제노프스에서 regeneration을 연구할 수 있는 방법으로는 제노프스 배아의 꼬리를 잘라 재생하는 것을 연구하는 방법이 사용됩니다. 제노프스의 꼬리에는 굉장히 많은 종류의 조직이 존재하고 있기 때문에 다양한 조직의 재생기전과 재생과정에서 조직간 일어나는 커뮤니케이션을 연구하기 굉장히 좋은 모델입니다. 실험은 특정 발생단계의 제노프스 배아 꼬리를 자른 후 재생되는 것을 확인하는 간단한 방법으로 이루어집니다.
 

* 그림출처: Love NR et al. BMC Dev Biol. 2011;11:70.

제노프스에서도 충분히 마우스와 비슷한 conditional knock-out을 수행할 수 있습니다. 이는 제노프스의 fate map을 확인한 후 이에 해당하는 세포에 유전자 조작을 수행하는 방법으로 진행됩니다. 제노프스를 연구하는 연구자들의 커뮤니티인 Xenbase에서 제노프스의 발생에 따른 fate map을 확인할 수 있습니다.
 

* 그림출처: Xenbase. https://www.xenbase.org/xenbase/static/anatomy/xenbasefate.jsp

또한 Photocaged Morpholino Oligomers를 사용하면 UV light를 사용하여 특정 시기에만 유전자 발현을 조절할 수 있습니다.

* 그림출처: Deiters A et al. J Am Chem Soc. 2010;132(44):15644-15650.

제노프스 배아가 성장할 때 머리 구조는 neural crest 라고 불리는 전구세포로부터 발생하게 됩니다. Neural crest는 발생과정에서 이동하여 결합조직(connective tissue), 뼈, 연골, 근육, 신경 등으로 분화하게 됩니다. 이 과정에서 뼈의 형성은 먼저 중간엽 줄기세포(MSC)가 연골세포로 분화하여 먼저 연골을 형성하고 이후 골화가 진행되어 뼈가 만들어 집니다.
 

* 그림출처: Translational Orthopaedic Biomaterials Interest Group. https://www.tobig.eu/bone-101/bone-101/bone-formation-and-remodeling/

그렇기 때문에 제노프스의 머리 형성과정에서 먼저 형성되는 연골조직은 연골 관련 연구를 진행하기 매우 좋은 모델입니다. 또한 2-cell stage에서 한쪽 세포에만 유전자 발현을 조절하게 되면 오른쪽 또는 왼쪽 중 한곳에서만 유전자 발현 조절로 인한 문제가 나타나기 때문에 연구를 진행하기에 매우 간편한 모델이 됩니다. 제노프스의 머리 구조 연구는 연골을 염색할 수 있는 Alcian Blue staining 기법을 이용하거나 항체를 이용한 염색 기법으로 심화연구를 진행할 수 있습니다.
 

* 그림출처: Dubey A et al. Curr Pathobiol Rep. 2017;5(1):79-92.

Nodal cilia는 left-right asymmetry를 형성하는 초기 배아에서 굉장히 중요한 기관입니다. 이런 nodal cilia는 사람에는 node에, mouse는 notochord에, zebrafish에서는 Kuffer’s vesicle에 존재한다고 알려져 있습니다. 제노프스에서 이런 nodal cilia를 연구하기 위해서는 gestrocoel roof plate(GRP) 를 확인하여야 합니다.

* 그림출처: Blum M et al. Development. 2014;141(8):1603-1613.

제노프스의 발생과정에서 온도는 배아의 발생 속도를 조절하는 가장 중요한 요소입니다. 유전자의 조작없이 온도 조절만으로 제노프스의 배아 성장 속도를 조절해 필요한 발생 단계를 쉽게 얻을 수 있습니다.

온도에 따른 제노프스 발생 단계까지 걸리는 시간은 제노프스 연구자 커뮤니티인 Xenbase에서 확인 가능합니다. 다만 morpholino를 사용한 유전자 발현 저해시 낮은 온도는 추천하지 않습니다. 이는 unspecific한 binding이 증가하여 특이적으로 binding 해야하는 morpholino의 작용을 저해시킬 가능성이 높기 때문입니다. 반대로 CRISPR/Cas9을 사용한 유전자 조작시에는 Xenopus laevis의 경우 처음 6시간동안 12℃ incubation 후 22℃ incubation이 더 효과적이라는 보고가 있습니다.
 

제노프스의 배아 표피는 사람의 기관지와 매우 유사한 구조를 가지고 있습니다. 사람의 기관지에 존재하고 있는 세포를 배아 단계의 표피에서 확인할 수 있기 때문에 절개 과정이 필요없이 쉽게 in vivo로 연구를 진행할 수 있다는 장점이 있습니다.

