초파리는 완전 변태를 하는 곤충으로서 알부터 애벌레 시기를 지나 번데기가 되고 나아가 성충이 되는 life cycle을 가지고 있습니다 (그림 1). Gyeong Baeg의 “Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity”에 따르면 보통 애벌레는 크기에 따라 1령, 2령, 3령의 시기를 거치며 25℃, 70%의 습도 조건에서 1령에서 2령이 되는데 24시간, 2령에서 3령이 되는데 24시간이 걸립니다. 3령에서는 임계 무게(Critical Weight)에 도달하기 전까지 약 2-3일의 시간이 걸리며, 임계 무게를 거쳐 번데기가 되고 나서는 3-4일의 시간을 보내게 됩니다. 이런 과정을 거치고 난 후, 성체 초파리가 번데기에서 부화하게 되며 성체 초파리의 평균 수명은 약 50일로 알려져 있습니다. 물론 온도, 습도, 먹이 조건에 따라 수명이 많이 달라지며 보통 온도가 더 높거나 많이 낮으면 수명이 단축 될 수 있으나 25℃, 70% 습도의 평균 조건에서는 50일의 평균수명을 갖는다고 알려져 있습니다. 

그림 1. 초파리의 생활사

* 그림출처: Ong C et al. Nanotoxicology. 2015;9(3):396-403

초파리의 생활사를 보여주는 그림입니다. 25℃ 기준으로 알에서부터 1령 애벌레까지 하루가 걸리며 2령, 3령까지 각각 하루가 걸립니다. 3령 애벌레에서는 약 2-3일 정도 후에 임계무게에 도달하게 되고 번데기가 됩니다. 번데기에서 3-4일 정도 후에 성체파리가 됩니다.

초파리 애벌레가 사육병을 기어올라가는 이유는 보통 애벌레가 번데기가 되는 번데기화(Pupariation) 과정과 관련이 있으며 애벌레가 임계 무게(Critical Weight)에 도달했을 때, 더이상 외부 환경에 영향을 받지 않고 변태과정을 겪게 됩니다. 그리고 번데기가 되면 보통 움직이지 못하고 고정된 상태로 외부자극에 반응을 못하기 때문에 좀 더 안전한 장소를 찾게 됩니다. 이 때 포식자나 불리한 환경으로부터 자신을 보호하려는 본능적인 행동으로 인해 기어 올라가는 행동을 보입니다. 한 예로 Godoy-Herrera의 “Drosophila pupation behavior in the wild” 라는 논문에 의하면 다양한 초파리 종들이 번데기화를 위해 벽과 같은 높은 위치를 선호하는 경향이 있다는 설명을 하고 있습니다. 또한 번데기화 과정에서 빛을 피하는 행동인 광회피성 (Photophobic Behavior)을 보이는데 특정 신경회로를 통해 빛을 감지하고 어두운 환경으로 이동해 자리를 잡습니다. 이 또한 Harold Dowse의 “Pupation site selection in four drosophilid species: aggregation and contact” 연구에 따르면 포식자로부터 자신을 보호하기 위해 빛이 없는 높은 환경을 선호한다고 알려져 있습니다.

초파리 성체가 위로 올라가는 이유는 보통 negative geotaxis와 관련이 있습니다. 초파리는 중력을 인지해 반대방향으로 올라가려는 성질을 갖고 있으며 이를 이용한  많은 행동학적 실험들이 존재합니다. 한 예로 “climbing assay”가 있습니다 (그림 1). 일정 수의 초파리를 모은 후 탭을 통해 초파리를 바닥으로 내린 후 일정시간 동안 얼마나 올라가는지 확인을 하거나, 일정거리를 몇 초 동안 올라가는지 확인을 하는 방법입니다. 이런 행동학적 실험을 통해 초파리의 노화와 관련된 연구를 많이 진행하고 있으며 초파리의 신경퇴행성질환을 연구하기도 합니다. 

그림 1. 초파리의 행동학적 실험 (Climbing Assay) 

* 그림출처: Segu A. Climbing assay: A cost-effective way to investigate neurodegeneration in an undergraduate laboratory. IndiaBioscience.

