기도 내 투여는 마우스가 마취된 상태에서 몸부림이나 재채기 등의 반사를 최소화하여 진행합니다.

[기도 내 투여 실험 절차]

1. 마우스를 마취하여 기도 투여 보정 장치에 안전하게 위치시킨다.
2. 보정 장치 와이어에 위쪽 앞니를 걸고 포셉으로 혀를 부드럽게 견인하여 기도를 확보한다.
3. 광원을 이용하여 마우스의 인후두 부위를 비춰서 해부학적 구조물을 확인한다.
4. 광원을 통해 성대 사이에 기도 개구부를 찾아서 해밀턴 주사기 바늘을 조심해서 주입한다.
5. 해밀턴 주사기의 약물을 주사한다.
6. 주사 후 바늘을 빼고 마우스를 cage로 옮겨서 마취에서 회복되는지 확인한다.

관절염을 유발하는 동물실험에서 마우스 무릎 관절에 치료를 위한 세포나 물질을 직접 적용하기 위해 관절강 내 투여 방법이 시행되며, 모든 절차는 IACUC의 승인을 받아야 합니다.

무릎관절에 물질을 투여하기 위해 외과적으로 피부 절개 후 관절에 접근하는 방법과 피부절개 없이 주사바늘을 이용하여 직접 주입하는 방법을 모두 사용하고 있습니다. 1회 투여량은 10ul 이하를 권장하며 투여하는 세포의 양이 더 중요한 변수입니다. 

[방법]

1. 동물을 심마취하고 투여부위인 무릎을 제모하고 소독한다.
2. 다리를 구부려 무릎 관절을 확인한다. 슬개골(Patella) 연골을 먼저 확인한 후 바로 아래 경골 고원(Tibial Plateau)을 확인한다. 
3. 슬개골과 경골고원 사이의 공간을 향해 피부면과 수직이 되도록 주사바늘을 진입시킨다.   
4. 투여물질을 직접 투여하거나 피부를 절개하여 관절강을 육안으로 확인한 후 주사침으로 주입한다.

그림 1. 투여부위

그림 2. 피부절개 투여법

그림 3. 비절개 투여법

여러 투여법 중 비교적 드물게 사용하는 방법이지만 랫드에서 피내투여 방법을 시행할 수 있습니다. 피내투여를 선택한 목적 및 적절한 절차에 대해서 IACUC의 승인을 받아야 합니다. 

마취 없이 시행할 경우, 주사침에 찔리거나 랫드에게 물리는 사고가 빈번한 절차이므로 주의해야 합니다. 마취는 회복이 빠른 호흡마취가 적절합니다. 투여물질이 유출되어 연구자에게 튀는 위험이 있으므로 보호안경, 안면보호구를 착용하는 것이 좋습니다. 투여물질의 MSDS에 대해 숙지해야 합니다. 1회 투여시 0.05-0.1ml 이하의 투여량이 적절하며 최대 6 부위(Site)에 주입하는 것을 권장합니다.

[투여경로별 투여 적정량과 주사침 게이지: NIH]

[방법]

* 그림 출처: Queen's University. University Animal Care Committee Standard Operating Procedure; SOP 10.9 - Intradermal Injection in Rats.

1. 모든 동물에게 새 멸균 주사침으로 투여를 진행하며, 다른 동물에게 사용한 주사침을 재활용하지 않습니다.
2. 보정틀을 이용하거나 마취를 시행합니다.
3. 포셉 또는 손으로 투여부위를 잘 잡아 투여 부위를 확보하고 주사바늘을 30° 이하의 각도로 피부 1mm깊이로 피내에 찔러 넣은 뒤 앞쪽으로 3-4mm 정도 피부와 수평하게 피내에 밀어 넣습니다. 
4. 바늘이 반대편으로 나오거나 피하로 진입하지 않도록 주의하며 천천히 주입합니다. 투여액의 양만큼 볼록하게 피부텐트(Tent)가 생기는 것을 확인하며 주사침을 바로 빼지 않고 5초 정도 유지한 후 제거합니다. 주사부위로 투여액이 누출되는지 확인합니다.
5. 귓바퀴에 투여할 경우 염색액을 사용하여 주입여부를 확인하는 방법도 사용됩니다.

