Submental Blood Collection(이하정맥채혈)은 Submandibular Blood Collection(아래턱밑정맥 채혈)보다 습득이 쉽고 채혈 후 임상증상(경련, 얕은 호흡, 활동감소, 탈수 등) 발생가능성이 적다고 알려진 채혈법입니다. 

채혈은 하루간격으로 한쪽 혈관씩 번갈아서 시도가 가능하며, submandibular 또는 retroorbital blood collection(안와정맥채혈)보다는 얻을 수 있는 양이 적지만 보통 100~200μl를 쉽게 얻을 수 있습니다. 단, 전체 체중의 10%(25g 마우스 기준, 약 150μl)를 채혈한 경우 최소 2주 이상의 회복기간을 주어야 합니다.

시야확보를 위해 턱밑 털을 밀고 채혈해야 할 수 있으며 마취가 필요할 수 있습니다. 마취여부에 대한 내용은 자료마다 의견이 다양합니다. 다만, 채취하려는 목표량이 최대 용량에 근접하거나 마우스가 매우 작을 경우 단기 흡입 마취를 권장합니다. 이는 추출되는 혈액의 양을 잘 조절하기 위함이며 의식이 있는 동물보다 출혈을 더 잘 멈추게 하여 불필요하게 손실되는 혈액량을 줄일 수 있게 도와줍니다.

[방법]

1. 채혈 전 마우스의 전반적인 건강 상태를 확인하고 마취를 진행합니다.
2. 어깨와 귀 뒤쪽의 피부를 잡아 합니다. 피부는 턱 아래에서 팽팽하게 당겨져야 하지만 호흡이 제한되면  안됩니다.
3. 채혈 위치를 확인합니다. (그림 1 참조)
  - 위치: 턱 아래 털이 도는 지점(fur whorl landmark)에서 양쪽 바깥쪽 위로 약 5mm 떨어진 지점
4. 마우스 기준으로 3~5mm lancet을 이용하여 혈관을 찌르면 혈액이 바로 나오며 이를 튜브에 받습니다.
5. 일반적으로 마우스를 놓으면 머리 위치가 정상으로 돌아오며 자동으로 멈추지만, 필요한 경우 멸균거즈를 이용해서 압박 지혈을 합니다.
6. 케이지에 마우스를 넣고 마취에서 완전히 회복되는지 확인합니다.

* 그림 1-3 출처: University Animal Care Committee Standard Operating Procedure: SOP 7.10.2 - Submental Blood Collection in Mice. 2012.

* 그림 4 출처: Constantinescu GM, Duffee NE. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2017;56(6):711-712.

[방법]

안면정맥 채혈은 성체 랫드에게만 적용할 수 있습니다. 마취가 반드시 필요한 것은 아니지만, 머리를 잘 보정하는 것이 중요합니다.

1. 20G 바늘로 안면정맥을 찔러서 출혈을 유도합니다. 
2. 찌른 즉시 출혈이 발생하며 다른 튜브로 혈액을 모읍니다. 랫드에서 안면정맥으로 확보할 수 있는 최대 채혈량은 0.4~0.5ml 입니다.
3. 출혈이 지속되는 경우 약 30초 동안 티슈나 거즈로 압박하여 지혈합니다. 
4. 출혈이 완전히 멈추고 마취를 한 경우 마취에서 완전히 회복되면 사육 케이지로 돌려보냅니다. 

[방법]

안면정맥 채혈은 성체 마우스에게만 적용할 수 있습니다. 마취가 반드시 필요한 것은 아니지만 머리를 잘 보정하는 것이 중요합니다.  

