으로도 strain을 유지할 수 있습니다. 하지만 실험의 필요에 따라 2개의 strain을 교배하여 특정 유전자의 기능을 살펴보아야 할 경우가 있습니다. 예를 들어, 실험 대상이 되는 형질전환 선충(transgenic worms)에 돌연변이(mutation)를 도입해서 그 효과를 살펴보는 경우나, 2개의 돌연변이를 포함한 선충(double mutants) 제작이 필요한 경우가 있습니다. 이 경우에는 하나의 strain으로부터 수컷을 얻어 다른 strain의 자웅동체와 교배함으로써 필요한 선충을 얻을 수 있습니다.

1. 수컷 만들기

일반적인 배양 조건에서 수컷은 아주 일부만 나타납니다 (~0.2%). XX염색체를 지닌 자웅동체와 달리 수컷은 XO염색체 상태로 X염색체를 1개만 가지고 있습니다. 따라서 감수분열 과정에서 염색체 분리가 제대로 일어나지 않았을 때 가끔 수컷이 출현합니다. 교배를 위해서는 많은 수의 수컷이 필요하며 다음과 같은 방법을 이용할 수 있습니다.

 1) 많은 수의 선충을 배양하여 자발적으로 생기는 수컷을 모아서 새로운 배지에 옮기고 자웅동체와 교배하면 더 많은 수컷 자손을 얻을 수 있습니다. 이후에는 수컷이 많이 포함된 배지를 주기적으로 배양함으로써 유지할 수 있습니다.

 2) 열충격(heat shock)을 이용해 수컷을 많이 얻을 수 있습니다. 막 성숙한 단계의 자웅동체 성체(young adult hermaphrodites) 10~20 마리를 배지에 옮기고 30˚C에서 16시간 이상 / 또는 34˚C에서 3-4시간 / 또는 37˚C에서 2시간 배양하면, 열충격에 의해 염색체 분리의 이상이 유도된다고 알려져 있습니다. 열충격을 받은 자웅동체가 낳은 자손에 포함된 수컷을 선별하여 키웁니다.

 3) 가능한 경우, 유전적으로 많은 수의 수컷을 만들 수 있는 Him(high incidence of males) 유전자의 돌연변이 strain을 이용하기도 합니다. 대표적으로 이용하는 strain은 him-5 또는 him-8 돌연변이 선충이며, 이 경우 전체 자손 중 20~40%의 개체가 수컷입니다.
 

2. 교배하기

위 방법을 통해 하나의 strain에서 많은 수컷을 얻었다면 다른 strain의 자웅동체와 교배를 시킵니다. 원하지 않는 유전자가 섞이는 상황을 방지하기 위해 아직 교미하기 이전의 L4단계의 자웅동체와 젊은 수컷 성체를 배지에 옮겨서 교배를 합니다. 보통 자웅동체보다 많은 수의 수컷을 넣어주며 (1:3 이상의 비율로), 이 때 알이나 유충이 함께 옮겨오지 않도록 주의해야 합니다.