1. 원숭이 번식군 구성
 - 마모셋 원숭이(Common Marmoset)는 일부일처제(수컷1+암컷1, Monogamy)로 번식하고, 게잡이원숭이(Cynomolgus Monkey)나 붉은털원숭이(Rhesus Monkey)는 일부다처제 (수컷1+암컷 >2, Multigamy)로 번식합니다.
 

2.  원숭이 번식생리 

3. 임신 진단방법
  1) 복부촉진(마모셋원숭이): 하복부 복부촉진을 통해 임신유무를 확인(대장 내 소화물과 감별 필요)
  2) 영상진단
    - 초음파 검사: 임신초기 진단에 유용하며, 산자수  및 태아지표(심장박동, Biparietal Diameter 등) 확인
    - 방사선 검사: 산자수 확인 및 태아의 골반 통과 평가 등에 활용

1. 영장류 정의   

 - 평편한 발톱이 있고(유조류), 쇄골이 있고, 태반을 갖는 포유류
 - 적어도 한 쌍의 사지에서 가장 안쪽의 발가락이 서로 마주 볼 수 있어야함
 - 뼈로 안와가 형성되어 있음

2. 영장류 분류  

 - Non-Human Primate : 사람을 제외한 영장류
 - 연구 활용 영장류 : 구세계 원숭이, 신세계 원숭이

3. 영장류 실험 전 점검 사항

 1) 정말 영장류 실험이 필요한지? 다른 설치류나 dog, rabbit 등으로 가능한지 확인
    - In silico 분석이나 문헌조사 : DNA, RNA, and/or protein sequence homology, MOA(mode of action)  문헌 분석 
    - In vitro 분석이나 면역조직학적 분석 : MOA(mode of action) 기전 및 시료 분석법 검증
 2) 관계법령에 대한 이해
    - 환경부 : 야생생물 보호 및 관리에 관한 법률
    - 농림축산식품부 : 동물보호법, 가축전염병 예방법, 영장류 수입위생 조건
    - 식약처 : 실험동물에 관한 법률
 3) 어디 시설에서 진행할 것인지? (자체 시설 또는 외부 시설)
 4) 연구기간과 예산 고려  
 5) 영장류 실험 종료 신고 : 환경부 

마우스의 소변을 채취하는 방법으로는 케이지를 이용하거나 모래나 랩을 이용하는 등 도구를 이용하는 방법과 직접 마우스에서 채취하는 방법이 있습니다. 

1) 메타볼릭 케이지(Metabolic Cage)를 이용하는 방법
분변을 채취할 수 있게 제작된 메타볼릭 케이지에 마우스를 한 마리씩 넣어 일정시간동안 소변을 모으는 방법으로 비교적 간단하게 소변을 모을  수 있으나 메타볼릭 케이지를 구비해야 합니다.  또한 낯선 케이지에 장시간 마우스를 넣어두어야 하여 동물이 스트레스를 받을 수 있고 여러 마리의 소변을 채취할 경우 시간이 많이 소요됩니다. 
 

2) 랩을 이용하는 방법
종이 위에 랩을 깔고 그 위에 마우스를 올려놓은 후 마우스가 소변을 보면 피펫을 이용해 모으는 방법으로 한 마리 또는 여러 마리의 소변을 채취할 수 있습니다. 관찰하면서 바로 소변을 채취하게 되면 오염의 위험도가 떨어지고 한번에 여러 마리의 소변을 채취할 수 있는 장점이 있으나 랩이 찢어져 소변이 샐 수도 있습니다. 
 

3) 소수성의 모래를 이용하는 방법
소수성 모래(Lab Sand) 를 깔아 놓고 마우스를 올려두면 소변이 모래 위에 남아 있게 되어 이를 피펫을  이용하여 채취하는 방법으로 랩을 이용하는 방법과 비슷하지만 효율적이고 간단하며 오염이 생길 확률이 매우 적습니다.
 