1. 그림 1과 같이 엄지와 검지로 목부위 피부를 집고, 채혈하려는 뺨과 반대쪽에 세번째 손가락을 대어 머리를 돌리지 않도록 보정합니다.  또는 그림 3와 같이 채혈하려는 뺨과 반대쪽 빰을 바닥에 두어 보정할 수 있습니다. 
2. 주사바늘 또는 란셋을 삽입하는 부위(Puncture Site)는 그림 2과 같이 설치류에서 발견되는 털 소용돌이(Whorl)의 위쪽으로 그림 3와 같이 아래턱뼈 바닥에서 귀의 꼬리 부분까지와 눈의 꼭대기에서 어깨 지점까지 직선을 그렸을 때, 이 두 선이 교차하는 곳으로 정할 수 있습니다. 
3. 란셋을 피부 표면에 수직(90°)로 2-3mm 깊이까지 빠르게 1초 미만으로 찔러 넣습니다. 란셋 크기는 표 1을 참고하여 선택합니다. 
4. 찌른 즉시 출혈이 발생하며 다른 튜브 또는 피펫으로 혈액을 모읍니다. 
5. 출혈은 15초 이내 멈춰야 하며, 출혈이 지속되는 경우 20~30초 동안 티슈나 거즈로 압박하여 지혈합니다. 
6. 출혈이 완전히 멈추고 마취를 한 경우 마취에서 완전히 회복되면 사육 케이지로 돌려보냅니다. 
7. 한 쪽당 최대 2회까지 시도할 수 있으며 채혈량과 회복기간은 표 2와 같이 연령과 체중에 따라 결정합니다. 

그림 1. 안면정맥 채혈을 위한 보정

그림 2. 안면정맥 채혈 지점 찾기 1

그림 3. 안면정맥 채혈 지점 찾기 2

* 그림 1, 2 출처: Standard Operating Procedure: LAB_020 Blood Collection – Facial Bleed (Sub-Mandibular) in Mice. 2020.  

* 그림 3 출처: IACUC Standard Procedure: Submandibular Blood Collection in Mice. 2016.

표 1. 란셋 크기 선택 기준

표 2. 마우스 체중에 따른 채혈량

* 표 1, 2 출처: UQ Animal Ethics Committee - Standard Operating Procedure: LAB_020 Blood Collection – Facial Bleed (Sub-Mandibular) in Mice. 2020.

랫드에서 경정맥 채혈은 단회 실시 가능합니다. (반복 채혈 방법 아님) 

경정맥 채혈은 한 번 실시할 때 0.1~2ml 정도의 혈액을 채취하는 데 적합하며, 고품질의 혈액 채취가 가능합니다. 고도의 숙련도가 필요합니다. 주로 2명이 작업(1명: 보정 및 동물모니터링, 1명: 채혈)하며, 1명이 하는 경우 높은 수준의 기술이 필요합니다. 필요시 전신 마취 후 실시합니다.

- 재료: 23G-30G needle 및 멸균주사기(1ml), 면도기, 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브), 마취제(필요시) 등

[방법]

1. 모든 동물은 새로운 멸균 needle/채혈침이 필요합니다.
2. 랫드를 필요시 마취합니다.
3. 경정맥은 어깨뼈와 목의 쇄골 바로 위 두개골 중간에 위치합니다.
4. 맥박이 있는지 촉진합니다. 맥박이 느껴지지 않으면 경정맥은 흉골과 어깨 사이의 중간 지점에 위치합니다. 더 잘 볼 수 있도록 해당 부위를 면도하고 알코올을 바릅니다.
5. 1ml 주사기와 바늘을 사용하여 바늘을 피부에 90°로 삽입하고 바늘의 중심부에 피가 있는지 확인합니다. 플런저를 천천히 뒤로 당겨 샘플을 채취합니다.
6. 지혈이 될 때까지 거즈로 압력을 가합니다.

[마우스 복재정맥 채혈]

마우스에서 총 혈액량, 단회 채혈량은 아래 표와 같으며 채혈 시 안전한 지침은 단회 채혈 또는 2주 동안 여러 번 채혈 시 가능한 채혈량이 체중의 1%입니다. 예를 들어, 체중이 20g인 마우스는 단회 채혈에서 0.2ml의 혈액을 채혈하거나 2주 동안 여러 번의 채혈을 통해 총 0.2ml의 혈액을 채혈할 수 있습니다. 단일 샘플의 경우 최대 0.2ml이며, 일반적으로 혈액학적 상태에 지장을 주지 않는 범위 내에서 2주 간격으로 반복할 수 있습니다. 또는 검체량 제한을 고려하여 소량의 검체를 여러 번(예: 매일 0.01ml) 채취할 수 있습니다.