당뇨는 보통 유전적으로 인슐린을 만들지 못하는 제 1형 당뇨와 고당분, 고지방과 불규칙한 식단으로 인해 생기는 제 2형 당뇨가 있습니다. 많은 연구팀들이 고지방 혹은 고당분식을 먹인 초파리에서 인간 당뇨병 환자들과 마찬가지로 인슐린 저항성, 혈당 상승, 지방 축적과 체중 증가 등의 현상이 나타난다는 사실을 보고했습니다. 고지방식을 먹은 암컷은 고지방식을 먹지 않은 암컷보다 적은 수의 알을 낳았고 잠을 잘 때도 더 자주 깼습니다. 한 가지 인간과 다른 점이 있다면 당분이 많은 음식을 섭취하는 것이 초파리의 수명에는 영향을 끼치지 않는다는 점입니다. 당분이 많은 음식을 섭취한 초파리는 당뇨병 환자와 비슷한 표현형을 나타냈음에도 정상 수명까지 살았습니다. 이와 유사하게 제 1형 당뇨 모델이라고 할 수 있는 인슐린 생성 세포를 제거한 초파리들은 인슐린을 제대로 만들어내지 못했고, 그로 인해 혈당 상승, 지방 축적 등의 표현형을 나타냈습니다. 하지만 이 초파리들은 정상 초파리보다 열흘 이상 더 오래 살았습니다.

이러한 현상이 일어나는 이유는 아마도 인간(혈관에 의해 유지되는 닫힌 순환계)과 초파리(혈관이 없는 열린 순환계)가 다른 순환계를 가지고 있기 때문일 가능성이 높습니다. 당뇨병은 동맥과 모세혈관의 손상을 일으키고 이는 심근경색, 심부전, 뇌졸중, 족부 괴사, 망막 병증과 신장 질환의 원인이 됩니다. 하지만 열린 순환계를 가지고 있는 초파리의 혈림프액(Hemolymph)은 방향에 관계없이 온몸으로 퍼져나갈 수 있어서 혈관이 막힘으로써 발생하는 질환으로부터 비교적 자유로울 수 있습니다. 

그림 1. 일반식 초파리(좌)와 고지방식을 섭취한 초파리(우)

* 그림출처:  Shirazi F et al. PLoS One. 2014;9(9):e108635.

그림 2. 제 1, 2형 당뇨 모델 초파리의 혈당

* 그림출처: Broughton SJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(8):3105-3110.

인슐린을 생성하지 못하는 제 1형 당뇨 모델(빨간 박스)과 고당분식을 먹인 제 2형 당뇨 모델(파란 박스) 초파리 모두 혈당의 증가를 보였습니다. 

그림 3. 인슐린 생성 세포를 제거한 초파리의 수명 (빨간색, 다른색: 대조군)

* 그림출처: Broughton SJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(8):3105-3110.

인슐린 생성 세포를 제거함으로써 인슐린을 만들지 못하는 제 1형 당뇨 모델 초파리는 정상 초파리에 비해 더 오래 살았습니다. 

우울증을 비롯한 정신질환에 대한 진단 방법을 아시나요? 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD) 같은 몇몇 질환을 제외하면 대부분은 스스로의 느끼는 감정이나 건강상태 등을 바탕으로 진단합니다. 초파리에게 ‘너 우울하니?’ 라고 물을 수는 없으니 아마도 파리의 행동 패턴으로부터 우울감의 유무를 판단해야 할 것입니다.

