예쁜꼬마선충의 신경돌기는 손상 후 재생될 수 있습니다. 하지만 신경의 종류와 성장단계, 유전적 요인에 따라 그 능력이 달라집니다.

- 신경의 종류: 예쁜꼬마선충은 다양한 종류의 신경을 가지고 있습니다. 종류는 크게 감각신경, 운동신경, 연합신경으로 나누어지고 세부적으로는 더욱 다양한 신경들이 있습니다. 다양한 신경세포들은 서로 다른 축삭재생 능력을 가지고 있습니다.
- 성장 단계: 예쁜꼬마선충의 성장 단계는 유충 단계인 L1부터 L4, 그리고 성충(Adulthood) 단계로 나누어집니다. 선충은 유충과 성충 단계에서 모두 축삭재생이 꽤 잘 일어납니다. 하지만 노화가 일어나면서 이러한 축삭재생 능력도 떨어지게 됩니다.
- 유전적 요인: 여러 유전자들이 축삭재생에 관여합니다. 어떤 유전자들은 축삭재생을 돕지만 재생을 방해하는 유전자들도 존재합니다.

과학자들은 달라지는 축삭재생 능력을 평가할 때, 신경의 형태 또는 기능 회복을 관찰합니다. 다음과 같은 방법들로 축삭재생을 연구합니다.

- 신경의 형태: 레이저를 이용하여 신경의 축삭돌기를 손상시켜 자릅니다. 잘려진 부위로부터 축삭돌기가 자라날 수 있습니다. PLM 신경세포와 같은 감각신경의 경우 손상 후 다시 자라난 축삭돌기의 길이를 측정하고, 운동신경의 경우 손상 후 다시 VNC(Ventral Nerve Cord; 배쪽 신경삭)와 연결되는지 여부 등을 평가하여 재생 능력을 측정합니다.
- 신경의 기능: 외부 자극(예: touch, 냄새)에 대한 반응, 행동, 신경의 전기 신호 등을 통해 기능적으로 회복되는 수준을 평가합니다.

* 그림출처: Malinow RA et al. Front Cell Neurosci. 2019;13:348.

이 방법들을 통하여 예쁜꼬마선충의 신경돌기가 얼마나 재생되고 기능하는지 종합적으로 평가할 수 있습니다.

예쁜꼬마선충의 신경세포는 유형에 따라 감각신경(Sensory Neurons), 연합신경(Interneurons), 운동신경(Motor Neurons)으로 나뉩니다. 예쁜꼬마선충의 움직임은 감각신경이 다양한 환경 요인을 감지하고 이를 연합신경을 통해 하부 경로인 운동신경으로 전달함으로써 결정됩니다. 따라서 세 신경 집단 connection의 조화가 예쁜꼬마선충의 행동을 조절하기 때문에 신경세포의 유형에 따라 표현형들을 구분짓고 예쁜꼬마선충의 행동 변화를 관찰할 수 있습니다.

* 그림출처: Tsalik EL et al. J Neurobiol. 2003;56(2):178-197.

1. 감각신경 결함
예쁜꼬마선충의 감각신경의 결함은 먹이와 화합물 탐색 및 인지 실험을 통해 평가할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 먹이와 화합물 냄새 감지 능력은 chemotaxis assay와 food seeking assay라는 실험을 통해 평가됩니다. Chemotaxis assay와 food seeking assay는 선충이 환경에서 냄새 분자를 탐지하고 이에 반응하여 먹이로 이동하는 능력을 측정하는 방법입니다.  감각신경세포의 결함이 있는 예쁜꼬마선충은 냄새를 인지하지 못하기 때문에 먹이 또는 좋아하는 냄새의 화합물로 이동하지 못하게 됩니다.

* 그림출처: Suryawinata N et al. Sci Rep. 2024;14(1):5529.

이와 유사하게 예쁜꼬마선충이 먹이를 인지하고 먹이 주변에서 느려지는 행동 변화를 관찰하는 basal slowing assay로도 감각신경세포의 능력을 평가할 수 있습니다. 감각신경세포에 결함이 있는 예쁜꼬마선충은 먹이가 있는 환경을 인지하지 못하고 먹이를 찾기 위한 행동을 지속하게 되면서 운동성이 감소되지 않습니다.

* 그림출처: Lee Y et al. Ecotoxicol Environ Saf. 2023;255:114752.

