대식세포 형질전환 제브라피쉬의 유전자 이름은 mpeg으로 대식세포 계통 세포만 특이적으로 표지하여 형광이 발현되도록 제작한 형질유전자입니다. 그렇기 때문에 호중구 표지 형질유전자는 발현하지 않습니다.

제브라피쉬의 대식세포도 포유류와 동일하게 난황난에서 원시전구대식세포를 생성하고, 특정시기가 되면 조직정착대식세포와 순환계세포(단핵구)로 이동하여 면역세포의 기능을 하기 위해  분화 및 성숙하는 단계를 거치기 때문에 포유류와 유사한 면역반응을 관찰할 수 있어, 면역반응 연구에 활용합니다.

    - 다른 형질전환 제브라피쉬와 달리, 배아에서의 mpeg 형질유전자는 PFA로 고정 할 경우 평균 2-3시간이 경과하면 형광이 사라집니다. 유전형질의 변화 또는 화합물질을 처리한 배아에서의 mpeg 형광은 건강한 배아에 비해 빨리 사라지기 때문에, 배아에서의 mpeg관찰은 살아있는 상태에서 마취하여 관찰하는 것을 제안합니다.

1. knock-in은 제브라피쉬 유전체의 특정 위치에 원하는 DNA 서열(형광리포터, 에피토프 태그, 포인트 변이 등)을 넣어 기능을 관찰하거나 조절할 수 있게 만드는 기술입니다. 핵심은 CRISPR/Cas9로 표적 위치를 자른 뒤, 공여(donor) DNA가 수선 과정에서 정확히 통합되도록 유도하는 것입니다. 이 기술은 단순히 유전자의 기능을 없애는 knock-out과 달리, 새로운 기능을 넣거나 시각화 도구를 삽입할 수 있어 정교한 연구에 활용됩니다. 예를 들어, 세포 안에서 어떤 유전자가 발현되는지를 관찰하기 위해 그 옆에 형광 단백질(GFP, RFP 등)을 붙여 넣을 수 있습니다. 이렇게 하면 세포가 유전자를 발현할 때마다 특정 형광을 내어 관찰할 수 있습니다. 특히  제브라피쉬는 투명한 배아를 가지고 있어 현미경으로 발달 과정을 직접 볼 수 있기 때문에 knock-in 기술은 다음과 같은 연구에 효과적으로 활용될 수 있습니다.

2. 형광 리포터 제작 및 유전자 기능 연구 

특정 유전자 옆에 형광 리포터를 붙여, 해당 유전자가 언제, 어디에서 발현되는지를 생체 내에서 직접 관찰 및 추적할 수 있습니다. 특히 제브라피쉬의 투명한 배아 특성 덕분에 시간 경과에 따른 발달 과정을 장시간 촬영하기 용이합니다.

*그림 출처 : Chestnut B et al. Developmental Dynamics. 2020 Feb;249(2):245-261

3. 질병 모델 제작: 제브라피쉬에서 인간의 돌연변이 유전자를 발현시킬 수 있는 라인을 구축할 수 있습니다.

이를 통해 질병 과정을 재현하고 실제로 어떤 문제가 생기는지 연구할 수 있습니다.

4. 약물 스크리닝 활용: 특정 세포(예: 신경세포, 혈관세포)에서 빛나는 라인을 만들어 약물이 특정 세포 및 기관의 기능에 어떤 영향을 주는지 빠르게 확인할 수 있습니다.

*그림 출처 : Shi Ouyang et al. Front Cardiovasc Med. 2022 Apr 5:9:839166

* 제브라피쉬 운동신경계

제브라피쉬(zebrafish, Danio rerio)는 운동신경계는 구조적으로 단순하면서도 보존성이 높아,

포유류 운동신경계의 기본 원리를 잘 반영하고 있어 척추동물 신경계 연구, 특히 운동신경계 발달과 기능을 이해하는 데 널리 쓰이고 있습니다.

