[예쁜꼬마선충 생애주기]

배아(Embryo) -> L 1, 2, 3, 4 -> 성체(Adult)

배아 발생은 20℃에서 약 16시간이 소요되며, 자웅동체 배아는 부화하여 L1이 됩니다. L1 이후 L2, L3, L4가 되기까지 각각의 단계는 새로운 큐티클이 만들어지는 수면과 같은 비활성기간으로 끝나고, 비활성기간은 오래된 큐티클을 제거하며 끝나게 됩니다. 각각의 단계에서 다음 단계까지는 약 12시간이 소요됩니다. L4에서 12시간 후 성체로 자라나며, 자웅동체(hermaphrodites)의 경우 자체 생산한 정자를 모두 활용할 때까지 2~3일 동안 번식을 합니다. 정자가 고갈된 자웅동체는 수컷과 짝짓기를 할 경우 추가로 자손을 생성할 수 있습니다. 생식 기간이 지나고 자웅동체는 노화로 죽기 전에 몇 주 더 생존할 수 있습니다. 다우어(Dauer)는 먹이가 부족할 경우 입을 막아 먹이를 먹는 것을 방해하는 큐티클을 분비하며, 화학물질 내성을 강화시켜 환경적 스트레스로부터 보호합니다. 먹이가 생기면 큐티클을 벗은 후 L4 단계로 성장합니다. 숙련된 연구자의 경우 광학현미경을 이용하여 육안으로도 생애주기를 구별하는 것이 가능합니다. 각각의 실험 목적에 따라 적용 가능한 단계가 다르기 때문에 선행연구를 참고하여 준비하는 것을 권장합니다. 먹이가 풍부한 곳으로 예쁜꼬마선충을 옮긴 후 성체 단계에서 알을 품은 상태가 되기까지 2일이 소요됩니다. 알들을 모은 이후 선충을 다시 원하는 성장 단계로 맞추는데 2-3일 정도 소요되니 실험 날과 맞춰 준비하시면 됩니다.

예쁜꼬마선충은 외형적으로 인간과 상당히 다른 형태를 지니고 있지만 자세히 알아보면 반대로 인간과 유사한 점을 많이 지니고 있습니다. 

1. 유전자: 예쁜꼬마선충의 전체 유전자 염기서열은 이미 전부 밝혀져 있는 상태이고 인간의 유전자 수와 비슷한 약 19,000개의 유전자(gene)가 존재하며 인간 유전자의 약 60~80%가, 그리고 인간 질병과 관련된 유전자의 약 40%가 예쁜꼬마선충의 유전자에도 존재합니다.

2. 기관: 예쁜꼬마선충은 입, 인두, 신경계, 감각기관, 생식기관, 내장과 같은 인간에게도 존재하는 기관을 가지고 있습니다. 

3. 질병 연구: 예쁜꼬마선충은 인간과 유사한 유전자 및 기관을 가지고 있는 것을 기반으로 실제로 인간에게 적용할 수 있는 여러 가지 질병 연구에 사용됩니다. 예를 들면, 인간을 대상으로 실험을 할 수는 없지만 예쁜꼬마선충의 유전자를 변형하거나 파괴하여 그에 따른 개체의 변화를 보는 것은 가능하기에 예쁜꼬마선충은 인간 대체 실험 모델로 유용하게 사용됩니다. 현재 아래와 같은 많은 분야의 연구들이 진행되고 있습니다.

  - 에너지 대사 증후군 연구: 당뇨병, 비만 등

  - 암 연구: 폐암, 위암, 췌장암 등

  - 신경 변성 및 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative disease)연구: 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등

  - 유전병 연구: 근위축증 등

  - 노화연구

예쁜꼬마선충은 진핵 생물 생물학의 실험대상으로써 많은 고유한 이점을 가지고 있습니다.

1. 경제성 : 작은 크기(성체 몸길이 약 1mm), 용이한 배양조건(E. coli가 들어있는 한천 판에서 자라며 12~25℃ 범위의 온도에서 성장 가능), 장기 동결 보존이 가능함에 따라 유지 보수가 간단하고 이에 관한 비용이 낮습니다. 