예쁜꼬마선충은 화합물의 냄새 뿐만 아니라 touch, 압력, 진동과 같은 물리적 힘의 기계감각을 인지하는 신경세포도 보유하고 있습니다. 기계감각 실험은 예쁜꼬마선충이 물리적 자극을 감지하고 이에 반응하는 능력을 평가하는 방법입니다6. 정상적인 선충은 touch 자극에 즉각적으로 반응하여 빠르게 touch 반대 방향으로 이동하는 반면 기계감각 신경 세포가 손상된 선충은 반응을 하지 않고 계속 앞으로 이동합니다. 대표적으로 gentle touch assay와 harsh touch assay가 있으며, 각각에 자극 반응에 관여하는 신경세포의 종류가 다릅니다. 
 

* 그림출처: Koopman M et al. Nat Protoc. 2020;15(6):2071-2106.

2. 운동신경 결함
예쁜꼬마선충의 감각신경세포와 중간신경세포의 신호전달은 최종적으로 운동신경세포에 의해 행동으로 출력됩니다. 운동신경의 결함은 예쁜꼬마선충의 운동성을 제한합니다. 선충의 운동신경세포의 결함을 평가할 수 있는 실험들은 body bending assay, thrashing assay, locomotion assay 등이 있습니다. 예쁜꼬마선충이 고체 배지의 먹이 위에서 움직일 때 S자 형태의 동일한 경로를 보이며 이동하는데, body bending assay는 이 빈도를 측정하여 전반적인 운동성을 평가하는 방법입니다. Thrashing assay는 액체 배지에서 선충의 수영 능력을 평가하는 실험으로 일정 시간을 두고 수영 횟수를 계수하여 운동성을 평가합니다. Locomotion assay는 선충을 고체 배지 위에서 얼마나 멀리 이동하는지를 측정하는 실험입니다. 운동신경의 결함이 있는 예쁜꼬마선충은 움직임의 빈도가 현저히 감소하게 되고, 이동 거리가 줄어드는 등의 비정상적인 표현형을 나타냅니다. 

* 그림출처: Koopman M et al. Nat Protoc. 2020;15(6):2071-2106.

예쁜꼬마선충의 신경세포의 결함은 행동 수준에서 뿐만 아니라 세포 수준에서도 평가될 수 있습니다. 다른 동물 모델과 다르게 몸이 투명한 예쁜꼬마선충은 형광 단백질로 감각신경세포 또는 운동신경세포를 표지하여 손상과 퇴행을 현미경을 통해 실시간으로 관찰이 가능합니다. 신경세포의 결함 표현형으로는 대표적으로 신경세포의 신경돌기(축삭돌기 및 수상돌기)가 끊어지거나 신경돌기의 손상, 세포체의 구형화 등이 있습니다. 따라서 신경세포를 관찰하기에 적합한 예쁜꼬마선충은 신경세포의 결함에 따른 행동 표현형의 변화에 대한 직접적인 인과관계를 도출할 수 있습니다.

* 그림출처: Bijwadia SR et al. J Vis Exp. 2021;(177):10.3791/62894. 

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 자신이 싫어하는 화학물질에 대해 회피 행동을 보입니다. 예를 들어, 예쁜꼬마선충은 화학물질을 피하기 위해 뒤로 물러나거나 머리를 돌려 나아가는 방향을 바꿉니다. 이 회피행동을 정량적으로 측정하기 위해 다양한 실험 방법이 사용됩니다. 예를 들어, 화학 물질과 대조군을 떨어뜨린 배지에 예쁜꼬마선충 여러 마리를 놓고 얼마나 많은 선충이 해당 화학 물질을 피하는지 관찰할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 휘발성 물질이 아닌 경우에는 적용하기 어렵습니다. 이러한 경우에는 드롭 테스트 기법을 사용합니다. 

드롭 테스트는 휘발성이 아닌 물질에도 적용할 수 있을 뿐만 아니라 예쁜꼬마선충이 화학 물질에 즉각적으로 반응하는 모습을 관찰할 수 있어 기존의 회피 행동 관찰방법과 차별화됩니다. 이 실험을 통해 예쁜꼬마선충의 신경계가 특정 화학물질에 어떻게 반응하는지 이해하는데 도움이 됩니다.

[실험 기법 모식도]

1. 굶지 않은 건강한 어른 상태의 예쁜꼬마선충을 다량 준비하고 이들을 먹이(박테리아)가 존재하지 않는 깨끗한 plate로 이동시킵니다.
2. 예쁜꼬마선충이 앞으로 기어가고 있을 때, 유리 피펫을 사용해 버퍼 액체에 희석된 화학물질을 머리 앞에 떨어뜨려 예쁜꼬마선충이 화학물질과 접촉하게 해줍니다.
3. 화학물질과 접촉한 후, 해당 예쁜꼬마선충이 뒤로 물러 가는 거리와 반응 시간을 관찰하고 기록합니다. 

