초파리의 눈 색은 white(w), brown(bw), 그리고 scarlet(st) 유전자들에 발현이 조절되는 ATP-binding cassette 수송 단백질(ABC-transporter)에 의해 눈의 안료 과립(pigment granules) 에 전달되는 트립토판에서 합성되는 옴모크롬(ommochrome) 피그먼트 (pigment)의 양과 구아닌(guanine)에서 합성되는 프테리딘(pteridine) 피그먼트의 양에 따라 결정됩니다.

w 돌연변이는 1910년도 Morgan에 의해 가장 처음으로 밝혀진 돌연변이 형으로 X연관돌연변이(X-linked mutation)으로 알려져 있습니다.  형질 전환 초파리(transgenic fly)를 제작할 때, 마이크로인젝션(microinjection)을 통해 재조합된 유전자(transgene)가 w 돌연변이 배아(w mutant embryos)에 주입됩니다. 제작되는 형질전환 파리들은 선택 마커(selection marker)로 white(w) 유전자를 가지고 있습니다.  그래서 특정한 유전자를 가지는 초파리와 w 돌연변이 초파리를 교배시켜서 다음 세대 파리를 고르는데 마커로 활용합니다. 그래서 실험 대조군으로 w 유전자 돌연변이 초파리를 대조군으로 사용합니다. 흰 눈 초파리 외에도 Canton S, Oregon R 그리고 Berlin K 와 같은 파리가 실험 대조군으로 사용됩니다. 
 

1. Bloomington Drosophila Stock Center (https://bdsc.indiana.edu/)

  - 다양한 그룹의 형질전환체 파리를 보유한 스톡 센터.

  - 유전학 tool들도 함께 존재하고 있음.

  - 제작 외에 개별로 제작된 형질전환체를 기부 받음.
 

2. Vienna Drosophila Resource Center (https://stockcenter.vdrc.at/control/main)

  - Transgenic RNAi 스톡을 보유하고 있음.

  - RNAi 시퀀스 정보를 보유하고 있으며 off-target 정보도 함께 공유되어 있음.

3. KYOTO Stock Center (https://kyotofly.kit.jp/cgi-bin/stocks/index.cgi)

4.  DRSC/TRiP Functional Genomics Resources & DRSC-BTRR [Harvard medical school] (https://fgr.hms.harvard.edu/trip-rnai-fly-stocks)

  - 형질 전환 파리를 보유할 뿐 아니라 다양한 연구 리소스를 함께 제공함.

  - Transgenic RNAi Project (TRiP) / Drosophila RNAi Screening Center (DRSC)를 기반으로 형질전환체 파리 스톡을 보유함.

[주문방법]

1) 각 홈페이지에 가입을 하고 원하는 스톡 넘버를 담습니다. 

2) 스톡이 도착하였을 경우, 먼저 안정화를 위해 스톡을 상온(RT, 25℃)에서 1주일 정도 보관합니다. 

3) 각각의 라인별로 새 바이알(vial)에 옮겨주고 복사본을 만들어서 보관합니다.

4) 혹시 모를 mite, bacteria, virus 감염 등을 예방하기 위해서 2-3회 바이알을 옮겨주고 스톡으로 보관합니다. 

초파리는 사람과 마찬가지로 두 번의 혈구 생성과정을 거쳐서 혈구 세포를 구성합니다.  배아 혈구세포(Embryonic Hemocytes)와 유충 혈구세포(Larval Derived Hemocytes-Lymph Gland)는 각각 머리 중배엽(Head Mesoderm)과 흉중배엽(Thoracic Mesoderm)에서 위치하여 발생 시기에 형성됩니다. 발생 단계별로 발현되는 마커 유전자를 통해 혈구 세포의 종류를 구분할 수 있으며 대표적으로 플라즈마 세포(Plasmatocytes), 크리스탈 세포(Crystal Cells) 그리고 판상세포(Lamellocytes)로 분류 할 수 있습니다. (그림 1.)