- 재료: 27G 혹은 25Gneedle 혹은 채혈침, 면도기, 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브) 등
- 동물을 부드럽게 다루면서  실험 과정에 대한 적응과 훈련을 시행하면 연구 중 스트레스 관련 행동을 감소시키며, 이는 연구 시작 전 몇 번의 짧은 교육 세션으로 달성할 수 있습니다.
- 참고 동영상 1 (훈련된 마우스): https://www.youtube.com/watch?v=q1NcleX9eiI
- 참고 동영상 2 (훈련되지 않은 마우스): https://youtu.be/Si34jfiso9k?si=p1DDxCoLWya0Schs 

[방법]

1. 모든 동물은 새로운 멸균 needle/채혈침이 필요합니다.
2. 뒷다리가 자유로운 상태로 마우스를 보정틀에 넣습니다. 
3. 면도기로 채혈 부위의 털을 제거합니다.
4. 알코올 스왑으로 채혈 부위를 소독합니다.
5. 채취부위에 바세린을 바르는 경우 혈액 방울이 크게 형성되는데 도움이 됩니다. (선택사항)
6. 허벅지와 꼬리 사이의 피부를 당깁니다. 복재정맥은 허벅지의 뒤쪽 표면에 위치합니다.
7. 허벅지 무릎 위에 압력을 가하고 25G needle이나 채혈침으로 정맥을 45° 각도로 찔러 채혈합니다. 
8. 채혈 용기에 혈액을 수집합니다.
9. 지혈이 될 때까지 거즈로 압력을 가합니다.

그림 1. 마우스 복재정맥

[랫드 미정맥 채혈]

랫드에서 총 혈액량, 단회 채혈량은 아래 표와 같으며, 채혈 시 안전한 지침은 단회 채혈 또는 2주 동안 여러 번 채혈 시 가능한 채혈량이 체중의 1%입니다. 예를 들어, 체중이 300g인 마우스는 단회 채혈에서 3.0ml의 혈액을 채혈하거나 2주 동안 여러 번의 채혈을 통해 총 3.0ml의 혈액을 채혈할 수 있습니다. 미정맥 채혈은 한 번 실시할 때 0.1~2ml 정도의 혈액을 채취하는데 적합합니다.

- 재료: 21-23G needle 혹은 butterfly needle 또는 채혈침, heating lamp 또는 따뜻한 물, 보정틀(혹은 마취), 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브) 등
- 혈액 샘플을 얻기 위해 메스로 꼬리를 자르는 것은 오래된 접근 방식으로 사용해서는 안 됩니다.
- 참고동영상: NC3Rs. Blood sampling: Rat. 

[방법]

1. 채혈 시 모든 동물은 각각 새로운 멸균 needle/채혈침을 사용하여 채혈해야 하며 한 개의 주사바늘을 여러 개체에 재활용하지 않습니다.
2. 랫드를 보정틀에 넣거나 마취하고 꼬리를 알코올로 닦습니다.
3. heating lamp 또는 따뜻한 물을 사용하여 혈관 확장을 위해 5~10초 동안 꼬리에만 열을 쬐어주거나 꼬리를 따뜻한 물에 담궈 줍니다.
4. 꼬리를 잡고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다 (그림 참조). 필요시 마취 크림(EMLA cream)을 꼬리에 적용하고 15분간 기다립니다.
5. 혈관의 경로를 따라 needl이 위를 향하는 것처럼 정맥을 찔러 채혈합니다.
6. 주사바늘을 빼고 모세혈관 튜브에 혈액 방울을 수집합니다. 더 많은 양을 채혈하려면 주사기에 needle 혹은 butterfly needle 삽입하여 정맥 천자 후, 정맥이 collaps되지 않게 주사기를 천천히 당깁니다.
7. 지혈이 될 때까지 거즈로 채혈부위에 부드럽게 압력을 가합니다.