4) 마우스에서 직접 채취하는 방법
마우스를 손으로 보정 후 하복부를 검지손가락을 이용하여 방광을 압박하여 소변이 나올 때 petri dish 혹은 cup에 직접 소변을 모으는 방법으로 소변의 양이 적을 수 있습니다.
 

5) 주사기를 이용하여 채취하는 방법
주사기를 이용하여 바로 마우스의 방광을 천자하여 소변을 직접 채취하는 방법으로, 가장 침습적이며 동물이 스트레스를 받을 가능성이 높고 주사바늘이 방광벽을 뚫을 때 혈액 등이 유입되어 샘플이 오염될 가능성이 있습니다.  

마우스에서 털이 빠지는 원인은 다양하며 그 중 피부에 별다른 병변이 보이지 않으면서 털이 빠지는 경우 개체간의 털뽑기 증상인 barbering에 의한 가능성을 확인해봐야 합니다.

Barbering은 우세한 마우스가 서열이 낮은 마우스의 털과 수염을 씹는 행동으로, 암컷에서 발생빈도가 높으며 유전적 배경의 영향을 받기도 하여 C57BL/6J와 같은 유전자형에서 더 많이 발생됩니다.

Barbering을 예방하기 위해서는 털을 뽑는 마우스를 분리해 주는 것이 가장 좋은 방법이며 동물들이 숨을 수 있는 마우스 하우스 등의 은신처와 씹고 뜯고 놀 수 있는 nesting용 enrichment 등을 공급해주는 방법도 추천됩니다. 

만일, 한 cage 내에 한마리를 제외하고 나머지 개체들은 모두 탈모가 있을 경우 탈모가 없는 마우스가 털을 뽑는 개체일 가능성이 높으므로 이 개체를 별도의 cage에 분리하는 것이 적절합니다. 
 

그 밖에도 탈모의 원인은 다양할 수 있습니다. C57BL/6와 같은 계통은 특발성 피부병변으로 궤양성 피부염(Ulcerative Dermatitis)이 일어나기도 하며 이로 인한 탈모가 발생되기도 합니다. 또한 스트레스로 인해서도 탈모가 유발될 수 있으며 계절, 습도, cage 환경, 사료와 같은 환경적 요소들도 탈모의 원인이 될 수 있습니다. 면역결핍 마우스에서 Corynebacterium bovis 등의 세균에 감염되었을 경우 탈모가 동반된 hyperkeratotic dermatitis가 발생되기도 합니다. 비타민 B 복합체 결핍, pantothenic acid(Vit B5) 결핍, 아연 결핍 등 비타민, 미네랄의 결핍으로도 탈모가 발생될 수 있으니 동물의 계통 특이성과 사육환경 등을 고려하여 탈모의 원인을 살펴보기 바랍니다. 
 

동물실험 기관에 상시고용수의사로 등록된 수의사가 있는 경우 수의사법 제12조에 따라 상시고용수의사에게 실험과정에 필요한 약품에 대한 처방전 발행을 요청하여 동물용의약품을 구매할 수 있습니다. 

만약 기관에 상시고용수의사가 없는 경우 동물병원과 같이 처방전을 발행할 수 있는 기관의 수의사와 협약을 맺어 처방전을 발행받는 방법 등을 고려할 수 있습니다.   

동물용 의약품에 대한 처방전 유효기간 및 약품처방 일수는 최대 7일이며 동물용 마취제(18종), 호르몬제(35종), 항생/항균제(32종), 생물학적 제제(21종), 전문지식이 필요한 동물의약품(47종) 등이 이에 해당됩니다.
 

순화는 실험동물이 운송으로 인한 스트레스가 심혈관, 내분비, 면역, 중추 신경 및 생식 시스템 등 생리학적 상태에 영향을 주어 연구 데이터에 영향을 끼치는 것을 완화시키는 과정입니다.

동물은 운송 과정 중 면역 기능이 억제되거나 변화되고 스트레스 호르몬인 코티솔의 증가, 혈청검사 결과의 변화, 사료 및 수분 섭취 감소, 체중감소, 심박수 그리고 체온 변화 등 많은 변화가 관찰됩니다.