그림 1. 

초파리의 혈액의 채취 방법은 먼저 멸균된 PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼에 놓여진 유충의 표피 일부를 절제합니다. 흘러나온 혈림프액(Hemolymph)을 PBS에 희석합니다. 그리고 피펫으로 추출된 혈액(Hemocytes)을 에피 튜브(Epi-Tube)에 담아 시료로 활용합니다. 초파리의 유충 조혈기관(Larval Derived Hemocytes-Lymph Gland)은 포셉으로 주변 조직을 분해하여 제거 후 동일하게 에피 튜브에 담아 이후 실험에 사용하게 됩니다.

그림 2. 

그림 3. 

초파리의 경우 존스톤기관(Johnston’s Organ)이라는 곳에서 100-300Hz에 이르는 영역의 소리를 들을 수 있다고 알려져 있습니다. 존스톤기관은 초파리의 더듬이에 존재하며 소리에 의해 더듬이의 진동이 발생할 경우 더듬이에 있는 섬모에서 소리를 감지합니다. 조금 더 자세히 알아보면, 더듬이의 섬모에서는 소리에 의해 NOMPC 라고 하는 TRPN1 단백질이 활성화 되고 이 활성신호는 Nan과 Iav라 불리는 TRPV 단백질의 이형 접합체에 의해 증폭됩니다. 이렇게 증폭된 소리 신호는 결국 뇌로 전달되고 이에 따라 초파리의 행동이 변화한다고 알려졌습니다¹. 

초파리에게 소리를 듣는다는 것은 구애 활동에 있어 특히나 중요한 감각입니다. 교미를 하기위해 수컷 초파리는 암컷 초파리에게 날개를 흔들어 소리를 내어 구애를 하는데 이에 암컷 초파리가 수컷 초파리의 날개소리에 반응하여 수컷 초파리와 교미를 할지 결정을 하는데 영향을 준다고 합니다. 또한 재밌는 사실은 사람의 목소리가 100~250Hz이기 때문에² 초파리는 사람의 목소리를 잘 감지할 수 있다고 합니다. 

초파리 애벌레는 성충판이라고 하는 기관이 존재합니다. 이는 애벌레가 성충이 되기 위해 번데기 시기를 거치는 동안 성충의 다리, 날개, 입 등이 되는 기관이며 성충의 생식기관이 될 부분 역시 애벌레 시기에 성충판으로 존재합니다. 수컷 애벌레의 경우, 암컷 애벌레의 생식기관 성충판에 비해 크기가 큽니다. 특히 생식기관 성충판은 지방체(Fat Body)라고 불리는 사람의 간과 유사한 기관에 감싸져서 존재하는데 3령이 된 수컷 애벌레를 관찰하면 지방체 사이로 수컷 생식기관의 성충판이 몸의 좌우로 크게 존재합니다. 하지만 암컷 애벌레의 경우 그 크기가 작아 성충판이 잘 보이지 않습니다. 따라서 초파리 애벌레에서 큰 생식기관 성충판을 가지고 있으면 수컷, 작은 생식기관 성충판을 가지고 있으면 암컷으로 구분해 낼 수 있습니다. 

*그림출처: 조범식
 

초파리의 경우에도 사람과 비슷하게 면역을 담당하는 세포가 있습니다. 크게 세포성 면역과 체액성 면역으로 나뉘는데 세포성 면역이란 면역을 담당하는 세포가 존재하여 외부로부터 세균이나 바이러스, 곰팡이와 같은 물질이 들어올 경우 이를 직접 제거하는 것을 의미합니다.