2. 투명성 : 예쁜꼬마선충은 투명성이 있어 형광 단백질 리포터를 활용한 연구를 가능하게 합니다. 타겟 유전자에 형광유전자를 주입함으로써 타겟 유전자의 발현이 잘 되는지(형광이 강하게 발현됨) 아닌지의 여부를 쉽게 식별할 수 있습니다.

3. 빠른 생장 시간 : 예쁜꼬마선충이 성체가 되는 데 걸리는 시간은 약 3일입니다. 따라서 실험을 시작하기까지의 준비시간이 다른 실험체에 비해 적다는 장점이 있습니다. 

예쁜꼬마선충도 다른 모델생물에서 흔히 쓰는 qPCR과 같은 방법을 통해 유전자 발현 정도를 측정할 수 있습니다. 그러나 이보다 더 많이 쓰는 방법은 보고자 하는 유전자의 프로모터로 형광단백질을 발현하는 형질전환종을 제작하여 형광의 정도를 측정하여 유전자 발현을 보는 것입니다. 이 방법의 장점은 살아있는 선충에서 발현 양의 변화를 손쉽게 볼 수 있다는 것과 몸 속에 어느 특정 기관이나 세포에서 그 변화가 일어나는지도 볼 수 있는 것입니다. 심지어 해당 유전자에 형광단백질을 붙여 fusion protein을 발현하는 형질전환종을 만들면 살아있는 선충에서 단백질의 위치까지 파악할 수 있습니다.  워낙 형질전환종 제작이 용이하고 선충의 몸이 투명하기 때문에 가능한 방법들이기도 하고, 선충 크기가 워낙 작아 각각의 조직을 해부하기 어려운 단점을 보완하는 방법이기도 합니다. 

형질전환종은 직접 제작할 수도 있지만 많이 연구된 유전자의 경우 이미 제작된 것들도 있기 때문에 CGC에서 구입하거나 제작자에게 직접 연락하여 받을 수 있습니다. 이 외에 RNAseq(Next-Generation Sequencing)라던지 single cell RNAseq도 시도되고 있습니다.

선충도 강한 빛이나 진동을 감지할 수 있다는 보고는 있지만 우리가 생각하는 시각이나 청각이라고 하기는 어렵습니다. 따라서 선충은 주로 후각과 미각, 촉각 등을 사용하여 주변을 감지합니다. 이들 감각 작용에 대한 연구는 오랫동안 이루어져, 감각에 사용되는 수용체와 하위신호들이 꽤 연구가 된 편입니다. 먹이의 경우, 후각, 미각, 촉각 모두를 사용하여 감지할 수 있고 박테리아 주변의 공기중 이산화탄소나 산소 농도 또한 감지할 수 있어서 이러한 여러 정보를 종합하여 먹이를 찾게 됩니다. 

자연환경에서 선충이 맞닥뜨릴 수 있는 위험의 경우, 생존에 불리한 환경, 포식자, 해로운 병원성 박테리아 등의 경우를 들 수 있습니다. 먹이가 감소해서 굶게 되거나 주변 개체수가 많아지면 선충은 먹이 없이 몇 달 간 생존할 수 있는 ‘다우어’라는 발달 형태로 전환하게 됩니다. 이를 위해서는 체내 영양 상태를 판단할 수 있어야 하고 개체 수 증가의 경우 다른 선충에게서 발생하는 페로몬을 후각/미각을 통해 감지할 수 있어야 합니다. 포식자나 병원성 박테리아의 경우, 특정 냄새를 선천적으로 피한다는지 등의 선충의 방어기작이 있지만 이들을 냄새만으로 구분할 수 없는 경우도 많습니다. 오히려 때로는 박테리아나 곰팡이균이 선충이 좋아하는 냄새를 내뿜어 선충을 유인하기도 합니다. 이 경우에는 기억에 의존하여 다음 번에는 같은 위험을 피하도록 하는 방어 방법이 있습니다. 해로웠던 박테리아 등의 관한 감각적 자극을 해당 위험과 연관지어서 형성되는 연관 기억은 경험의 길이와 빈도에 따라 더 강하게 형성되고 오래 지속된다는 것이 여러 연구를 통해 보여진 바 있습니다. 
 