보통 검역과 순화를 함께 진행하는 경우가 많으며 장기간 실험을 진행하거나 생존 수술을 진행하는 설치류는 최소 3일 이상의 순화 기관을 거쳐야 하며 개, 고양이, 토끼 등 설치류 이외의 동물들은 7일 이상의 순화 기간을 거치는 것이 바람직합니다.

따라서 동물을 반입하는 동물실험시행기관의 규정이나 표준작업서에 따라 적절한 순화 과정을 거쳐 동물을 충분히 안정화시키고 실험을 진행하시기 바랍니다. 
 

체외수정(IVF, In vitro fertilization) 등을 목적으로 마우스의 정자를 채취하기위해서는 마우스 정자 형성 과정에 대한 이해가 필요합니다. 

[정자 형성 과정]

- 고환, 정소(Testis): 정자의 형성, 수컷호르몬의 생성과 분비를 담당한다.  
- 부고환, 정소상체(Epididymis): 정소상체는 정액 중 수분을 흡수하여 정자 수를 농축시키고 정자를 수송하며, 이 과정 중 정자는 성숙하여 난자와 결합할 수 있는 수정능력을 획득한다. 성숙한 정자는 정소상체 미부(Cauda Epididymis)에 저장된다.
 

따라서 성숙한 정자가 저장되어 있는 정소상체 미부를 채취해야 합니다. 아래쪽의 사진에서 빨간 선으로 표시된 위치를 봉합사 등으로 묶은 후 그 윗부분을 자르면 정소상체 미부에 저장된 정자를 잘 보존하여 채취할 수 있습니다. 
 

[정자채취 방법]

정자 채취 방법은 다음과 같습니다.

1) 채취한 정소(Testis)를 해부 현미경 아래에 37 °C로 따뜻하게 준비해두고 한 쌍의 멸균된 겸자(forceps)를 사용하여 정소상체 미부를 고정합니다. 
2) 정소상체 미부(Cauda Epididymis)와 주변 조직에 멸균된 바늘(Needle)을 이용하여 부드럽게 구멍을 뚫어준 뒤 조직을 부드럽게 눌러 정자를 배출합니다. 부드럽고 빠르게 수행함으로써 각 정소상체 미부에서 가능한 많은 정자가 배출되도록 합니다. 
 

동물에게 고통이나 통증이 있을 것으로 예상되는 실험 과정이 있다면 고통 경감을 위하여 적절한 진통제 혹은 항생제를 처치해야 합니다. 연구의 목적에 맞게 적합한 약물을 선택하고 용량을 정해야 하겠습니다. 

일반적으로 사용할 수 있는 진통제는 Acetaminophen, Aspirin, Ibuprofen, Ketoprofen, Butorphanol, Buprenorphine 등이 있으며, 그 중에서 Butorphanol과 Buprenorphin는 마약성 진통제에 해당합니다. 일반적으로 관절염 발병시 나타날 수 있는 마우스의 고통에 대해 면역작용에 영향이 비교적 적다고 알려진 Acetaminophen을 사용할 수 있는데요. 이는 Acetaminophen이 NSAIDs와 COX-2 억제제보다 항염증 활성이 적기 때문입니다. 

투여 경로를 선택할 때에도 경구투여 혹은 주사를 이용할 경우에는 동물을 보정하는 과정에서 통증과 스트레스를 유발할 수 있으므로 음수나 사료에 섞어서 투여하는 것을 고려할 수 있습니다. 다만 이 방법을 이용할 경우 개체별로 섭취량이 다를 수 있으므로 장단점을 판단하여 선택해야 합니다.

그 외 관리방법으로 부드러운 깔짚을 이용하고 사료와 물에 접근이 용이하도록 cage 바닥에 내려주는 것도 도움이 될 수 있습니다. 