[특징 및 주의사항]

여러 투여법 중 비교적 드물게 사용하는 방법이지만 마우스에서 피내투여 방법을 시행할 수 있습니다. 피내투여를 선택한 목적 및 적절한 절차에 대해서 IACUC의 승인을 받아야 합니다. 

마취 없이 시행할 경우, 주사침에 찔리거나 마우스에게 물리는 사고가 빈번한 절차이므로 주의해야 합니다. 마취는 회복이 빠른 호흡마취가 적절합니다. 투여물질이 유출되어 연구자에게 튀는 위험이 있으므로 보호안경, 안면보호구를 착용하는 것이 좋습니다. 투여물질의 MSDS에 대해 숙지해야 합니다. 1회 투여시 0.05ml 이하의 투여량이 적절하며 최대 6부위(Site)에 주입하는 것을 권장합니다.

[투여경로별 투여 적정량과 주사침 게이지: NIH]

[방법]

그림 1. Mouse and Neele Positioning with 'Bleb" Following Successful Injecrion into the Flank

그림 2. 마우스 피내투여 방법 (염색법)

* 그림출처: UQ Animal Ethics Committee - Standard Operating Procedure: LAB_041 Injections - Intradermal Injection in Mice and Rats. 

1. 모든 동물에게 새 멸균 주사침으로 투여를 진행하며 다른 동물에게 사용한 주사침을 재활용 하지 않습니다.
2. 보정틀을 이용하거나 마취를 시행합니다.
3. 포셉 또는 손으로 투여부위를 잘 잡아 투여 부위를 확보하고, 주사바늘을 30° 이하의 각도로 피부 1mm 깊이로 피내에 찔러 넣은 뒤 앞쪽으로 3-4mm 정도 피부와 수평하게 피내에 밀어 넣습니다. 
4. 바늘이 반대편으로 나오거나 피하로 진입하지 않도록 주의하며 천천히 주입합니다. 투여액의 양만큼  볼록하게 피부텐트(Tent)가 생기는 것을 확인하며 주사침을 바로 빼지 않고 5초 정도 유지한 후 제거합니다. 주사부위로 투여액이 누출되는지 확인합니다.
5. 귓바퀴에 투여할 경우 염색액을 사용하여 주입여부를 확인하는 방법도 사용됩니다.
 

[복강 투여]
설치류에서 사용되는 가장 일반적인 투여 방법

.

1. 2인 1조로 1명이 랫드의 겨드랑이와 등 부위 및 뒷다리를 양손으로 안정적으로 보정하고, 다른 사람은 약물투여 주사기를 준비한다.
2. 복부 장기를 표면에서 멀리 떨어뜨리기 위해 머리와 몸통이 아래로 향하게 위치시킨다.
3. 랫드의 정중선, 생식기 위치를 확인하여 투여 지점인 골반 바로 위 또는 2번째 유선 위치를 확인한다.
4. 주사하기 전 주사기 plunger를 살짝 뒤로 당겨서 바늘에 소변, 혈액, 소화물이 없는지 확인한다. 
5. 피부를 너무 얕게 찔러서 약물이 피하로 들어가지 않도록 주의하며, 복막을 통과하여 약물을 주사한다.
6. 주사 후 바늘을 빼고 약물이 빠져나오지 않는지 확인 후 랫드를 cage에 조심스럽게 옮겨준다.