인간의 운동 신경계는 척수 (spinal cord), 뇌간 (brainstem), 운동피질 (motor cortex)의 세 가지 제어 수준으로 계층적으로 구성되어 있으나, 제브라피쉬의 운동신경계는 대뇌운동피질 경로가 없으며, 뇌간에서 운동명령을 전달하는 상위 신경세포와 하위의 근육과 연결된 신경회로를 가집니다.

* 그림 출처: Prog Neurobiol. 2014 Jul;118:36-58.

  - 배아기 (약 수정 후 17-20시간)부터 가장 먼저 발생됨

  - 큰 세포체와 축삭을 가지며, 수가 적음

  - fast muscle 에 운동신경(motor nerve)이 연결됨

  - 크고 빠른 반응과 강한 수축성 운동을 조절

   (escape, fast swimming, spontaneous coiling)

  - 운동신경세포의 축삭 방향에 따라 4가지 유형으로 구분

* 그림 출처: Dis Model Mech (2012) 5 (6): 921–929.

 

* 그림 출처: Dev Biol. 2001 Jul 1;235(1):86-97.

 

 

◆ 2차 운동신경세포 (Secondary motor neuron, SMNs)

 

  - PMN 발달 이후 형성되나 PMN보다 아랫쪽 척수에 훨씬 많은 숫자로 형성됨

 

  - 상대적으로 작은 세포체와 얇은 운동신경을 가지고 있음

 

  - fast, slow muscle 에 운동신경(motor nerve)이 연결됨

 

  - 체절별 근육의 정교한 조절을 담당하여 운동의 미세조율, 유영 지속에 관여

 

* 그림 출처: Prog Neurobiol. 2014 Jul;118:36-58.

 

 

◆  운동신경 표지 형질전환 제브라피쉬

 

 • mnx1 (previous name- hb9) 유전자 활용 – ex) Tg(mnx1:EGFP), Tg(mnx1:mCherry)

 

 • olig2 유전자 활용 – ex) Tg(olig2:EGFP), Tg(olig2:dsRed)

 

 • Isl1 유전자 활용 – ex) Tg(isl1:GFP)

* 그림 출처: Methods Protoc. 2023, 6(6), 116

* 그림 출처: Toxicology and Applied Pharmacology 237(1):29-40

 

 

◆ 형질전환 물고기를 이용한 운동신경 손상 측정 지표

 

• 운동신경 세포 수의 비교

   - 형광 현미경/공초점 현미경을 활용하여 척수를 이미징 한 후 특정 체절 (segment) 내의 세포 수 측정

 

• 축삭 형태 비교  

   - 전체 축삭 길이 (from soma to axon tip) 측정

 

   - 분지 (branch point)의 수 및 패턴 관찰

 

   - 잘못된 경로로 뻗은 축삭 (pathfinding error) 빈도 정량화

 

• 근육신경접합부(neuromuscular junction) 정량화

 

    - presynaptic marker, postsynaptic marker의 수/면적  및 겹침 (co-localization) 비율 비교         

 

                           

 

* Tg(olig2:dsRed) 이미징을 통해 측정할 수 있는 운동신경 지표

 

* Tg(mnx1:mCherry) 이미징을 통해 관찰되는 운동신경세포

 

* NMJ colocalization

          

Tol2 transposon system은 제브라피쉬 게놈에 외래 유전자를 효율적으로 삽입하기 위해 널리 사용되는 방법입니다.

관심 유전자를 포함한 Tol2 양팔 벡터와 Tol2 transposase mRNA를 1-cell stage 배아에 미세주입하여 형질전환을 유도합니다.

주요 단계는

① 플라스미드 설계 → ② transposase mRNA 합성 → ③ 수정란 주입 → ④ F0 형광 스크리닝 → ⑤ F1 세대에서 germline 전달 확인 → ⑥ 안정 라인 확립 입니다.

장점은 삽입 효율이 높고 다양한 프로모터/리포터 조합이 가능하다는 점이며, 주의사항으로는 주입량 과다로 인한 독성, 무작위 삽입에 따른 발현 패턴 변동, 다중 삽입 가능성 등이 있습니다.