보통 선충은 한 세대에 알을 200-300개 낳기 때문에 이들이 자라면 배지에 있는 박테리아 먹이가 고갈됩니다. 배지에 있는 박테리아 양에 따라 다르겠지만 보통 고체 배지의 경우 한 세대 정도만 유지할 수 있습니다.  따라서 한 세대가 자라는 시간인 4-5일마다 몇 마리의 선충을 새 배지에 옮겨 strain을 유지합니다.

세포배양 실험의 경우, 흔히 약물이나 펩타이드 또는 호르몬을 첨가하여 변화를 보기도 하고, 쥐의 경우는 먹이거나 주사로 주입함으로써 이들 물질의 기능을 알아보기도 합니다. 예쁜꼬마선충의 경우, 고체배지나 액체배양액에 각종 약물을 첨가할 수 있고 이 방법으로 다양한 약물 스크린이 성공적으로 이루어진 사례가 많이 있습니다. 다만 예쁜꼬마선충은 몸이 큐티클 층으로 둘러싸여 있기 때문에 약물이 잘 침투하지 못하는 경우가 있습니다. 따라서 보통은 이 점을 감안하여 보통 세포배양 시 사용하는 농도보다는 더 높게 처리해야 효과가 나타납니다. 호르몬이나 펩티드의 경우 분자의 크기가 더 크기 때문에 이 경우는 거의 침투가 안된다고 보면 됩니다. 다만 큐티클 형성 변이종을 이용하여 낮은 효율이긴 하지만 성공적으로 펩티드를 침투시킨 사례가 있고, 펩티드 유전자를 갖고 있는 박테리아를 먹이로 줌으로써 그 박테리아를 먹은 선충의 몸 내부에서 펩티드를 만들어내게 한 사례 또한 있습니다. 
 

인간 남성의 성염색체 구성이 XY로 된 것과는 달리, 예쁜꼬마선충은 Y 염색체가 따로 없고 X 성염색체가 하나만 있을 때 (XO) 수컷(male)으로 발달합니다. 수컷이 나오는 방법은 수컷과의 교미를 통해 나오는 경우가 있고, 우연히 감수분열 과정에서 염색체 분리가 제대로 안됐을 때 가끔 나오기도 합니다 (0.2% 확률). 수컷이 필요할 때는 염색체 분리 이상의 빈도를 높일 수 있는 고온 처리(L4 유충을 30˚C에서 3-4시간 배양)를 통해서 일부러 수컷을 얻기도 합니다. 그러나 교배를 해야하거나 특별히 수컷을 따로 연구하는 것이 아니라면 배지에 수컷이 혼재하지 않는 것이 좋습니다. 수컷과 교미를 한 자웅동체(hermaphrodite)는 수명이 짧아진다는 등의 보고가 있기 때문에, 실험 결과에 의도치 않은 영향을 줄 수 있습니다. 배지에서 수컷을 없애는 가장 쉬운 방법은 아직 교미 가능한 전단계인 L3 이하의 자웅동체를 선별해서 키우는 것입니다.

[모델생물로서의 예쁜꼬마선충]

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)이 본격적으로 모델생물로 사용된 것은 시드니 브레너(Sydney Brenner)가 이를 유전학 연구에 이용하면서부터입니다. DNA의 이중 나선 구조가 밝혀진 후인 1950-60년대에는 DNA의 유전 정보가 어떻게 단백질로 해석되는지에 관한 연구가 활발히 진행되었는데, 시드니 브레너도 이에  큰 기여를 한 과학자였습니다. 