세포성 면역을 담당하는 세포로서는 플라즈마 세포 (Plasmatocyte), 크리스탈 세포 (Crystal Cell), 라멜로사이트 (Lamellocyte)가 알려져 있습니다. 특히 플라즈마 세포는 전체 혈구세포의 95%를 차지하며 사람의 대식세포와 유사하게 식균작용을 한다고 알려졌습니다. 크리스탈 세포는 세포 안에 크리스탈 구조를 가지고 있어 이름 지어졌으며 사람의 혈소판과 같이 상처가 난 부위에 멜라닌화 (Melanization)을 시켜 외부로부터 침입한 균을 죽이고 상처부위를 회복하는데 도움을 줍니다. 라멜로사이트는 평상시에는 거의 보이지 않지만 애벌레가 스트레스 환경에 처하거나 기생 말벌이 초파리 애벌레를 공격하여 몸속에 알을 낳아 면역이 활성화 되었을 때에만 생성되는 세포입니다. 라멜로사이트는 주로 기생 말벌의 알에 대해 알을 둘러싸서 공격을 하는 캡슐화 (Encapsulation) 작용과 크리스탈 세포와 같은 멜라닌화 작용을 통해 기생 말벌의 알을 공격하여 알이 부화하지 못하게 합니다.  

체액성 면역이란 세포를 통해서 직접 외부로부터 침입한 균을 제거하는 것이 아니라 위에서 언급한 혈구세포 및 지방체 (Fat body) 세포에서 만들어진 항균단백질이 혈장 내로 분비되어 균의 기능을 방해하는 것을 의미합니다¹. 

* 그림출처: 조범식

초파리의 경우 사람과 달리 폐라는 기관이 존재하지 않습니다. 대신, 초파리는 숨관 (Trachea)라는 기관을 가지고 있으며 이를 통해 숨을 쉽니다. 이는 사람으로 따지면 입으로부터 폐로 이어지는 기관지라고 불리는 기관과 유사합니다¹. 사람의 기관지처럼 초파리의 숨관은 외부의 공기를 내부로 들여보내는 통로이며 숨관은 초파리의 온 몸 구석구석까지 뻗어 있기 때문에 몸속 깊숙한 곳까지 공기를 전달할 수 있습니다. 

또한 사람의 경우 폐를 움직이기 위해서는 그 주변의 근육들이 함께 움직여 주어야 하듯, 초파리나 초파리 애벌레의 경우 몸의 움직임을 통하여 숨관이 움직이며 이에 따라 공기가 전달이 된다고 알려져 있습니다². 

* 그림출처: 조범식

곤충에서의 사회성이라 하는 것은 크게 두 가지로 나누어 집니다. 진사회성 곤충 (Eusocial insect)와 독거성 곤충 (Solitary insect)입니다. 진사회성 곤충은 주로 여왕이 있는 개미나 벌에서 관찰이 되며 이들은 분류학 상으로 벌목 (Hymenopteran)에 해당합니다. 이 외에도 바퀴목 (Blattodea), 흰개미목 (Isoptera), 총채벌레목 (Thysanoptera), 노린재목 (Hemiptera), 딱정벌레목 (Coleoptera)가 진사회성을 갖는다고 알려졌고, 해당 곤충들은 표피탄화수소 (Cuticular hydrocarbons) 이라는 페로몬 물질이 암컷 특이적으로 분비되어 사회성이 생긴다고 알려져 있습니다. 하지만, 초파리의 경우에는 파리목 (Diptera)에 속하는 곤충으로써 지금까지 연구된 결과 이들은 독거성 곤충으로 알려져 있습니다¹. 따라서 초파리의 경우에는 사회성이 존재하지 않고, 서열도 존재하지 않는다고 알려져 있습니다.

하지만 최근 연구에 따르면 진사회성 이외에도 아사회성(Subsocial),  공동사회성(Communal) 등의 사회성이 곤충에서 발견되었고¹, 나아가 초파리에서도 시각정보와 후각정보에 의해 조절되는 뇌의 활동이 다른 초파리와 상호작용에 영향을 준다는 사실이 밝혀졌습니다². 따라서 초파리 사회에서도 서열이 있는지는 앞으로 연구가 더 필요합니다.

