예쁜꼬마선충 연구자들은 연구 도중 개발한 strain들을 아래와 같은 데이터베이스에 등록하여 유실되지 않고 지속적으로 관리되도록 합니다. 그러므로, 데이터베이스 등록 건수를 확인하면 얼마나 많은 종류의 strain이 개발되었는지 확인할 수 있습니다. 단, 미등록된 strain도 있기 때문에 이보다 더 많은 수가 개발되었을 것입니다. 

1) Wormbase (https://wormbase.org): 총 51,562 종 (WS285기준, 2022년 3월 27일)

- strain 목록 다운로드: https://downloads.wormbase.org/releases/current-production-release/MULTI_SPECIES/ 내 strain_RRIDs.WS286.dat.gz 폴더

2) CGC (https://cgc.umn.edu): 총 23,759 종 (2022년 10월 11일자, 첫 등록은 1975년 10월 1일의 DR97)

- strain 목록 다운로드: https://cgc.umn.edu/static/cgc-strains.txt 

3) NBRP Japan (https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/): 총 13,149 종 (2022년 3월 5일자)

다음과 같은 방법으로 예쁜꼬마선충의 gDNA를 추출하고 (원하는 부분을) 증폭하여 염기서열 분석을 할 수 있습니다.   

1) 준비물: 10X PCR Buffer (100mM Tris, 500mM KCl, 20mM MgCl₂, pH 8.3), 1X PCR Buffer, Proteinase K (20mg/ml), PCR 튜브 

2) 순서

  (1) 1X PCR Buffer 95μl + Proteinase K 5μl 을 섞습니다.

  (2) PCR 튜브에 (1)을 5μl 넣습니다. (선충 여러마리로부터 추출할 경우, 10μl 를 넣습니다.)

  (3) 선충 한 마리 (또는 여러마리)를 (2)의 튜브에 넣고, 이 튜브를 원심분리기로 15초 정도 돌려 내용물이 밑으로 가라앉게 합니다.

  (4) 이 튜브를 액체질소로 최소 10분간 (혹은 -80°C 냉동고에 20분간) 냉각합니다. 이 단계에서 -80°C 냉동고에 보관해도 됩니다.

  (5) 선충의 용해 및 gDNA 추출: 이 튜브를 60~65°C로 60~90분간 가열합니다. 

  (6) 95°C로 15분간 가열하여 Proteinase K를 불활성화하고, 이 단계에서 -80°C 냉동고에 보관해도 됩니다.

  (7) 이 튜브에 있는 용액 중 5μl를 template으로 하여 PCR을 하면 됩니다. 

예쁜꼬마선충을 이용한 연구로 수여된 노벨상은 현재(2022년)까지 총 3번 입니다. 추가적으로 초세대 후성 유전 현상을 포함한 다양한 연구가 예쁜꼬마선충을 통해 진행되고 있습니다.

2002년 노벨 생리학ㆍ의학상은 3명의 예쁜꼬마선충 연구자인 시드니 브레너(Sydney Brenner, 1927~2019), 로버트 호비츠(H. Robert Horvitz, 1947~), 존 설스턴(John E. Sulston, 1942~2018) 박사에게 수여되었습니다. 이들은 예쁜꼬마선충을 생물학 모델동물로 제안하고 동물 발달에서의 유전적 조절과 프로그램된 세포사멸 현상 발견에 기여한 공로를 인정받았습니다. 해당 현상에 참여하는 유전자를 발견하고 세포사멸과의 상호작용 방식을 확인하였으며, 이후 이러한 현상이 인간에게도 존재한다는 것을 알게 되었습니다.

2006년 노벨 생리학ㆍ의학상 역시 2명의 예쁜꼬마선충 연구자에게 수여되었습니다. 앤드류 파이어(Andrew Z. Fire, 1959~)와 크레이그 멜로(Craig C. Mello, 1960~) 박사는 RNA 간섭(RNA Interference) 현상의 발견에 기여한 공로를 인정받아 노벨상을 수상하였습니다. RNA 간섭이란 이중 가닥의 RNA로부터 생성된 단일 가닥 RNA가 RISC복합체에 결합한 뒤, 해당 RNA 서열에 상보적인 mRNA를 절단, 분해하는 과정입니다. 자연계에서는 viral RNA 및 transposon(Genome 내에서 이동하는 서열)으로부터 전사된 RNA를 분해하는 것이 관찰되었습니다. 또한 mRNA를 분해하거나 단백질로의 번역을 억제할 수 있기 때문에, 유전자 발현을 조절할 수 있습니다. 이는 생물 의학 연구, 유전자 기술 및 건강 관리의 새로운 기회라 할 수 있습니다.