[실험 결과의 예시]

* 그림출처: Hong M et al. Curr Biol. 2017;27(20):3168-3177.e3.

본 그래프는 다양한 농도의 예쁜꼬마선충 페로몬 ascr#3을 사용해 실험한 결과입니다.

야생형 동물의 경우, 일반적인 상황에서(파란색) 10nM과 100nM의 페로몬은 각각 10-20%, 이보다 더 고농도인 300nM와 400nM에서는 60-70% 가량의 회피 반응을 보입니다.
그러나 예쁜꼬마선충이 어린 시절 페로몬에 노출된 경험이 있는 경우(빨간색), 기존에 비해 훨씬 높은 반응을 보입니다. 

이 실험 기법을 통하여 페로몬 회피반응에 기존의 경험이 중요함을 알 수 있습니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 자연 상태에서 주로 박테리아를 먹으며 생활합니다. 연구실에서는 이를 재현하기 위해 대장균(E. coli)을 배양하여 먹이로 제공하는데 그 중에서도 OP50이라는 변형된 대장균 균주가 예쁜꼬마선충의 성장과 번식에 적합하여 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충이 먹이를 섭취하는 방식은 매우 단순합니다. 입을 통해 대장균을 섭취한 후 장으로 이동시키면서 소화하여 필요한 영양소를 얻습니다. 이 섭식 과정을 연구하기 위해 여러 실험적 방법이 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 대장균이 포함한 배지 위에서 입으로 먹이를 섭취할 때 발생하는 인두의 펌핑(Pharyngeal Pumping)을 측정하는 방법이 있습니다. 이 방법은 실체현미경을 이용하여 비교적 접근하기 쉬운 실험 기법입니다.

반면에, 마이크로입자 이동 실험(Microsphere Movement Assay)은 기존의 섭식 행동 관찰법보다 먹이의 이동을 직접적으로 관찰이 가능합니다. 이 기법은 예쁜꼬마선충의 몸 내부에서 먹이가 어떻게 이동하는지를 시간에 따라 관찰할 수 있어 섭식 행동의 미세한 변화를 보다 정밀하게 분석할 수 있습니다. 이 방법은 특히 섭식 행동을 조절하는 특정 유전자의 역할을 이해하는 데 유용합니다.

[마이크로입자 이동 실험 기법의 모식도]

1. 예쁜꼬마선충의 먹이인 대장균(OP50)은 투명한 먹이이기 때문에 섭식 행동을 시각적으로 보기 위하여 형광마이크로입자를 사용합니다. 
2. 형광마이크로입자를 대장균과 9:1로 섞어서 NGM(Nematode Growth Medium) plate에 전체에 도말하여 실험 plate를 만듭니다. 
3. 잘 먹고 자라 성충이 된 예쁜꼬마선충을 형광마이크로입자가 섞인 실험 plate에 옮겨 20분 동안 먹입니다.
4. 20분 후 대장균(OP50)만 도말된 plate에 예쁜꼬마선충을 옮겨 형광 현미경을 통해 시간의 흐름에 따른 형광마이크로입자의 변화를 관찰합니다. 

[실험 결과의 예시]

이 사진들은 5분 동안 1분 간격으로 장내 형광마이크로입자의 형광 밝기(각 사진들의 왼쪽 아래, 녹색) 변화를 관찰한 결과입니다.

야생형(Wild Type)의 경우, 5분 동안 섭식행위를 통해 장 앞쪽 부분의 형광마이크로입자 밝기가 점점 줄어드는 현상을 관찰할 수 있습니다. 그러나 섭식 행위에 문제가 있는 돌연변이의 경우 (pezo-1 mutants), 5분이 지나도 여전히 장 앞쪽 부분에서 형광마이크로입자가 관찰됩니다.

이 실험 기법을 통하여 장 내부에서 섭식 행동을 조절할 수 있는 특정 유전자의 기능을 연구하는데 활용될 수 있습니다.

예쁜꼬마선충은 짧은 수명(약 2-3주)을 가지며 개체당 300마리 이상의 많은 자손을 낳아 노화 연구에 적합합니다. 또한, 유전적 조작이 용이하여 무작위 돌연변이, RNA 간섭(RNAi), CRISPR 유전자 편집 등을 통해 노화를 조절하는 유전자를 쉽게 식별할 수 있습니다.