제노프스에서 유전자의 발현을 확인하는 방법은 여러가지가 있지만 대표적으로 다음 두 가지 방법이 많이 사용됩니다. 유전자가 어떤 조직에서 발현하는지 확인하는 방법인 in-situ hybridization assay^{1, 2}와 발생학적 stage에서 확인하는 방법인 RT-PCR입니다. 

[In-Situ Hybridization]

- 확인하고자 하는 유전자의 RNA 염기서열에 binding 하는 RNA probe를 사용하여 유전자의 발현을 확인하는 방법

- 주로 조직 발현을 확인하기 위해 사용하나, 시그널의 세기를 통해 정량적 분석도 가능함

*그림출처: Whole-Mount and Section In Situ Hybridization in Mouse Embryos for Detecting mRNA Expression and Localization. Methods Mol Biol. 2018;1752:123-131.

[RT(Reverse Transcriptase)-PCR]

- 발생 stage별로 추출한 RNA를 사용하여 어떤 stage에서 확인하고자 하는 유전자가 발현하는지 확인하는 방법

*그림출처: https://www.facebook.com/everythingaboutBiotech/photos/a.2035926766637950/2825927254304560/?type=3

In situ hybridization 의 경우 실험 단계가 복잡하지만 유전자 발현 정도와 함께 발생 단계의 조직/세포 특이적 발현을 확인할 수 있는 장점이 있고, RT-PCR 의 경우 실험 방법이 간단하지만 전체 배아에서 유전자의 발현 정도만 확인할 수 있는 단점이 있습니다. 단백질 수준에서 유전자 발현을 확인하고자 할 때에는 다른 모델 동물과 유사하게 western blot 또는 immunostaining 방법을 사용할 수 있습니다. 

XenBase 데이터베이스에서는 다양한 in situ hybridization 방법과 genome-wide transcriptome 정보를 통합하여 발생 단계 및 성체 장기에서 각 유전자의 발현 정도를 확인할 수 있는 정보를 제공하고 있습니다³.

제노프스는 원래 1930년대 임신 진단을 위해 사용되었습니다. 임신한 여성의 소변에 존재하는 chorionic gonadotropin이라는 호르몬이 제노프스에 작용하여 알을 낳을 수 있도록 했기 때문입니다. 손쉽게 많은 양의 배아를 얻을 수 있고 인간 호르몬이 작용하는 것처럼 인간과 유사성이 높아 과학자들은 제노프스를 실험 동물 모델로 사용하게 되었습니다¹. 제노프스는 실험 동물 모델로서 다음과 같은 많은 장점이 있습니다².

1) Chorionic gonadotropin 주사를 통해 필요할 때 배아를 얻을 수 있다.

2) 체외수정을 통해 stage control이 가능하다.

3) 난자의 크기가 다른 모델동물과 비교하여 매우 크기 때문에 manipulation이 쉽다.

4) Cell fatemap을 통해 특정 조직에서 유전자 발현의 조절이 가능하다.

5) 발생 속도가 빨라 수정 후 일주일 내에 대부분의 장기를 관찰할 수 있다.

6) 한번에 몇 천 마리의 배아를 얻을 수 있어 대량분석이 가능하다.

또한 CRISPR/Cas9 기술의 발전과 함께 다양한 질병 동물 모델을 만들 수 있게 되었습니다. 유전적 변이 뿐만 아니라 인간 질병 연관 변이를 포함하는 유전자의 기능에 대해서도 빠르게 그 기능을 확인할 수 있는 장점으로 바이오메디컬 연구에 다양하게 활용이 되고 있습니다. 커뮤니티에서 정기적으로 작성하고 있는 백서(white paper)³에는 최근 질병 관련 제노프스 연구 결과를 정리되어 있습니다.