고통스럽지만 해결이 불가능한 상황을 자주 겪는 사람들은 우울감을 느낍니다. 다른 동물들도 마찬가지 입니다. 개, 쥐를 비롯해 제브라피쉬와 초파리 등의 모델동물들도 처음에는 고통에 대해 저항하다가 자신들의 행동이 소용 없다는 사실을 깨달을 만큼 고통이 반복적으로 가해지면 저항하기를 포기합니다. 우리는 이를 학습된 무기력이라 부릅니다. 미국 자넬리아 캠퍼스의 Ahrens Misha 연구팀은 우울증 치료제를 먹인 초파리들은 학습된 무기력 환경에 쉽게 굴복하지 않는다는 사실을 발견했습니다. 이러한 연구는 다른 모델동물인 제브라피쉬 모델에서도 교차 검증되었습니다. 초파리는 혼자 다니는 것보다 다른 초파리들과 함께 있는 것을 선호하고, 이러한 선호 현상은 시각과 후각에 의해 조절됩니다. 이런 맥락에서 아마 초파리도 우리만큼 복잡하지는 않겠지만 사회성, 그리고 그로 인해 발생하는 우울증이 있을 것으로 생각됩니다. 한 가지 예시로, 죽은 초파리를 목격하여 우울한 냄새를 풍기는 초파리들과는 초파리들도 교류를 기피하는 경향을 보였습니다. 또한 죽은 초파리들이 있는 배지에서 사육된 초파리들은 그렇지 않은 초파리들에 비해 비정상적인 대사 기능을 보였고 더 일찍 죽었습니다. 이러한 현상 역시 시각, 후각 그리고 우울증과 관련이 있다고 알려진 세로토닌 신호전달에 의해 조절되었습니다.
 

그림 1. 학습된 무기력 모델(좌)과 항우울제 처리를 통한 학습된 무기력의 개선 효과(우) 

* 그림출처: Ries AS et al. Nat Commun. 2017;8:15738.

무의미한 시도를 해야하는 상황에 지속적으로 노출된 초파리는 시도를 포기하는 모습을 보였습니다. 항우울제로 사용되는 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI)를 섭취한 초파리들은 학습된 무기력에 저항하는 모습을 보였습니다 (빨간 박스). 

그림 2. 죽은 초파리와 함께 자란 초파리와 그렇지 않은 초파리에 대한 선호도 실험

* 그림출처: Chakraborty TS et al. Nat Commun. 2019;10(1):2365.

야생형 초파리에게 죽은 초파리와 함께 자란 초파리 혹은 그렇지 않은 초파리 중 한 쪽을 선택하게 하면 이들은 죽은 초파리와 함께 자라지 않은 쪽을 더 선호했습니다 (우측). 

초파리 암 모델은 크게 두 가지가 있습니다. 첫번째는 초파리의 특정 기관, 예를 들면 눈이나 장 줄기세포에 종양유전자를 과량 발현시키는 방법이 있으며, 두번째는 마우스 모델을 이용한 연구 방법과 유사하게 암 조직을 초파리 복부에 이식하는 것입니다. 전자의 모델은 초파리의 유지와 실험이 비교적 간단하다는 장점과 종양유전자를 과발현한 특정 기관의 기능이 망가진다는 단점을 가지고 있습니다. 후자의 모델은 특정 기관의 기능 장애가 생기지 않는다는 장점이 있지만 암 모델을 만드는 것이 어렵다는 단점을 가집니다. 이러한 암 모델 초파리들은 인간 암 환자들과 비슷한 증상을 보입니다. 암 모델 초파리에서는 식욕 부진, 근육과 난소 등 다양한 기관들의 기능 장애가 생깁니다. 또한 배뇨 기능에 문제가 생기면서 그림 1에서 보는 것과 같이 복부가 부풀게 되고, 전반적인 염증 반응 역시 증가되어 있기 때문에 통상 암 모델 초파리들은 60-80일 가량을 사는 야생형 초파리들과는 달리 30-40일 가량밖에 살지 못합니다. 최근에는 뇌에서 발생하는 뇌종양의 일종인 교모세포종(Neuroblastoma) 모델도 개발되어 교모세포종의 원인과 경과에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있습니다. 

그림 1. 초파리 장 줄기세포 암 모델

* 그림출처: Kwon Y et al. Dev Cell. 2015;33(1):36-46.

그림 2. 초파리 암 이식 모델

* 그림출처: Kim J et al. Dev Cell. 2021;56(19):2712-2721.e4.

그림 3. 정상 초파리 유충의 뇌(좌)와 교모세포종 모델 유충의 뇌(우)

* 그림출처: Read RD et al. PLoS Genet. 2009;5(2):e1000374.