ARRIVE Guideline (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)

1) ARRIVE Guideline은 연구 결과에 대한 재현성(Reproducibility)을 높이고자 NC3Rs에서 개발한 가이드라인입니다. 재현성이란 같은 조건하에서 재실험하였을 때 기존 연구에서 보고되었던 결과가 동일하게 나타나는 것을 말하는데요. ARRIVE Guideline은 동물을 이용한 연구의 설계, 분석, 보고를 개선하여 재현성을 높이고자 동물실험 후 모든 과학 출판물에 포함되어야 할 최소한의 정보를 기술하는 20개의 항목으로 구성된 체크리스트 입니다. 

2) 이 가이드라인은 강제사항이 아니며 다양한 프로토콜에 따라 유연하게 사용될 수 있습니다. 

3) 실제 가이드라인은 Essential 10과 Recommended Set으로 구성되어 있습니다.  
  - Essential 10: 최소한의 기본 항목으로 이 정보가 없으면 결과의 신뢰성을 평가할 수 없다고 보고 있습니다. 
  - Recommended Set: 기본 항목 10가지를 보완하고 연구에 중요한 정보를 추가하는 데 사용할 수 있습니다. 

4) 동물 실험을 설계하는 단계에서 이 가이드라인을 참조하면 실험의 설계, bias 최소화, 표본 크기 및 통계 분석까지 신뢰할 수 있는 실험을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 논문 작성에 이 가이드라인을 적용할 경우 핵심적인 정보를 충분히 포함시킬 수 있어 중복실험을 방지하고 재현성을 높일 수 있습니다. 

5) 1,000개 이상의 journal과 단체가 ARRIVE Guideline을 적용할 것을 권장하고 있습니다. 

[Webinar: The ARRIVE guidelines 2.0 바로가기]

IPGTT 평가의 목적은 복강 내로 주사된 포도당이 체내에서 제거되는 정도를 측정하는 것으로 당 대사 이상 여부를 평가하는 것입니다. 이는 당뇨병이나 대사증후군과 같은 포도당 대사 장애를 감지하는 데 사용됩니다. 동물을 대략 16시간 동안 금식시키고, 복강내(IP) 주사로 포도당 용액을 투여하기 전에 공복 혈당 수준을 측정합니다. 그 후 다음 2시간 동안 다양한 시점에서 혈당 수치를 측정합니다.
 

1) 마우스를 사료나 분변 찌꺼기가 없는 깨끗한 cage에 옮겨 16시간 금식시키고 물만 공급한다.
2) 다음날 마우스를 실험실로 꺼내 와서 1두씩 깨끗한 cage로 옮기고, 각 마우스의 몸무게를 측정한다.
3) [개체별 포도당 주사액 준비] 각각 마우스에 복강 투여될 20% 포도당액이 2g glucose/kg으로 투여될 수 있도록 필요량을 계산하여 1ml 주사기에 뽑아 각 cage 앞에 둔다.

      volume (㎕) = 10 x body weight (g)

4) [마우스 꼬리 절단 및 공복 시 혈당 측정] 동물을 올릴 테이블을 알콜 스프레이하여 소독하고 마우스 꼬리를 알콜솜으로 소독한 후, 일회용 blade를 이용하여 마우스 꼬리 끝을 1mm 절단하면 나오는 혈액을 혈당측정 검사지의 노란창에 가져다 대어 혈액을 흡수시키고 5초 후 혈당 수치가 화면에 나타나면 기록한다.
5) [포도당 복강 투여] 미리 개체별로 뽑아 둔 포도당을 복강 투여한다.
6) [혈당측정] 투여 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후에 혈당을 측정, 매 측정 시 마다 마우스의 꼬리 끝부분의 응혈을 제거하고 마사지 하듯 눌러 다시 소량의 혈액이 나오도록 한다. 측정이 끝날 때마다 꼬리 끝부분을 거즈로 살짝 눌러주어 지혈한다.
7) 실험이 끝나고 출혈이 없는 것을 확인한 후, 마우스를 원래 케이지에 넣고 충분한 물과 사료를 공급한다.