최근 발표된 논문에 따르면 기관지에 존재하는 세포들을 대부분 포함하고 있기 때문에 사람의 기관지에 작용하는 질병과 약물에 대한 연구가 굉장히 쉬운 모델입니다.

* 그림출처: Walentek P. Genesis. 2021;59(1-2):e23406.

이런 제노프스의 표피는 당화(Glycosylation)되어 있는 점액질을 분비한다고 보고되어 있고 당화된 단백질을 탐지할 수 있는 렉틴(Lectin)을 이용하여 확인할 수 있습니다. 렉틴을 이용한 ELISA 기법을 이용하면 제노프스가 분비한 점액질의 양을 확인 가능하고 항체의 사용이 어려운 제노프스의 표피를 렉틴 단백질을 사용하여 염색하면 점액질을 염색하여 확인 가능합니다.

* 그림출처: Sim HJ et al. PLoS One. 2018;13(2):e0193310.

제노프스에서 in situ hybridization 수행을 위한 probe 제작 방법은 주로 in vitro transcription을 이용하여 만들어집니다. In vitro transcription은 Sp6, T7과 같은 promoter를 사용하여 RNA를 합성하는 방법으로 합성방법은 2가지로 나눌 수 있습니다.

  1) 목표로 하는 염기서열을 Sp6 또는 T7 promoter를 가지고 있는 plasmid에 클로닝하여 합성

  2) PCR primer에 Sp6 또는 T7 염기서열을 포함시켜 목표로 하는 유전자 염기서열을 증폭시킨 후 합성

* 그림출처: NIH. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techish/

In situ hybridization의 시각화는 주로 2가지 방법을 이용하여 진행하게 됩니다.

  1) CISH(Chromogenic Mount In Situ Hybridization): probe가 붙어있는 위치에 화학작용으로 염색하여 확인하는 방법

  2) FISH(Fluorescence In Situ Hybridization): 형광을 이용하여 직접적으로 probe가 붙어있는 위치를 확인하는 방법

FISH 기법을 사용 시 형광염색과 같이 in situ hybridization의 결과를 확인할 수 있습니다.

* 그림출처: Kumar A. Today's Clinical Lab. https://www.clinicallab.com/fish-fluorescence-in-situ-hybridization-22054

Microinjection을 통한 유전자의 조작은 유전자의 역할과 기능을 이해하는데 큰 도움을 줍니다. Microinjection을 하기 위해서는 원하는 DNA를 초파리 알에 넣을 수 있는 기계 및 용액 등을 먼저 준비해야 합니다. Microinjection 기계는 원하는 DNA를 알에 찔러 넣을 수 있는 injection 바늘, 소량의 DNA를 일정하게 나오게 하는 injection pump, 알을 확대해서 볼 수 있는 현미경 등이 필요합니다. 

그림 1. Microinjection 기계. (A) Microinjection 용 현미경, (B) Injection 바늘, (C) Injection Pump

초파리 알을 얻기 위해서는 대략 300마리 정도의 성충이 필요합니다. 성충을 egg lay plate가 놓인 embryo collection chamber에 넣고 약 30분간 방치시켜 초파리가 알을 낳도록 유도합니다. 최초로 알을 받은 plate는 embryo injection에 사용하지 않고 버린 후, 새로운 egg lay plate를 교체하여 상온에서(19-24 ºC)에서 30분간 다시 알을 받고 이 알로 injection을 진행해야 합니다. 알을 받는 시간이 30분을 경과하면 embryo의 발생단계가 late stage 2를 지나게 되고, DNA를 주입해야 하는 알의 posterior 방향에 pole cell(생식세포)의 발생도 시작됩니다. Pole cell의 발생이 시작되면 DNA를 알에 제대로 주입시킬 수 없기에 시간을 잘 지켜서 injection을 해야 합니다.
 

그림 2. (A) Egg Lay Plate, (B) Embryo Collection Chamber, (C) Embryo 발생단계

* 그림출처: Gompel N, Schröder EA. Drosophila germline transformation. 2015. http://gompel.org/wp-content/uploads/2015/12/Drosophila-transformation-with-chorion.pdf

Egg lay plate에 받아진 알을 모아서 멸균수로 씻어준 후 egg의 chorion층을 제거하기 위해서 50% sodium hypochlorite 용액에 egg를 1분 동안 넣어준 후, 다시 멸균수를 이용하여 chorion이 제거된 egg를 씻어줍니다. 양면 테이프를 일정한 크기로 자른 후 Heptane 용액에 24-48시간 담구어 접착성 물질을 녹여낸 용액을 cover glass위에 도말하고 chorion이 제거된 egg를 일정한 방향으로 정렬한 후 상온에서 15-20분간 방치하여 건조 시킵니다. Chorion이 제거된 egg가 과도하게 건조되는 것을 방지하기 위해 Halocarbon oil (oil 700: oil 27 = 3:1)을 건조된 egg에 적당량을 도말하여 줍니다. Egg가 정렬되어 있는 cover glass를 테이프를 이용하여 slide glass 위로 다시 고정시킨 후 microinjection 장비에 고정시킵니다. 그리고 egg의 posterior 부위로 injection을 합니다. 