동물들의 1차적인 삶의 목표는 종족의 보존입니다. 이로부터 교미 후에 암컷에게서 일어나는 변화는 알을 낳는 것과 관계가 있을 것이라고 유추할 수 있습니다. 암컷의 교미 후 반응은 보통 수컷에서 만들어진 뒤 교미를 통해 암컷으로 이동하는 섹스 펩타이드(Sex Peptide) 신호 전달에 의해 유도됩니다. 이 펩타이드 신호 전달은 교미한 암컷의 단백질과 염분 섭취를 촉진하고 장을 더 길게 만듦으로써 암컷이 알을 더 잘 낳을 수 있게 합니다 (암컷은 교미 이전에는 하루에 약 30-40개, 교미 이후에는 하루에 80-100개의 알을 낳게 됩니다). 교미 이후 암컷들은 교미를 시도하는 수컷들을 발로 차거나 그들에게서 도망침으로써 교미를 거부하는 행동을 더 많이 보였고, 잠을 자는 시간도 줄어들었습니다. 또한 암컷은 한 번의 교미에도 수명이 약 10일 가량 줄어들었는데 초파리의 수명이 보통 60-80일 정도라는 것을 감안하면 이는 꽤 큰 차이라고 볼 수 있습니다.

그림1. 교미에 따른 암컷의 염화나트륨 섭취 변화 및 그에 따른 번식 능력 변화

* 그림출처: Walker SJ et al. Curr Biol. 2015;25(20):2621-2630.

교미를 한 암컷은 그렇지 않은 암컷에 비해 염화나트륨(NaCl) 섭취량이 증가했고 (좌), 염화나트륨의 섭취는 암컷의 번식 능력을 촉진하는 것으로 나타났습니다 (우). 

그림2. 암컷의 교미 경험에 의한 수명 변화

* 그림출처: Koliada A et al. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2020;246:110716.

단 한 번의 교미 경험이 있는 암컷(OM)과 한 마리의 수컷과 함께 키운 암컷(SP), 그리고 여러 마리의 수컷과 함께 키운 암컷(MP)은 교미 경험이 없는 암컷(V)에 비해 수명이 짧아진 것을 볼 수 있습니다. 

인간을 포함한 자연계의 거의 모든 동물들은 건강한 유전자를 후세에 남기고자 하는 목표를 가지고 있습니다. 사회문화적인 요소를 제외하면 가장 쉽게 생각할 수 있는 수컷들의 매력 포인트는 ‘건강한 신체’ 입니다. 대칭이 잘 갖추어진 신체를 가진 남성이 건강하고 매력적이라는 이야기를 들어보신 적이 있으실 겁니다. 한 연구 결과에 따르면, 대칭이 잘 갖추어진 남성과 그렇지 못한 남성이 입었던 티셔츠를 여성들에게 제공하고 어떤 쪽에 더 끌리는지 선택하게 했을 때 여성들은 대칭이 잘 갖추어진 남성의 티셔츠를 선택하는 경향을 보였습니다 (여성들은 남성의 얼굴을 알지 못했습니다). 반대로 남성들은 여성의 신체 대칭성에 영향을 받지 않고 티셔츠를 선택했습니다.

초파리 수컷의 교미 시도는 일련의 과정을 통해 이루어집니다. 암컷과 마주친 뒤, 앞다리로 암컷을 더듬습니다. 그리고 날개를 펼쳐 파르르 떨면서 애의 노래를 부르는데 암컷이 도망치지 않고 받아들인다면 교미가 성사됩니다 (그림 1).  암컷들은 어떤 수컷을 선호할까요? 건강하고 노련한 수컷 입니다. 초파리 암컷들도 인간과 비슷하게 대칭적이지 않은 수컷보다 대칭적인 수컷을 선호했습니다. 또한 교미 경험이 없는 수컷보다 교미 경험이 있는 수컷을 선호했습니다. 암컷의 청각 기관을 제거하자 이러한 선호 경향성이 사라지는 것으로 보아 암컷들은 날개를 흔들며 부르는 구애의 노래를 통해 수컷의 대칭성과 교미 경험을 파악한 것으로 생각됩니다.