[복강 투여] 
설치류에서 사용되는 가장 일반적인 투여 방법

1. 마우스를 한 손으로 안정적으로 보정한다.
2. 복부 장기를 표면에서 멀리 떨어뜨리기 위해 머리와 몸통이 아래로 향하게 위치시킨다.
3. 마우스의 정중선, 생식기 위치를 확인하여 투여 지점인 골반 바로 위 또는 2번째 유선 위치를 확인한다.
4. 주사하기 전 주사기 plunger를 살짝 뒤로 당겨서 바늘에 소변, 혈액, 소화물이 없는지 확인한다.
5. 피부를 너무 얕게 찔러서 약물이 피하로 들어가지 않도록 주의하며, 복막을 통과하여 약물을 주사한다.
6. 주사 후 바늘을 빼고 약물이 빠져나오지 않는지 확인 후 마우스를 cage에 조심스럽게 옮겨준다.

기니피그는 일반적으로 다른 설치류에서 사용되는 꼬리 정맥이 없어서 다른 부위에서 정맥 투여를 수행하게 되며 이를 위해서 고려해야 할 사항은 보정을 도와주는 보조자를 참여시킬지, 아니면 동물을 마취할지를 결정해야 합니다.

기니피그에서 사용할 수 있는 정맥 투여 부위로는 뒷발의 등쪽 뒤발허리정맥(Dorals Metatarsal Vein), 가장자리 귀정맥(Marginal Ear Vein), 목정맥(Jugular Vein) 등이 있고 실험자의 선호도에 따라 배면 음경정맥(Dorsolateral Vein of the Penis), 복부 표층 정맥(Superficial Veins of the Ventral Abdominal Wall), 내측 복재 정맥(Medial Saphenous Vein) 등을 활용할 수 있습니다. 

정맥 투여 시에는 ① 투여할 혈관 부위를 제모한 후 소독을 실시하며 ② 주사 바늘 사이즈는 투여하는 시료의 점성, 투여량 등에 따라 달라지는데 가능하면 가장 작은 주사침을 선택하여 기니피그의 통증을 적게 하는 것이 좋습니다. ③ 투여 후에는 지혈이 잘 되었는지 확인한 후 cage로 옮기도록 합니다. 

그림 1. 기니피그 정맥 투여 부위: Birck MM et al. J Vis Exp. 2014;(92):e51982.

[Tail Vein Injection이란?]

꼬리정맥은 랫드에서 정맥주사 시 가장 널리 사용되는 방법입니다. 꼬리의 왼쪽, 오른쪽에 있는 측면 미정맥이 다른 혈관보다 더 접근이 쉽습니다 (그림 1). 또한 마취없이 보정장치 내에서 투여도 가능한 방법입니다.

그림 1. 랫드 꼬리정맥의 모식도: The Laboratory Rat. 2000.

[방법]

1. 투여량은 총 혈액량의 10%를 초과할 수 없습니다. (랫드의 총 혈액량: 64mg/kg) 
2. 투여용액은 멸균상태여야 하고, 투여 전 실온으로 따뜻하게 합니다.
3. 무균적으로 주사기에 용액을 채우고 동물을 체중 측정을 한 후 고정 장치로 옮깁니다.
4. 열램프를 꼬리에 조사하거나 따뜻한 물에 20-30초 동안 담궈 혈관확장을 유도합니다. 이 때, 조직 손상을 줄 수 있는 과열 및 화상에 주의합니다. 성체 랫드는 클로로헥시딘을 적힌 거즈로 꼬리의 비늘과 먼지가 없도록 깨끗하게 닦아내 후 투여를 진행합니다.
5. 주사기에 투여용액을 채우고 공기층이 없도록 준비합니다. 동물 당 주사기와 바늘을 하나씩 사용합니다. 바늘은 날카로워야 하며 2번 시도한 후 교체해야 합니다.
6. 꼬리 끝을 살짝 들어올리고 부드럽게 돌려서 측면 꼬리정맥을 찾고 70% 알코올로 닦습니다. 흰색 랫드의 경우 정맥이 잘 관찰되지만 색이 있는 쥐의 경우 명확히 보이지 않을 수 있습니다. 추가 광원이 정맥을 찾는데 도움이 될 수 있습니다.
7. 주로 사용하지 않는(Non-Dominant) 손의 검지와 중지를 바늘을 삽입할 곳 위의 꼬리 주위를 잡고, 주사 부위 아래부분에는 엄지와 약지 사이로 잡습니다. 손가락에 약간의 압력과 긴장을 주어 팽팽하게 당깁니다 (그림 2).
8. 꼬리 뒤쪽 1/3지점에서 바늘의 경사면을 위로 가게 하고 바늘을 정맥과 거의 평행하게 하여 주사바늘을 혈관에 약 3-5mm 밀어 넣습니다. 주사바늘이 정맥 내에 들어간 것이 확인되면 보정을 하고 있던 손의 힘을 풀어 혈관에 가해지는 압력을 덜어줍니다. 
9. 바늘이 정맥에 잘 들어가면 혈액이 역류하여 주사기 내에 혈액이 보일 수도 있으나 항상 그런 것은 아닙니다 (그림 3).
10. 주사기의 투여용액을 천천히 투여합니다. 주사바늘이 정맥에 잘 삽입되어 있으면 저항감 없이 투여가 되며, 정맥외에 있을 경우 투여용액이 혈관 주위로 주입되어 피부가 창백해 집니다. 만약 첫번째 시도에 실패하였으면 조금 더 몸통쪽의 꼬리정맥에서 재투여합니다. 반대쪽 정맥에서 다시 시도할 수 있으나, 총 3회 실패 시 다른 훈련된 사람의 도움을 요청해야 합니다.
11. 정맥에서 바늘을 제거하고 투여부위를 거즈로 가볍게 눌러서 지혈합니다. 
12. 랫드를 cage에 복귀시키고 지혈을 확인하기 위해서 5-10분 동안 동물을 관찰합니다. 