따라서 Tol2 시스템은 zebrafish Tg 라인 제작의 표준으로 활용되며, 발생학·질환 모델링·약물 스크리닝 등 다양한 연구 분야에서 핵심적인 도구로 이용됩니다.

* 그림출처: Koichi Kawakami. Genomr Biol. 2007;8(Suppl 1):S7.

보통 제노프스 실험에 사용하는 동물은 outbred line 입니다. 마우스와 같이 실험 동물에서 유전적 다형성 (genetic heterogeneity) 영향을 최소화 하기 위해 오랜 기간 근친교배(inbreeding)를 통해서 유전적으로 균일성이 높은 inbred line 을 유지하고 실험에 활용하는 경우가 많습니다. 제노프스에서도 근친교배를 오랫동안 진행해서 유전적 균일성이 높은 line 들이 일부 있습니다. Xenopus laevis 의 J-strain 은 1948년 스위스 바젤에서 시작된 근친교배를 아직까지 지속해서 유지하고 있으며[Session, et al., 2016], 유전적 균일성으로 Xenopus laevis genome project 의 샘플로 사용되었습니다.

Xenopus tropicalis 의 경우 “Nigeria” 와 “Ivory Coast” 라는 2개의 wild-type strains 이 알려져 있는데, “Nigeria” strain 이 미토콘드리아 haplotype 을 보다 잘 유지하고 있는 것으로 알려져 있습니다 [Horb, et al., 2016]. 비교적 최근에 근친교배로 inbreeding 을 시작한 “Golden” 및 “Superman” strains 도 있습니다.

하지만 transgenic line 을 만드는 실험이나 CRISPR를 이용한 형질전환 실험에서 특별히 이러한 inbred line 을 꼭 사용해야 하는 건 아닙니다. 제노프스 실험은 대부분 배아 초기 발달 단계의 형질 전환을 관찰하는데 여러 개체에서 얻은 수백 개의 배아를 한꺼번에 관찰할 수 있기 때문에 유전적으로 다양한 개체에서 공통적으로 나타나는 형질 변화를 관찰하는 게 훨씬 정확한 데이터를 얻을 수 있기 때문입니다. 또한 CRISPR 실험에서도 대부분 단백질 유전자 영역을 표적으로 할 때 DNA 상의 변이가 있는 경우가 많지 않기 때문에 알려진 표준 유전체 정보를 바탕으로 실험을 설계해도 대부분의 경우 문제가 없습니다.

이러한 inbred line 이 필요한 경우에는 미국의 제노프스 소재 은행인 National Xenopus Resource Center (NXR, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA 에 위치)이나 유럽 소재 은행인 European Xenopus Resource Center (Portsmouth, UK 에 위치), 일본 히로시마 대학의 양서류 연구소에서 분양 받을 수 있습니다.

제노프스에서 CRISPR 실험을 하기 위해서는 (1) Cas enzyme 과 (2) guide RNA 가 필요합니다.

일반적으로 CRISPR 실험을 할 때에는 Cas enzyme 을 mRNA 의 형태로 주입하거나 protein 형태로 주입할 수 있습니다. 하지만 F0 에서 형질을 관찰하고 싶을 경우나 transgenic 을 만들 때 가급적 많은 세포에서 동일한 변이가 일어나는 것이 필요하기 때문에 주입하자마자 Cas enzyme 이 표적에 작용하는 것이 좋습니다. mRNA 를 주입하게 되면 단백질로 번역되는 데 시간이 걸리기 때문에 초기에 작용하기 어려워 대부분 제노프스 실험에서는 단백질 형태의 Cas enzyme 을 사용하게 됩니다.