2008년 노벨 화학상은 GFP(Green Fluorescent Protein; 녹색 형광 단백질)의 발견 및 생물학 연구에 활용하는 방법을 개발한 공로로, 시모무라(下村 脩, 1928~2018), 첸(Roger Yonchien Tsien, 1952 ~2016), 챌피(Martin Chalfie, 1947~) 박사에게 수여되었습니다. 이중 예쁜꼬마선충 연구자인 마틴 챌피 박사는 예쁜꼬마선충을 활용해 생체의 신경세포를 GFP로 표지해서 살아있는 동물에서 관찰하는 방법을 개발한 공로를 인정받았습니다. 이후, DNA 재조합 기술을 사용하여 다양한 단백질에 GFP를 연결하여 특정 단백질의 세포내 움직임, 위치 및 상호 작용을 관찰할 수 있게 되었습니다.

이처럼 모델동물인 예쁜꼬마선충을 이용한 연구는 여러 차례 노벨상을 수상할 만큼 생명과학 연구에 커다란 기여를 하였고, 현재에도 신경과학, 후성유전학, 세포생물학, 독성학 등 다양한 분야의 연구에 많은 기여를 하고 있습니다. 한 예로, TEI(Transgenerational Epigenetic Inheritance; 세대 간 후성 유전)를 통한 정보 전달은 불가능하다고 오랫동안 생각되어 왔으나 예쁜꼬마선충 실험을 통해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P11)에 대한 회피 기억이 초세대적으로 전달될 수 있다는 새로운 사실을 발견했습니다. 예쁜꼬마선충을 비롯한 다양한 모델 동물을 활용한 기초과학 연구를 통해 새로운 개념, 지식, 기술 등이 발견되고, 이는 관련 질병이나 손상의 진단, 치료 및 예방 등에 임상적으로 적용될 수 있는 중요한 기반이 됩니다.

예쁜꼬마선충의 모든 strain과 allele에는 고유의 명칭이 있습니다. 선충의 strain 및 allele은 연구실 코드(Lab Code) 영문자 뒤에 숫자를 함께 붙여 명명합니다. 연구실 코드는 1개에서 최대 3개의 영문자로 이루어지며, 대개 연구 책임자의 이니셜 또는 해당 연구 기관, 도시의 이름을 축약한 글자입니다. 이때, 연구자의 임의대로 명명하게 되면 혼동이 생길 수 있으므로 연구실 코드는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에 신청하여 승인 받는 절차를 반드시 거쳐야 합니다. 연구실 코드는 CGC에서 조회해 볼 수 있습니다.
 

예를 들면, 예쁜꼬마선충을 모델동물로 사용하는 한림대 신경재생연구실에서의 strain 코드는 지도교수 이름 이니셜인 KWK로, allele 코드는  hallym university를 축약하여 hlu로 명명하였습니다. 따라서, 연구실에서 처음 만든 돌연변이 선충 allele은 ‘hlu1’이 되고, 이 allele을 가진 선충 strain의 이름은 ‘KWK1’로 명명되었습니다.
 

이밖에 외부 DNA를 발현시킨 형질전환선충(Transgenic Worm)은 외부 DNA가 염색체로 삽입(Chromosomal Integration)되는 경우와 삽입되지 않고 extrachromosomal array로 존재하는 2가지 경우가 생길 수 있는데, chromosomal integration은 ‘Is’로, extrachromosomal array는 ‘Ex’로 표기합니다. 따라서, hluIs1, hluEx1 과 같이 연구실 allele 코드명 뒤에 Is1 혹은 Ex1 등을 덧붙여 표기할 수 있습니다. 또한, 외부 DNA 삽입이 한 카피만 일어난 경우에는 Is allele과 구분해서 Single-copy integration (Si)로 표기합니다. 즉, hluSi1 과 같이 쓸 수 있습니다. 이처럼 예쁜꼬마선충의 allele 이나 strain 이름은 매우 체계화되어 있어 편리하게 선충 자원(resource)을 관리할 수 있습니다.
 