그림 2. 미정맥 투여를 위한 보정: Intravenous Tail Vein Injections in the Adult Rat. 2021.

그림 3. 바늘이 혈관으로 들어가 피가 역류함.: SOP: Intravenous Injections in the Rat. 2017.

[추천하는 바늘, 주사기 및 투여액량]

동물에게 혈액 희석, 고통, 과도한 폐 및 심장에 부담을 주지 않기 위한 최대용량

* 1분 이내 투여가 원칙이며 투여물질이 혈액과 적합성이 있어야 하고, 점성이 높지 않아야 합니다.
** 5-10분정도 투여를 의미하며 투여물질이 자극성이 있을 때 사용하며, 날개가 달린 주사침을 이용할 수 있습니다.

[Tail Vein Injection이란?]
 

Tail Vein Injection(미정맥 주사)은 mouse에서 정맥 주사 시 가장 널리 사용되는 방법입니다. 꼬리의 왼쪽, 오른쪽에 있는 측면 꼬리 정맥을 사용해야 하고, 배측 꼬리 동맥보다 접근이 어려운 등쪽 꼬리 동맥에는 투여하지 않습니다 (그림 1). 마취없이 보정장치 내에서도 투여가 가능한 방법입니다.

그림 1. 마우스 꼬리 혈관 모식도: Liu P et al. Methods Mol Biol. 2021;2279:199-212.

[방법]