직접 단백질을 정제해서 사용하는 방법도 있으나 대부분 제노프스 연구실에서는 Integrated DNA Technologies (IDT)와 같은 업체에서 구입해서 사용합니다. 특히 낮은 온도에서 배양하는 제노프스 배아에서도 효과가 좋은 Cas12a-Ultra 의 경우 IDT 사에서 직접 제작한 효소입니다. Cas9 의 경우 다른 업체에서 판매하는 제품도 성능 면에서는 큰 차이가 없습니다. (Yun, et al., 2023)

(2) Guide RNA

표적 특이적인 guide RNA 의 경우 Cas12a, SpCas9, SaCas9 등 사용하는 Cas eyznme 의 PAM site, GC content 및 tandem repeat 의 여부를 가지고 설계를 할 수 있습니다. CHOPCHOP 이 대표적인 웹 설계 도구이며 X. laevis 및 X. tropicalis 모두 최신 genome 을 지원하고 있어 편하게 설계에 사용할 수 있습니다. 최근 AI를 이용하여 CRISPR 효율을 예측하는 연구도 많이 진행되어 인간 및 마우스에서 많이 활용되고 있는데, 그러한 도구 가운데 하나인 inDelphi의 경우 마우스 배아줄기세포(mESC) 기반 예측 모델이 제노프스에서 잘 작동하는 것이 보고되었습니다 [Neart, et al., 2020]. 이러한 도구를 사용해서 보다 효율이 높은 guide RNA 설계가 가능하게 되었습니다.

Guide RNA 설계 이후에는 일반적인 primer 주문하는 것과 동일한 방법으로 guide RNA 를 제작할 수 있습니다. SpCas9 의 경우 표적을 결정하는 crRNA 와 Cas9 enzyme 과 결합에 필요한 tracRNA 를 별도로 제작할 수도 있고, 둘을 결합하여 sgRNA 의 형태로 사용할 수도 있습니다. 전문 업체에 주문할 경우 RNA 에 변형을 가하여 보다 안정성을 높이는 방법도 가능하지만 DNA template 을 제작하고 in vitro transcription 을 통해 만든 sgRNA 도 널리 사용되고 있습니다. Integrated DNA Technologies (IDT) 가 대표적으로 이러한 CRISPR 전문 guide RNA 를 제공하고 있습니다.

Cas12a 의 경우 crRNA 의 길이가 짧고 tracRNA 가 없기 때문에 보통 IDT 와 같은 업체에서 주문해서 사용하게 됩니다. Cas12a 는 여러 개의 crRNA 가 있는 polycistronic guide RNA 를 프로세싱해서 여러 표적을 한꺼번에 타게팅할 수 있는 IN4MER 기술이 있어 이를 활용할 경우 in vitro transcription 을 이용해서 guide RNA 를 제작하는 것도 가능합니다. IN4MER 기술은 특히 여러 부위를 동시에 표적해야 하는 경우나 X. laevis 의 L/S form 을 동시에 표적하는 guide RNA 가 없는 경우 유용하게 활용될 수 있습니다.

Xenbase 에서는 논문에서 사용된 guide RNA 를 별도 데이터베이스로 관리하고 있으니, 관심있는 유전자에 검증된 guide RNA 가 있는지 확인하고 사용하는 방법도 있습니다.

제노프스도 transgenic line 이 있습니다. 1980년대부터 다양한 방법으로 transgenesis 실험을 제노프스 모델에서 진행했지만 다른 모델동물에 비해 transgenic line 의 활용이 많지 않았는데 다음 세대를 만들기 위해 걸리는 시간이 5-8개월(X. tropicalis) 또는 6-12개월(X. laevis) 상대적으로 길어서 F2 homozygotes 을 만드는 데 시간이 오래 걸리는 게 주요 걸림돌이었습니다. 하지만 Xenopus 는 다른 모델 동물에 비해 수명이 길어서, X. laevis female 의 경우 15년 이상 알을 낳을 수 있기 때문에 한 번 구축해 놓은 transgenic line 은 오랫동안 유용하게 사용할 수 있습니다 [Horb, et al., 2019].