그림 1. 랫드 꼬리 단면 모식도

[마우스 미정맥 채혈]

마우스에서 총 혈액량, 단회 채혈량은 아래 표와 같으며 채혈 시 안전한 지침은 단회 채혈 또는 2주 동안 여러 번 채혈 시 가능한 채혈량이 체중의 1% 입니다. 예를 들어, 체중이 20g인 마우스는 단회 채혈에서 0.2ml의 혈액을 채혈하거나 2주 동안 여러 번의 채혈을 통해 총 0.2ml의 혈액을 채혈할 수 있습니다. 미정맥 채혈은 한 번 실시할 때 50µl 정도의 혈액을 채취하는데 적합합니다.

- 재료: 25G needle 또는 butterfly needle 또는 채혈침, heating lamp 또는 따뜻한 물, 보정틀, 알코올 스왑, 채혈 용기(튜브) 등
- 혈액 샘플을 얻기 위해 메스로 꼬리를 자르는 것은 오래된 접근 방식으로 사용해서는 안 됩니다.
- 참고 동영상: Liu X et al. J Vis Exp. 2019;(144):10.3791/59136. 

[방법]

1. 채혈 시 모든 동물은 각각 새로운 멸균 needle/채혈침을 사용하여 채혈해야 하며, 한 개의 주사바늘을 여러 개체에 재활용하지 않습니다.
2. 마우스를 보정틀에 넣고 꼬리를 알코올로 닦습니다.
3. heating lamp 혹은 따뜻한 물을 사용하여 혈관 확장을 위해 5~10초 동안 꼬리에만 열을 쬐어주거나 꼬리를 따뜻한 물에 담궈 줍니다.
4. 꼬리를 잡고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. (그림 참조)
5. 25G needle을 10° 각도로 삽입하여 정맥을 천자합니다. 주사바늘을 빼고 모세혈관 튜브에 혈액 방울을 수집합니다. 혹은 25G butterfly needle을 10° 각도로 삽입하여 정맥 천자 후 채혈 용기에 혈액을 수집합니다.
6. 지혈이 될 때까지 거즈로 채혈부위에 부드럽게 압력을 가합니다.
 

그림 1. 마우스 꼬리 단면 모식도

[방법]

1. 랫드를 마취하고 그림에서와 같이 목 뒤쪽을 잡고 엄지와 검지로 눈주위의 느슨한 피부를 당겨 팽팽하게 합니다. 
2. 모세관/피펫은 눈의 내안각(내측 눈구석)에 코와 30-45° 각도로 넣습니다. 
3. 안구를 지나 약간 저항이 있는 정맥동 막(Sinus Membrane)에 들어가기 위해 밀어 넣습니다.
4. 모세관/피펫을 회전시켜 정맥총/ 정맥동(Plexus/Sinus)을 파열하면 혈액이 통해 흘러나옵니다. 
5. 필요한 양의 혈액을 정맥총에서 채취한 후, 모세관/피펫을 부드럽게 제거하고 멸균된 면으로 닦아냅니다. 경우에 따라 부드럽게 눈에 압력을 가해 지혈합니다. 

그림 1. 랫드 안와 채혈 방법

* 그림출처: Parasuraman S et al. J Pharmacol Pharmacother. 2010;1(2):87-93. 

[주의사항]

1. 모세관/피펫이 신경에 닿아 시신경 손상될 경우 실명할 수 있습니다. 
2. 잘못된 기술이나 동물의 움직임을 통제하지 못할 경우, 안구 궤양, 천공, 유리체액 손실, 감염 또는 각막염이 발생할 수 있습니다.
3. 문헌에 따라 반복이 권장되지 않고 두 번째 채혈 시 2주 간격이 필요하다고 언급하나 NC3Rs에서는 안락사 전제 하에서 수행하여야 한다고 이야기 하고 있습니다.