그림 3. Egg 정렬하는 방법

* 그림출처: Gompel N, Schröder EA. Drosophila germline transformation. 2015. http://gompel.org/wp-content/uploads/2015/12/Drosophila-transformation-with-chorion.pdf

Microinjection이 끝난 egg는 cover glass만 떼어내서 일반 배지로 옮겨 준 후 성체 초파리가 깨어날 때까지 24 °C에서 보관하면 됩니다. 깨어난 초파리는 목적에 맞게 스크리닝하여 원하는 초파리를 얻으면 됩니다.
 

그림 4. Injeciton 부위 및 방법

* 그림출처: (A) Ringrose L. Methods Mol Biol. 2009;561:3-19., (B) Gompel N, Schröder EA. Drosophila germline transformation. 2015. http://gompel.org/wp-content/uploads/2015/12/Drosophila-transformation-with-chorion.pdf

형질전환 초파리를 제작하기 위해서는 먼저 목적하는 초파리에 해당하는 벡터를 제작하고, 이 벡터를 초파리 egg에 microinjection을 한 후 성체가 깨어나면 특정 마커를 이용한 스크리닝을 통해서 목적하는 초파리를 얻으면 됩니다. 형질전환 초파리 제작을 위해 사용되는 벡터는 염색체에 삽입되는 방식에 따라 두 종류로 나눌 수 있습니다. 하나는 P-element를 이용하여 랜덤하게 염색체에 벡터를 삽입하여 다양한 insertion 라인을 얻는 방식 입니다. P-element는 야생 초파리에 존재하는 이동성 유전 요소(전이인자, transposon)로 초파리 염색체의 수천 개의 다른 위치에 무작위로 삽입될 수 있습니다. P-element의 전위를 촉매하는 transposase를 coding 하는 유전자와 transposase에 의해서 인식되는 P-element 말단의 특수 서열을 통해서 다양한 위치에 삽입될 수 있습니다(그림 1).
 

그림 1. P-element를 이용한 방법

* 그림출처: Szauter P. The Course BIOL 202 Genetics. https://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23.html

다른 한가지는 초파리 염색체의 특정 부위에 벡터를 삽입하는 방식입니다. PhiC31 recombination system은 bacteriophage에서 유래되었고 attP 와 attB 그리고 PhiC31 recombinase로 구성됩니다. pBPGUw 벡터에는 attB site가 내장되어 있고 injection 될 초파리에는 attP site가 삽입되어 있습니다. 관심 유전자를 attB donor 플라스미드에 클로닝하고 PhiC31 integrase 플라스미드를 같이 발현시켜주면 초파리 염색체의 attP 부위의 부위 특이적 재조합을 매개하면서 삽입이 이루어지게 됩니다(그림 2). 이 시스템은 attP landing site에 선택적으로 insertion 되는 특성으로 인해서 P-element와 달리 한번의 injection으로 한 종류의 형질전환 초파리 라인만 만들 수 있습니다.
 

그림 2. PhiC31 Recombination System을 이용한 방법

* 그림출처: BioCat. PhiC31 Integrase Vector System. https://www.biocat.com/categories/cloning-expression/mammalian-expression/phic31-integrase-system

Gal4-UAS 시스템은 효모로부터 도입된 전사 활성화 시스템으로 초파리 모델 연구에서 널리 사용되고 있습니다. 이 시스템은 특정 조직, 세포, 시기에서 정밀하게 유전자 발현을 조절할 수 있습니다.

Gal4-UAS 시스템의 작동 방식은 다음과 같습니다. Gal4인자는 특정한 DNA 서열인 Upstream Activation Sequence(UAS)를 인식하는 효모 전사 인자입니다. Gal4 단백질은 UAS 서열을 인식하고 UAS 서열에 특이적으로 결합합니다. Gal4 전사 인자가 특정 promoter에 의해 제어되는 초파리를 만들어서 사용하게 됩니다. UAS는 다수의 Gal4 결합 부위를 포함하는 짧은 DNA서열입니다. UAS 뒤에 과발현을 시키고 싶은 유전자(e.g. 특정ORF), knock-down을 하고 싶은 유전자(e.g. ORF-RNAi), 형광물질을 발현하는 유전자(e.g. GFP, RFP) 등을 위치시킨 후 초파리를 만들어 사용하게 됩니다.

Gal4 초파리와 UAS 초파리를 교배한 F1은 특정 promoter에 의해서 특정 조직, 시기에 발현되는 Gal4가 UAS에 결합하여 UAS 뒤에 위치한 관심 유전자를 발현할 수 있게 됩니다.