CRISPR 가 보편적으로 유전자 편집에 사용되면서 미국의 National Xenopus Resource Center (Woods Hole, MA, USA)를 중심으로 보다 체계적으로 transgenic line 을 만들고 있습니다. 크게 구분해서  (1) reporter expression lines, (2) inducible lines, (3) GAL4 and Cre driver lines,(4) single landing site lines 으로 나뉠 수 있습니다 [Horb, et al., 2019].

사용 가능한 transgenic line 정보는 미국 NXR 및 영국 EXRC 웹사이트를 통해서 확인할 수 있습니다. 또한 제노프스 정보를 통합 관리하는 Xenbase 를 중심으로 이러한 transgenic line 정보를 체계적으로 관리하는 노력을 지속하고 있습니다. 체계적으로 transgenic line 을 부르는 명명법(nomenclature)를 제정하여 기존의 line 들과 새로 개발되고 있는 line 들에 적용하고 있습니다 [https://www.xenbase.org/xenbase/static/gene/tgNomenclature.jsp].

2025년 현재 Xenbase 에는 420개의 transgenic constructs, 605개의 lines and strains 정보가 등록되어 있습니다. 제노프스 transgenic line 을 실험에 사용하기 위해서는 생태계위해우려종 관련 신고 이외에도 다른 모델동물의 transgenic line 과 마찬가지로 유전자변형생물체(Living Modified Organism; LMO) 관련 도입 신고가 반드시 필요합니다. 아울러 transgenic line 을 유지하기 위해서는 LMO 사육 시설에 대한 승인도 도입 이전에 받아야 합니다.

CRISPR 기술은 2012년 진핵세포에서 사용될 수 있다는 것이 보고된 이후 인간 및 모델동물을 이용한 연구 뿐만 아니라 많은 분야의 생물학 연구에서 유전자 형질전환이 필요한 실험에 널리 사용되고 있습니다. 하지만 처음 보고된 S. pyogenes Cas9 과 이후 보고되어 많이 사용되는 대부분의 Cas9 단백질의 경우 세균과 세포주 배양이 주로 이루어지는 37도 온도에서 실험을 해 왔습니다. 하지만 제노프스의 경우 37도 온도에서 배아가 살 수 없고, 배아를 키우는 22-24도의 낮은 온도에서는 Cas9 단백질의 기능이 떨어지는 것이 알려져 있습니다.

이후 발견된 Cas12a 의 경우에는 이러한 온도 의존도가 더 높아서 제노프스의 배아 사육 온도에서는 기능을 하지 못하는 것이 알려져 있습니다 [Moreno-Mateos, et al., 2017]. 이러한 문제를 해결하기 위해 배아에 CRISPR 를 주입하고 0-4시간 정도 30도의 높은 온도에서 키우면 CRISPR 의 효과를 좋게 할 수 있습니다. 하지만 이 방법은 비교적 높은 온도(28 C)에서 배양이 가능한 X. tropicalis 에서만 적용 가능하며, X. laevis 의 경우에는 적용이 어렵습니다. 따라서 X. laevis 에서 온도를 높여 CRISPR 효율을 높이기 위해서 이보다 낮은 28 C 정도에서 heat shock treatment 를 진행합니다.

Integrated DNA Technologies (IDT) 에서는 온도 의존도가 낮고 효율이 훨씬 우수한 Cas12a 를 개발했는데 (AsCpf1-Ultra 및 LbCpf1-Ultra)[Zhang, et al., 2021] 이는 16 C 의 낮은 온도에서도 충분히 효율적인 성능을 보여줍니다 [Yun, et al, 2023]. 그 결과 F0 에서도 DNA 변이에 의한 gene knock-out 형질 변환을 쉽게 관찰할 수 있게 되었습니다. 또한 SpCas9은 온도 의존도가 상대적으로 낮고, 농도를 높이면 그 의존도가 훨씬 감소하게 됩니다 [Yun, et al, 2023]. CRISPR/Cas 시스템의 효율은 온도가 높을수록 좋지만, 반면에 제노프스에 변이가 일어나고 회복되는 효율은 오히려 온도가 낮을수록 좋다는 보고도 있어서 [Kato, et al., 2021], 온도 의존도가 낮은 Cas12a 를 활용하면 보다 다양한 조건에서 제노프스의 CRISPR 효율을 높일 수 있을 것입니다.