1. 투여용량은 총 혈액량의 10%를 초과할 수 없습니다 (마우스의 총 혈액량: 72ml/kg). 
2. 투여용액은 멸균상태여야 하고, 투여 전 실온으로 따뜻하게 합니다.
3. 무균적으로 주사기에 용액을 채우고 동물 체중을 측정 한 후 고정 장치로 옮깁니다.
4. 열램프를 꼬리에 조사하거나 따뜻한 물에 20-30초 동안 담군 후 혈관확장을 유도합니다. 이 때 조직 손상을 줄 수 있는 과열 및 화상에 주의합니다.
5. 주사기에 투여용액을 채우고 공기층이 없도록 준비합니다. 동물 당 주사기와 바늘을 하나씩 사용합니다. 바늘은 날카로워야 하며 2번 시도한 후 교체해야 합니다.
6. 꼬리 끝을 살짝 들어올리고 부드럽게 돌려서 측면 꼬리 정맥을 찾고 70% 알코올로 닦습니다.
7. 주로 사용하지 않는 손(Non-dominant Hand)의 검지와 중지를 주사부위 윗부분의 꼬리 주위를 잡고, 주사부위 아래부분에는 엄지와 약지 사이로 잡습니다. 손가락에 약간의 압력과 긴장을 주어 팽팽하게 당깁니다 (그림 2).
8. 꼬리 뒤쪽 1/3지점에서 바늘의 경사면을 위로 하고 바늘을 정맥과 거의 평행하게 하여 바늘을 혈관에 약 2-3mm 밀어 넣습니다. 이 때, 반대쪽 손으로 혈관을 누르고 있던 부위에 힘을 빼서 혈관에 가해지는 압력을 풀어줍니다 (그림 3).
9. 바늘이 정맥에 잘 들어가면 혈액이 역류하여 주사기 내에 혈액이 보일 수도 있으나 항상 보이는 것은 아닙니다 (그림 4).
10. 손가락으로 주사기 피스톤을 밀어 천천히 투여합니다. 바늘이 정맥에 삽입되었으면 저항감 없이 투여가 되며, 정맥이 아닌 곳에 있을 경우 투여 용액이 혈관 주위로 주입되어 피부가 창백해 집니다 (그림 5). 만약 첫번째 시도에 실패하였으면 조금 더 몸통쪽으로 가까운 곳에서 다시 투여를 진행합니다.
11. 정맥에서 바늘을 제거하고 투여 부위를 거즈로 가볍게 눌러서 지혈합니다. 
12. 마우스를 cage에 복귀시키고 지혈을 확인하기 위해서 5-10분 동안 동물을 관찰합니다. 

그림 2. 미정맥 투여를 위한 보정: Intravenous Tail Vein Injections in the Adult Mouse. 2021.

그림 3. 미정맥 투여 모식도: Liu P et al. Methods Mol Biol. 2021;2279:199-212.

그림 4. 바늘이 혈관으로 들어가 피가 역류함. : Intravenous Tail Vein Injections in the Adult Mouse. 2021.

그림 5. 투여실패로 인하여 피부가 창백해짐.: Intravenous Tail Vein Injections in the Adult Mouse. 2021.

[추천하는 바늘, 주사기 및 투여액량]

동물에게 혈액 희석, 고통, 과도한 폐 및 심장에 부담을 주지 않기 위한 최대용량

* 1분 이내 투여가 원칙이며 투여물질이 혈액과 적합성이 있어야 하며, 점성이 높지 않아야 합니다.
** 5-10분정도 투여를 의미하며 투여물질이 자극성이 있을 때 사용합니다. 날개가 달린 주사침을 사용할 수 있습니다.

랫드는 근육량이 적기 때문에 근육 주사는 일반적으로 활용되는 투여 부위는 아닙니다. 또한 투여된 물질로 인해 근육 섬유가 긴장되기 때문에 투여로 인한 통증이 유발될 수 있습니다. 근육 주사로 활용되는 주된 부위는 뒷다리 허벅지(Thigh)이며 투여 시 주사 바늘이 좌골신경(Sciatic Nerve)이나 혈관을 찌르지 않도록 주의해야 합니다. 

투여방법은 ① 랫드의 꼬리와 허벅지 보정한 후(보정방법: 보정틀 or 2인 1조 or 단독), ② 투여 부위를 소독용 알코올 솜을 이용하여 소독합니다. ③ 주사바늘 방향을 좌골신경이 다치지 않도록 꼬리 방면으로 향하게 하여 허벅지 근육에 찌른 후 주사기 피스톤을 잡아 당겨 바늘이 혈관 내에 들어가지 않은 것을 확인합니다. ④ 피스톤을 천천히 밀어서 물질을 투여한 후 물질이 새어 나오지 않도록 몇 초간 정지한 후 서서히 주사 바늘을 제거합니다. 

* 그림출처: Biomethodology for Laboratory Mice. https://theodora.com/rodent_laboratory/injections.html

랫드 근육 투여 시 투여용량 및 주의 사항은 다음과 같습니다.