수명 실험은 보통 20℃에서 NGM 플레이트에 성체 예쁜꼬마선충을 배양하여 수행합니다. 동일한 나이의 예쁜꼬마선충은 자손의 부화를 막기 위해 5-10μM FUDR(5-Fluoro-2′-deoxyuridine)이 포함된 plate로 옮겨지며 실험자는 2-3일에 한 번씩 생존여부를 측정합니다. FUDR을 사용하지 않는 경우에는 예쁜꼬마선충이 더 이상 알을 낳지 않을 때까지 새로운 plate로 옮겨줍니다. 생존여부 측정 시, 파열되거나 내부 부화가 발생하거나 plate를 벗어난 개체는 검열 처리됩니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서 최소 2명의 독립적인 실험자가 실험을 수행하며 실험에 사용한 모든 worm이 죽으면 통계 분석을 진행합니다. p-value는 log-rank(Mantel-Cox) test로 계산합니다. 

돌연변이체를 사용할 경우, 보통 예쁜꼬마선충의 대표적인 먹이인 OP50 박테리아를 사용합니다. RNAi 실험에서는 특정 유전자를 표적으로 하는 이중가닥 RNA를 발현하는 HT115 박테리아를 사용하며, 전 생활 단계에서 RNAi를 적용하거나 성체에만 적용하는 방법을 선택할 수 있습니다. 전 생활 단계에서 RNAi 처리시 발달 문제를 일으킬 경우 성체에만 적용하는 방법을 사용합니다. 

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans; C. elegans)은 노화 연구에 널리 사용되는 모델 생물로 여러 방법을 통해 건강 노화를 측정할 수 있습니다. 다음은 주요한 측정 방법들입니다.

[Swimming Assay]
이 방법은 예쁜꼬마선충의 운동 능력을 평가하는 방법으로 건강한 선충은 더 활발하고 빠르게 수영하는 반면 노화된 선충은 운동 능력이 감소하게 됩니다. 실험적으로는 선충을 액체 배지에 넣고 특정 시간 동안의 수영 속도나 빈도를 측정합니다. 이를 통해 노화에 따른 운동 기능 저하를 모니터링할 수 있습니다.
 

[Pumping Rate(섭식 속도)]
예쁜꼬마선충의 인두(Pharynx) pumping 속도를 측정하는 방법으로 섭식 속도는 노화와 밀접하게 연관되어 있습니다. Pumping 속도는 노화가 진행됨에 따라 감소하며 이를 통해 건강 상태를 평가할 수 있습니다. 섭식 속도를 측정하기 위해 선충의 인두가 수축하는 빈도를 관찰하여 기록합니다.

[Progeny Number Assay (자손 수 분석)]
자손의 수는 생식 건강의 지표로 사용되며 건강한 예쁜꼬마선충은 더 많은 자손을 생산합니다. 노화가 진행됨에 따라 자손 생산 능력이 감소하기 때문에 자손 수를 측정하는 것은 건강 노화의 중요한 지표가 됩니다. 이 방법은 일정 기간 동안 생성된 자손의 수를 계수하여 평가합니다.

이 외에도 Lifespan Assay, Antioxidant Assay(항산화 능력 측정), Lipid Accumulation Assay(지질 축적 분석) 등 다양한 방법들이 예쁜꼬마선충의 건강 노화를 평가하는데 사용됩니다. 각 방법들은 노화와 관련된 다양한 생리적 변화를 정량적으로 평가할 수 있어 노화 연구에서 중요한 도구로 활용됩니다.

C. elegans에는 자웅동체와 수컷, 2가지 성이 존재합니다. 교배를 할 때는 자웅동체와 수컷을 각각 사용해야 합니다. 먼저 bacteria가 seeding 되지 않은 NGM(Nematode Growth Media) plate의 중앙에 OP50 박테리아를 약간 올려놓습니다. 이는 C. elegans가 섭취하는 먹이로 박테리아를 중앙에만 배치함으로써 자웅동체와 수컷이 더 자주 만나 교배 효율을 높일 수 있습니다. 이후, 교배를 위해 자웅동체 L4 stage 또는 prefertile adult stage 자웅동체 한 마리와 수컷 여섯 마리를 같은 plate에 올려놓습니다. 자웅동체의 stage가 중요한 이유는 자웅동체가 자신의 sperm을 사용하기 전에 수컷의 sperm을 우선적으로 사용하도록 하기 위해서입니다. Mating이 제대로 이루어지지 않을 상황에 대비해 최소 3개의 plate를 준비하는 것이 좋습니다.