실험에 필요한 예쁜꼬마선충의 strain은 Caenorhabditis Genetics Center (CGC), National BioResource Project (NBRP), 그리고 예쁜꼬마선충 커뮤니티의 개인 연구실로부터 공유받을 수 있습니다. 

CGC는 선충의 genetic stock을 수집, 유지 및 보관하는 기관이고, 미국 미네소타 대학교 내에 있습니다. CGC에서는 선충 strain과 관련 정보를 교육 기관 또는 비영리 단체의 연구원에게 제공하고 있기 때문에, 연구자들은 연구에 유용한 선충 strain을 위탁하여 보관하거나, 필요한 선충 strain을 요청하여 분양 받을 수 있습니다. 

NBRP는 일본 의료 연구 개발 기관의 프로젝트로 선충 연구자들이 이용할 수 있도록 선충 생물자원을 수집하여 선충을 이용한 연구를 촉진하는 것을 목표로 합니다. NBRP도 CGC와 마찬가지로 선충의 유전 정보와 여러 돌연변이 선충을 저장하고, 연구자에게 제공하고 있습니다. 

다만, CGC나 NBRP에서 보유하고 있지 않는 선충 strain인 경우, 해당 연구실에 직접 요청하여 분양 받을 수도 있습니다. 

선충을 키우는 배지는 크기가 작아 이동이 편리하고 영양분이 없을 때 다우어(dauer)의 형태로 장기간 생존이 가능하며, 상온의 온도에서도 생존할 수 있기 때문에 요청한 선충은 국제 및 국내 배송을 통해 쉽게 분양 받을 수 있습니다. 
 

연구실에서 사용되는 예쁜꼬마선충의 야생형(Wild Isolate)은 N2 strain이고, 영국의 브리스톨(Bristol) 근교에서 채집되었습니다. 선충 연구실에서는 주로 이 야생형 N2를 기반으로 하여 돌연변이체를 만듭니다. 예쁜꼬마선충의 돌연변이체는 다른 모델생물처럼 유전자 변형을 통해 만들 수 있기 때문에 종류가 매우 다양합니다. 예를 들어, N2보다 수명이 2배 이상 긴 돌연변이체는 대사 관련 유전자인 daf-2의 일부 서열에 돌연변이가 일어나 형성됩니다. 형광 단백질이 발현되는 돌연변이체는 형광 단백질을 암호화하는 외부 유전자를 삽입시켜 만들고 형질전환체(Transgenic Animal)이라고 부릅니다.

예쁜꼬마선충의 돌연변이체는 다음과 같은 방식을 통해 만들 수 있습니다.

과거에는 무작위적인 변이, 주로 100bp 이상의 긴 결손(Deletion)을 일으킨 후에 원하는 유전자의 돌연변이체를 찾아가는 방식(Genome-Wide or Target-Selected Mutagenesis)을 주로 사용하였고, 기존에 존재하지 않는 새로운 돌연변이체나 특정한 돌연변이를 필요로 하는 경우에 Gene-Targeted Mutagenesis 방식도 다수 사용하고 있습니다. 특히 크리스퍼(CRISPR) 기술의 발전 이후에는 특정 유전자의 돌연변이 제작이 훨씬 용이해짐에 따라 Gene-Targeted Mutagenesis 방식도 널리 사용되는 추세입니다.

필요로 하는 돌연변이체는 다음과 같은 사이트를 통해 확인할 수 있습니다.

1) 예쁜꼬마선충은 액체 배지에서도 배양이 가능합니다. 다량의 예쁜꼬마선충 샘플이 필요한 경우 등에 액체 배양법을 사용합니다.

2) 예쁜꼬마선충의 대표적인 액체 배지로 S-medium이 있습니다. 이 배지에 선충의 먹이인 대장균(E. coli OP50)을 넣어주어 선충을 배양합니다. 적절한 배양 환경을 위해 20℃ 배양기를 사용하며, 추가적으로 산소가 공급될 수 있도록 쉐이커(Shaker)를 이용하면 좋습니다. 더 자세한 배양 방법이 궁금하다면, WormBook에 출간된 ‘Maintenance of C. elegans’를 참고하면 좋습니다.