유전자 knock-out 은 보통 유전자를 완전하게 없애는 complete knock-out 과 유전자에 변이를 많이 도입하여 유전자의 기능을 없애는 gene inactivation 을 언급하는 경우가 많습니다.

Complete knock-out 은 원하는 영역의 유전자를 완전히 없애는 기술인데 이를 위해서는 (1) CRISPR 등의 기술로 체세포 전반에 mosaic 형태의 knock-out 세포들을 만들고(보통 homologous recombination 기반의 기술을 사용), (2) 이 가운데 생식세포로 전달되는 개체를 스크리닝한 다음, (3) 이들간의 교배를 통해 균일한 형태의 knock-out 을 만들 수 있습니다. 하지만 제노프스의 경우 다음 세대에서 이를 관찰하기까지 1년 정도의 시간이 필요하기 때문에 하나의 complete knock-out을 완성하기 위해서 2년 이상의 실험이 필요하게 됩니다. Cre-lox 와 같이 다른 모델동물에서 complete knock-out 을 만들기 위한 transgenic line 도 개발중이나 아직 그 숫자가 다양하지는 않습니다. 따라서 제노프스에서 complete knock-out 실험을 진행하는 경우는 거의 없습니다.

반면 유전자의 기능을 없애는 gene inactivation 은 다양한 방법으로 실험할 수 있습니다. 이전에는 modified antisense oligo 인 morpholino 를 이용하여 단백질 생성을 막는 실험을 많이 했지만, 최근 CRISPR 기술의 발달로 단백질 발현 유전자 또는 발현 조절 영역에 임의의 변이를 도입하여 유전자의 기능을 없앨 수 있습니다. 유전자 및 표적 위치에 따라 다르기는 하지만 처음 배아에 주입한 후 유전자 기능을 약 80% 까지 없앨 수 있습니다.

하지만 바로 CRISPR 를 주입한 배아에서는 완벽한 유전자 기능 상실을 구현하기는 매우 어렵습니다. 세포 분열이 일어나기 전에 변이가 일어난다면 가능한 경우이기는 하지만, 매우 드물게 일어날 수 있는 일이며 세포 분열이 시작되어 여러 세포가 발생하는 단계에서 CRISPR 가 작용하는 시점이 다르고 복구 경향도 다를 수 있기 때문에 mosaic 의 형태로 유전자 기능 상실이 일어나게 됩니다. 따라서 CRISPR 주입한 배아에서 직접 유전자의 기능을 보는 경우 knock-out 보다는 유전자 발현을 억제한 knock-down 과 유사한 형질 전환으로 이해하고 있습니다.

CRISPR 에 의한 유전자에 임의 형태의 변이를 도입하고 형질 전환을 만든 경우에는 해당 유전자가 제노프스의 성장에 큰 문제가 없다면 다음 세대의 배아를 얻어서 gene inactivation 과 유사한 환경을 관찰할 수 있습니다. 특히 생식세포의 한 쪽 DNA 를 파괴하고 수정시켜 haploid 배아를 만든 다음 세포 분열을 조절하여 diploid 배아를 만드는 gynogenesis 기술을 이용하면 바로 다음 세대에서 complete gene inactivation 배아를 구현할 수 있습니다 [Nakayama, et al., 2022].

Gene inactivation 의 정도는 단백질의 발현을 western blot 으로 확인하는 방법이 가장 많이 사용되며 CRISPR 표적 영역을 해독해서 얼마나 많은 종류의 변이가 생겼는지 확인하는 방법이 사용됩니다. NGS 로 분석하는 방법이 표준적으로 사용되고 있으나 전통적인 Sanger sequencing 방법으로도 chromatogram 분석을 통해 변이 구성을 확인할 수 있는 방법이 있어 이 방법도 간단히 검증하는 용도로는 많이 활용되고 있습니다.