다음 날, 자웅동체와 수컷을 새로운 plate로 옮기고 만약 수컷이 사라졌다면 추가로 수컷을 넣어줍니다. 그 다음 날도 동일하게 자웅동체와 수컷을 새 plate로 옮긴 후, 3일째 되는 날에는 남아 있는 자웅동체와 수컷을 모두 제거하고 자웅동체가 낳은 알만 남깁니다. 이렇게 하면 교배 1, 2, 3일차에 자웅동체가 낳은 알만 남은 plate가 남습니다. 1일차에는 교배가 잘 이루어지지 않았을 수 있어 되도록 사용하지 않고, 2일차 plate에서 수컷과 자웅동체가 섞여서 태어난다면 교배가 성공적으로 이루어진 것입니다. 이 plate에서 필요한 수컷이나 자웅동체를 골라서 사용하면 됩니다.

수컷을 얻는 기본적인 방법은 WT(Wild Type) 수컷과 교배하여 수컷 자손을 얻는 것입니다. 하지만 연구실에 수컷이 전혀 없어서 교배가 불가능하다면 heat shock을 이용해 낮은 확률로 수컷을 얻을 수 있습니다. 이를 위해 bacteria가 seeding된 NGM plate 5개를 준비하고, 각 plate에 L4 stage의 자웅동체를 4-5마리씩 올려놓습니다. 이 plate들을 31℃에서 5-6시간 동안 incubation한 후 다시 20℃로 옮기면 됩니다. 이렇게 하면 태어나는 F1 자손 중 약 2-5%가 수컷으로 태어나므로 이 수컷을 골라내어 사용합니다.

일반적으로 동물모델에서 실험 후 장기를 적출하여 다양한 실험을 진행해야할 때 혈액이 문제될 수 있습니다. 특히 혈액에는 알부민 등의 단백질이 많기 때문에 조직 내에 잔존혈액이 많을 경우, 자칫 원치않은 실험적인 오류가 발생할 수 있습니다.

따라서 조직을 적출할 때 장기에서 최대한 혈액을 제거하기 위하여 perfusion(관류)을 진행하게 됩니다. 간의 경우, 간으로 들어오는 portal vein(간문맥)이 가장 크기 때문에 perfusion을 진행할 수 있습니다. 그 외의 조직의 경우에는 대정맥 혹은 좌심실을 이용하여 관류를 진행할 수 있습니다.

일반적으로 조직에서 혈액을 제거하기 위해서는 동물모델을 마취한 후, PBS를 주입하면 충분한 관류가 진행될 수 있고, 만일 RNA를 추출하려 한다면 Rnase를 넣은 PBS를 투여할 수 있습니다. 또한 심장을 이용하여 perfusion을 진행한다면 횡경막을 자른 후 가슴을 열어야 하는데, 이럴 경우 마우스의 호흡이 빠르게 멈추기 때문에 모든 process를 매우 빠르게 진행해야 합니다.

간 조직에서 primary hepatocyte을 얻기 위해서는 살아있는 마우스를 마취한 후, 조직의 extracellular matrix 및 각 조직의 세포를 연결하는 콜라겐을 제거해야 합니다. 일반적으로 마우스를 마취시킨 후 배를 절개하여 간으로 들어오는 portal vein을 확인한 후, 정맥에 collagenase solution을 주입함으로써 간 조직에서 세포를 분리할 수 있도록 합니다. 이 때 collagenase solution이 효소반응을 잘 하여 간 조직에 존재하는 collagen을 분해할 수 있도록 온도를 37℃에 맞추는 것이 매우 중요합니다. 따라서 solution 온도를 맞춰줄 수 있는 pump를 이용하여 collagenase solution을 마우스의 portal vein에 주입합니다.

Primary cell culture는 매우 정교한 프로토콜을 요구하기에 참고문헌을 잘 확인하시기 바랍니다.

골수세포 이식술(Bone Marrow Transplantation)은 마우스 면역 연구에서 주로 활용되는 연구방법으로 면역세포의 변화를 관찰할 수 있는 실험 기법 중 하나이다. 

Recipient 마우스에 UV irradiation을 통해 기존 골수세포 및 면역세포를 제거시킨 후 donor 마우스의 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cell; HSC)을 주입하면 donor의 HSC가 recipient의 골수에 자리잡아 면역세포나 혈구세포들의 donor 마우스 유래 세포로 완전히 바뀔 수 있는 방법이다. 

UV irradiation의 Gy 세기에 따라 recipient의 면역세포 사멸 정도가 다른데 예를들면 11 Gy 미만에서는 조직상주 대식세포에 대한 사멸이 나타나질 않는다. 이러한 방법들을 통해 특정 유전자변형 면역세포들이 recipient에 주입될 시 면역세포의 localization이나 maturation, chemotaxis의 경향이 다른지 관찰할 수 있는 유용한 실험 기법 중 하나이다.