[반복 채혈시 가능한 채혈양 (NIH Guideline)]

[방법]

1. 마우스를 마취하고 그림에서와 같이 테이블 위에 옆으로 눕히거나, 머리를 아래로 향하게 하고 손으로 잡습니다. 
2. 엄지와 검지(검지는 눈 위, 엄지는 눈 아래에 위치)를 사용하여 눈 위와 아래의 피부를 당겨서 눈이 안구 밖으로 돌출되도록 합니다.  이 때, 엄지로  마우스의 기관을 막지 않도록 주의하십시오.
3. 모세관 또는 피펫을 안구 옆쪽 또는 아래쪽으로 삽입하고, 끝을 45° 각도로 안구 중간을 향해 삽입합니다.
4. 모세관/피펫을 손가락 사이에서 회전시킵니다.
5. 부드럽게 아래로 압력을 가한 후 풀어주면 혈관이 파열되고 혈액이 모세관/피펫에 들어가는 것이 보입니다.
6. 모세관/피펫에 소량의 혈액이 채워지기 시작하면 모세관/피펫을 약간 뒤로 빼서 혈액이 찰 수 있도록 합니다. 
7. 혈액을 확보한 뒤 모세관/피펫을 제거하고 경우에 따라 부드럽게 눈에 압력을 가해 지혈합니다. 

그림 1. 마우스 안와 채혈 방법

* 그림출처: Hoff J. Lab Anim. 29(10):47–53.

[주의사항]

1. 모세관/피펫이 신경에 닿아 시신경 손상될 경우 실명할 수 있습니다. 
2. 잘못된 기술이나 동물의 움직임을 통제하지 못할 경우, 안구 궤양, 천공, 유리체액 손실, 감염 또는 각막염이 발생할 수 있습니다.
3. NIH 가이드라인에서는 반복채혈 방법으로 소개하고 있으나, NC3Rs 에서는 안락사 전체 하에서 수행하여야 한다고 이야기 하고 있습니다. 

[채혈양 (NIH Guideline)]

1. 뇌내 투여를 위한 도구를 멸균하여 준비하고 투여부위인 두개부를 제모합니다. 
2. 통증 경감을 위해 마취를 실시하고 충분히 마취가 되었다고 판단되면 stereotaxic apparatus에 두부를 고정시킵니다. 마취 후에는 가능하면 열판을 제공하여 체온을 유지할 수 있도록 합니다.
3. 투여부위 소독을 실시합니다.
4. 두개부의 표피를 세로로 절개하여 두개골을 노출시킨 후, 멸균 면봉을 이용하여 골막을 제거합니다.
5. 해부학적 지표(예: 브레그마)를 기준으로 하여 stereotaxic 장비를 약물을 주입하고자 하는 부위에 맞게 manipulator X, Y를 조정합니다. 그 후 주입 부위에 골절기를 사용하여 두개골을 직접 천공하고, 매우 얇은 골층만 남았을 때 또는 두개골 전체를 관통했을 때 천공을 멈춥니다. (드릴이 경막을 뚫지 않도록 주의)
6. 멸균된 바늘(27G)을 두개골 표면에 평행하게 눕혀 경막을 절개한 후 바늘 끝 부분을 위치시킵니다. Manipulator Z를 조정하여 경막을 통해 뇌 조직 내 원하는 깊이까지 천천히 내려 투여 준비를 마칩니다. 
7. Injector(50-100 nL/min)를 사용하여 일정한 속도로 약물을 투여합니다. 투여 완료 후 투여량이 50 nL를 초과한 경우, 역류의 위험을 줄이기 위해 바늘을 최대 5분 동안 유지합니다.
8. 바늘을 제거하고 멸균된 면봉을 이용하여 출혈을 닦아낸 후 피부를 봉합하거나 클립 또는 조직 접착제를 이용하여 절개 부위를 봉합합니다. 
9. 봉합 부위를 소독하고 동물이 회복할 때까지 관찰합니다.

그림 1. 뇌내 투여시 필요한 도구

그림 2. 랫드 뇌내 투여시 주의사항

* 그림출처: Puntel M et al. Curr Protoc Neurosci. 2010;Chapter 4:Unit-4.24.