3) 액체 배지에서 배양할 경우, 고체 배지에서 배양한 개체보다 몸이 가늘고 길며 알을 품는 경향이 있습니다.
 

세균이나 곰팡이 등으로 배지가 오염되었을 때는 새로운 배지에 옮기거나 Bleaching 방법을 사용하여 제거할 수 있습니다. 대부분의 오염 물질은 선충을 해치지 않지만, 배지가 깨끗할 때 실험을 하기 용이합니다. 
 

1) 새로운 배지에 옮기는 방법

  - 준비물: NGM 배지

  - 과정

    (1) NGM 배지의 일부를 잘라내어 새 배지에 올립니다. 

    (2)선충이 기어 나오면 또 다른 새 배지에 옮깁니다. 

    (3) (1)-(2) 과정을 반복합니다.

2) Bleaching 방법

  - 준비물: 5% Sodium hypochlorite (NaClO) 1ml, 5M NaOH 0.5ml, 물 3.5ml

  - 과정

    (1) 5% Sodium hypochlorite (NaClO) 1ml, 5M NaOH 0.5ml, 물 3.5ml 를 섞은 표백 용액을 만듭니다. 

    (2) 오염된 배지의 선충을 튜브에 모아 표백 용액을 넣고 4분에서 최대 6분 동안 vortexing 하면 선충의 알(embryo)만 남게 됩니다. 

    (3) 4번 이상 물로 헹군 뒤 알을 새로운 배지에 옮깁니다.
 

예쁜꼬마선충은 액체 질소 (-196°C) 및 deep freezer (-80°C)에서 오랜 기간 저장이 가능합니다. 예쁜꼬마선충의 ice-binding proteins (IBPs) 등이 저온 충격(cold shock) 및 동결 시 생존율을 향상시키는 데에 도움을 주기 때문입니다. 저온 동결 방법에는 크게 Liquid Freezing Solution과 Soft Agar Freezing Solution을 이용한 방법이 있습니다.

1) Liquid Freezing Solution을 이용한 동결 및 해동

  - 준비물: S buffer (129ml 0.05M K₂HPO₄, 871ml 0.05M KH₂PO₄, 5.85g NaCl), 글리세린

  - 과정:

    (1) S buffer와 30%의 글리세린을 넣은 튜브 바이알에 L1-2단계가 다량 포함된 굶은 선충을 함께 넣고 -80°C에서 동결합니다. 

    (2) 해동 시에는 액체가 될 때까지 실온에서 녹인 후 NGM 배지로 옮겨 배양합니다.

2) Soft Agar Freezing Solution을 이용한 동결 및 해동

  -  준비물: S buffer (129ml 0.05M K₂HPO₄, 871ml 0.05M KH₂PO₄, 5.85g NaCl), Soft Agar Freezing Solution (0.58g NaCl, 0.68g K₂HPO₄, 30g 글리세롤, 0.56ml 1M NaOH, 0.4g 한천, H₂O up to 100ml)

  - 과정:

    (1) S buffer 와 Soft Agar Freezing Solution을 1:1로 섞은 용액에 L1-2단계가 다량 포함된 굶은 선충을 넣고 -80°C에서 동결합니다. 

    (2) 해동 시에는 얼린 용액의 일부를 조각 내어 NGM 배지로 옮겨 배양합니다. 

같은 C57BL/6가 맞습니다. 같은 계통이라고 하더라도 hair cycle에 따라 피부 색이 다르게 관찰될 수 있습니다. 모발 성장 주기(Hair Cycle)는 보통 모낭의 성장기인 Anagen, 퇴행기인 Catagen, 휴지기인 Telogen으로 구분되는데 피부색소는 모구(Hair Bulb)에서 모낭(Hair Follicle)이 모섬유(Hair Fiber)로 변화될때 활발하게 생산됩니다. 색소 침착은 성장기(Anagen)의 중반에서 후반에 가장 많이 진행되며, 휴지기(Telogen)에는 생산되지 않습니다. 또한, 노화나 외상에 의해서도 색소가 모낭에서 빠져나와 대식세포(Macrophage)에게 포식되기도 하는데 이러한 작용들로 인해 피부색깔이 약간씩 변할 수 있습니다. 

* 그림출처: 가톨릭대학교 의생명산업연구원 실험동물연구센터

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