이후 그는 앞으로는 유전자가 단백질로 해석되는 것에서 더 나아가, 궁극적으로 동물의 형질에 어떻게 작용하는지를 연구해야한다는 생각을 갖고, 적절한 모델생물로 선충을 떠올리게 됩니다. 예쁜꼬마선충은 19세기 말부터 이미 여러 과학자들에 의해 형태나 생식 방법, 생애주기, 염색체의 수 등이 자세히 밝혀져 있었고 배양법도 정립이 된 상태였습니다. 이런 이유로 시드니 브레너는 예쁜꼬마선충의 변이종 연구를 통해 다양한 유전자의 기능을 밝힐 수 있을 것이라 판단을 했습니다 

[자연에서의 예쁜꼬마선충]

지금도 물론 자연에서 예쁜꼬마선충을 채집할 수 있습니다. 주로 온난한 기후에서 먹이가 되는 미생물이 많이 서식하는 썩은 과실이나 식물 등에서 발견이 되는데, 아쉽게도 한국에서는 관련종들은 많이 발견이 되었어도 예쁜꼬마선충은 발견된 사례가 없습니다. 유전체가 동일하게 유지되는 실험실 strain(N2)과는 달리, 자연종 예쁜꼬마선충은 유전체에 다양성을 갖고 있고, 발견되는 위치에 따라 이런 다양성이 더 두드러지기도 합니다. 
 

다양한 방법으로 같은 나이의 예쁜꼬마선충을 준비할 수 있습니다. 여기서는 크게 3가지 방법을 소개합니다. L1단계에서 나이를 맞추는 방법 2가지와 같은 시점에 낳은 알들로 준비하는 방법 1가지 입니다.
 

1) L1단계에서 나이를 맞추는 방법

 - 준비물: Bleach 용액 (0.5~1M NaOH, 1.6~3% NaClO (가정용표백제가 약 8% 지만 제품별로 확인)

 (1) 많은 선충을 얻는 방법 (2000 마리 이상)

   - NGM 배지 위에 있는 어른 선충들을 M9 용액을 이용하여 15ml 튜브나 50ml 튜브로 옮겨 닮는다. 

   - 원심분리기에서 1300g로 1분 돌려 선충들을 바닥에 가라 앉히고, 튜브 안의 용액을 Bleach 용액 5ml로 바꿔준다.

   - 1분마다 튜브를 휘저으며 선충들이 녹아 알이 빠져나오는 정도를 확인한다. 약 5분 정도면 대부분의 알이 몸에서 빠져 나온다.

   - 원심분리기에서 1300g로 1분 돌려 알들을 바닥에 가라 앉히고, 튜브 안의 용액을 M9 용액 10ml로 바꿔준다. 이 과정을 3번 반복한다.

   - 이 튜브를 쉐이커나 로터에 올려 알들을 지속적으로 섞이도록 하며 대부분의 알이 부화할 때까지 기다린다. 

   - 배양 온도에 따라 부화에 걸리는 시간이 달라지는데, 예를 들어 20°C에서는 20~24시간 정도 기다리게 된다. 

   - 나이가 같은 L1들을 동시에 OP50가 있는 NGM으로 옮겨 키우면 된다. 

 (2) 소수의 선충으로 충분할 때 (50 마리 정도)

   - OP50가 없는 NGM 배지에 Bleach 용액 2~10μl를 떨어뜨린다. 

   - 10마리 이상의 알을 밴 어른 선충들을 집어 Bleach 용액 속으로 넣어준다. 용액이 빨리 마르므로 서두른다.

   - 필요에 따라 배지의 다른 위치에 똑같은 과정을 반복하여 총 20마리 이상의 어른 선충들을 용해시킬 수도 있다.

   - 배양 온도에 따라 충분히 기다리면 알에서 부화한 L1들을 발견할 수 있고, 이들을 동시에 OP50가 있는 NGM으로 옮겨 키운다. 
 

2) 같은 시점에서 낳은 알로 나이를 맞추는 방법 (소수의 선충으로 충분할 때, 50마리 정도) 

 - OP50가 있는 NGM 배지에 20~30마리의 알을 밴 어른 선충들을 옮겨 놓고 30분간 알을 낳도록 한다.

 - 충분한 수의 알을 낳은 것을 확인하고 모든 어른 선충들을 제거한다. 원하는 배양 조건에서 계속 배양한다. 

 - 손이 많이 가지만 Bleach 용액을 쓰지 않고도 같은 나이의 선충들을 준비할 수 있다.