그림 1. 초파리 교미 과정

* 그림출처:  Bontonou G et al. Insects. 2014;5(2):439-458.

그림 2. 수컷의 대칭성에 따른 암컷의 교미 선호도

* 그림출처:  Vijendravarma RK et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(13):e2116136119.

연구진은 임의로 선택된 2마리의 수컷 초파리를 암컷이 있는 공간에 투입한 뒤, 암컷이 어떤 초파리와 교미하는 것을 선호하는지 확인하였습니다. 암컷은 오른쪽 날개와 왼쪽 날개의 크기가 비슷한, 대칭적인 초파리와 교미하는 것을 선호했습니다. 

[노화와 관련된 바이오마커, β-Galactosidase 염색]

제브라피쉬 노화 연구에서 β-Galactosidase 염색은 세포 노화와 관련된 주요 바이오마커로 사용되고 있습니다.

노화된 세포에서는 pH 6.0에서 활성화되는 Senescence-Associated β-Galactosidase 형태의 β-Galactosidase가 나타납니다. 이 효소는 젊은 세포에서는 거의 검출되지 않지만 노화된 세포에서는 높은 활성도를 보입니다. β-Galactosidase 염색은 노화된 세포를 파란색으로 염색한 후 시각적 확인을 통해 다양한 조직의 노화 상태를 평가할 수 있습니다.

그림 1. 제브라피쉬의 유생 및 성체에서의 β-Galactosidase 염색

* 그림출처: Kishi S et al. PLoS Genet. 2008;4(8):e1000152.

[β-Galactosidase 염색 실험방법 ]

1. 샘플들을 fixation buffer에 넣고 4℃에서 overnight 합니다.
2. 다음날 샘플들을 4번에 걸쳐 PBS에 세척해 줍니다.
3. 37℃에서 24시간 *염색용액(Staining Solution, Reagent B, Reagent C, X-gal Solution, UPW)을 처리해 줍니다.
4. 다음날 3번에 걸쳐 PBS에 세척해 줍니다.
5. 모든 과정이 끝난 후 이미징을 하거나 PBS+0.1% NaN3 또는 70% Glycerol를 넣어 4℃에 보관해줍니다.

*Senescence Cell Histochemical Staining Kit (Sigma-Aldrich, CS0030-1KT)

[제브라피쉬 마이크로바이옴 연구 개요]

제브라피쉬도 다른 동물들과 마찬가지로 발생 중과 성체 모두 각각 단계별, 조직 특이적인 마이크로바이옴을 가지고 있으며 다양한 질병의 조건에서 장내불균형을 보입니다. 이를 기초로 하여, 제브라피쉬와 장내미생물의 상호작용을 통한 각종 생리조절과 질병발생 기전을 이해하고 유용 마이크로바이옴을 이용한 개선효과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있습니다.

1. 발생 및 조성: 수정 후 3일 입이 열리고 장관(Gastrointestinal Tract) 발생이 진행되면서 초기 마이크로바이옴의 정착이 시작됩니다. 발달단계별(라바, 청소년기;Juvenile, 성체) 특이적인 마이크로바이옴이 형성되며 이러한 형성과정에서 특히 Proteobacteria 문이 구성에서 급격한 변화를 보이는 것으로 알려져 있습니다.

2. 사람 마이크로바이옴과 비교: 사람과 제브라피쉬의 마이크로바이옴은 대부분의 마이크로바이옴 문(門, 6종류의 문)을 공유하지만 우점하는 종류에서 차이가 있습니다. (사람은 Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria가 대표적인 문인 반면 제브라피쉬는 Proteobacteria, Firmicutes, Fusobacterium이 대표적입니다.) 다만, 우점 마이크로바이옴의 종류가 다르더라도 미생물에 대한 기주(Host)의 반응은 사람과 제브라피쉬 간에 잘 보존되어 있다는 것이 알려져 있습니다.

3. 기능연구: 라바단계에서의 무균 구축조건과 미생물 또는 대사체 처리 조건이 잘 확립되어 있어 특정세균의 처리 및 정착을 통한 기능연구가 용이합니다. 따라서 제브라피쉬 모델의 장점인 돌연변이체 및 형질전환체 확보의 용이성, 실시간 고해상도 형광 이미징 등의  특징과 결합하여 기주와 마이크로바이옴 상호작용에 대한 새로운 시각의 기능연구를 수행할 수 있습니다.

[제브라피쉬 마이크로바이옴 연구 기법]

1. 장마이크로바이옴 분석 방법
- 16S rRNA sequencing: 제브라피쉬를 포함하여 일반적으로 마이크로바이옴 분석을 위하여 가장 일반적으로 사용하는 방법이며, 개체에서 DNA 추출 후 박테리아 특이적 16S rDNA의 일부를 증폭하여 염기서열을 확인함으로써 장마이크로바이옴의 다양성을 확인하는 방법입니다.

1) 제브라피쉬 라바 장의 분리 (6일 라바 기준): tricane으로 마취한 라바를 멸균된 침으로 항문근처를 고정하고 해부용 칼을 이용하여 아가미 부분을 절개 및 고정 후  전체 장을 위쪽에서부터 추출. (3~40마리 Pooling)
2) Lysis buffer에 넣고 bead beating으로 파쇄 후 리조자임 분해 뒤 Qiagen Dneasy Kit를 이용하여 DNA 추출
3) 추출된 DNA를 이용하여 V3-V4 부위를 PCR 증폭 후 일루미나 NGS 통해 염기서열 확보
4) 확보된 박테리아 염기서열을 QIIME 파이프라인 기반 생물분석학적 분석을 통해 각 조건의 샘플 내 및 샘플 간의 다양성 (각각 ɑ- diversity, 𝛽-diversity) 분석 및 후보미생물 도출

그림 1. 제브라피쉬 라바의 장 적출 예시

그림 2. 16S rRNA sequencing 분석 예시

* 그림출처: Lee JG et al. Microbiome. 2022;10(1):3.

2. 무균 제브라피쉬 라바 구축: 무균동물(Germ-free Animal)은 체표면 및 체내에 다른 생명체에 존재하지 않는 개체를 의미하며 마이크로바이옴과 기주의 상호작용 연구를 위한 주요한 자원으로 활용됩니다. 제브라피쉬의 경우, 외부 음식섭취가 필요없는 수정 후 7일 전후 라바 시기에 상대적으로 손쉽게 무균화가 가능한 장점이 있습니다. 최근 일부 연구에서 무균화된 성체 제브라피쉬를 사용한 보고가 있습니다. 

1) 수정란에 암포테리신, 암시실린, 카나마이신 항생제 조합의 배양액에서 28℃에서 약 5-6시간 배양
2) 0.1% 포비돈 아이오딘에 2분간 노출하여 1차 무균화 유도 후 세척
3) 0.003% 차아염소산나트륨에 20분간 담궈 2차 무균화 유도 후 세척 및 28℃에서 보관
4) 무균화 조건 검증을 위해 매일 호기조건 및 혐기조건에서 사육수 일부를 영양배지(예: TSA 배지)에 떨어뜨려 5일간 배양 후 미생물 생장 확인

그림 3. 제브라피쉬 라바 무균화 모식도

그림 4. 무균화 조건 검증을 위한 미생물 생장 확인 예시

제브라피쉬 배아는 어둠 조건에서 활발하게 움직이며 빛 조건에서 거의 움직이지 않는 특성을 가지고 있습니다. 이러한 제브라피쉬 배아의 행동특성을 DanioVision, Viewpoint와 같은 장비로 추적할 수 있으며 신경행동 기반의 다양한 end point를 이용하여 신경독성을 평가할 수 있습니다. 

* 신경행동의 end point: 총 움직인 거리, 수영속도(mm/s, freezing: ≤5, cruising: 5-20, bursting: ≥20)별 기간, 거리, 횟수 등

그림 1. 제브라피쉬 신경행동 분석절차