예쁜꼬마선충에서 주로 사용되는 RNAi(RNA간섭)기법으로는 크게 2가지가 있습니다.

1. dsRNA Microinjection
벌레의 몸에 직접 바늘을 통해 dsRNA를 주입하는 기법으로 다른 RNAi 방법에 비해 빠르고 효과적이라는 장점이 있지만 고가의 장비를 필요로 하고 실험자에게 숙련된 기술을 요구한다는 단점이 있습니다. 아래 그림과 같이 벌레의 생식선에 바늘을 찌른 후 dsRNA를 주입합니다. Microinjection에  관한 자세한 사항은 아래 사이트를 참고하시기 바랍니다.

* 참고 사이트: WormBook. Transfer and Microinjection.

그림 1.

* 그림출처: WormBook. Transfer and Microinjection.

그림 2. Microinjection 장비

* 그림출처: Daniel J et al. Microinjection into the gonads of C. elegans using Eppendorf InjectMan® 4. 2013.

2. Feeding RNAi
원하는 유전자를 E.coli를 통해 cloning하여 세균이 만든 dsRNA를 벌레가 섭취하게 하여 RNAi를 하는 기법입니다. Microinjection처럼 실험자에게 숙련된 기술을 요구하지 않고 간편하다는 장점이 있지만 cloning을 한 후 plate를 만들어야 하는 번거로움이 있으며 RNAi efficiency가 일정하지 않다는 단점이 있습니다. Feeding RNAi 기법에 대한 자세한 방법과 원리는 아래 출처의 내용 5.1.3을 참고하시기 바랍니다.

그림 3. 

* 그림출처: Elgeti DD. Characterization of potential modulators of the intestinal peptide transporter PEPT1 in Caenorhabditis elegans and human colon carcinoma cells. 2010.

유전자 편집 방법 중 하나인 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9은 원하는 타깃 유전자를 선택적으로 돌연변이 시켜버릴 수 있다는 장점이 있으며 RNA로 만들어진 ‘guide RNA’와 DNA를 절단하는 효소인 ‘Cas9’ 으로 이루어져 있습니다. 가이드 RNA는 DNA를 절단할 수 있는 기능을 갖는 Cas9 단백질과 복합체를 이루고, RNA는 상보적 염기 서열을 갖는 DNA에 결합합니다. 이러한 CRISPR/Cas9 system을 이용하여 복합체 및 선택 marker, 편집된 plasmid를 구성하고 이 injection mixture을 사용하여 선충에 미세주입하여 편집된 벌레를 screening 하는 단계를 거칩니다.

그림 1. CRISPR/Cas9 System

그림 2. Microinjection

그림 3. CRISPR/Cas9을 이용한 선충의 유전자 편집실험

* 그림출처: Harbin JP et al. MicroPubl Biol. 2023;2023:10.17912/micropub.biology.000968.

1. 안정적인 F1 자손을 얻기 위해 미세주입에 앞서 준비할 선충의 단계는 젊은 성충(Young Adult)으로 선택합니다.
2. 주입(Injection) 혼합물에 guide RNA와 복합체를 이룬 Cas9 단백질은 DNA template과 함께 생식샘(Gonad)에 직접 주입됩니다. 주입된 리보핵산단백질 복합체는 생식샘에서 작용하여 감수분열 난모세포 내에서 표적 이중 가닥 전달을 생성하고 주입된 모체로부터 직접 편집된 F1 자손을 생성할 수 있습니다. 성공적으로 주입된 자손의 선충을 식별하기 쉽도록, dpy-10(dumpy) 유전자를 편집하도록 설계된 가이드 RNA 및 DNA 복구(repair) 올리고뉴클레오타이드 포함합니다. 
3. 표준 PCR 방법을 사용하여 표적 부위에서 DNA를 증폭하고 전기영동을 통해 이동성 변화를 screening 합니다. 가능하다면 쉽게 감지할 수 있는 marker를 주입하여 형광 스테레오 현미경으로 F1 자손을 screening하여 성공적으로 주입된 P0 암컷을 식별합니다.
4. 새로운 돌연변이를 식별한 후 형제 교배를 사용하여 동형 접합체를 만듭니다. 또는 균형 돌연변이를 지닌 동물과 교배하여 안정적인 이형 접합체 균주를 확립합니다. 동형 접합체가 식별되면 돌연변이 선충의 고유한 특성을 연구할 수 있습니다.

예쁜꼬마선충은 길이 1mm 정도의 작은 생물로 야생에서는 썩은 과일이나 나뭇잎에 서식합니다. 실험실에서는 주로 60mm 크기의 작은 플라스틱 플레이트 안의 고체 배지에서 키우게 됩니다. 이 작은 선충은 다른 동물들에 비해 매우 단순한 신경구조를 가지고 있지만 여러 자극에 반응하여 움직입니다. 특히 후각신경이 발달하여 진동이나 특정 화학적 냄새 같은 자극에 민감하게 반응할 수 있습니다.

예쁜꼬마선충에 특정 자극(진동, 냄새 등)을 가하면 선충은 그 자극에 반응하여 현재 상태와 다른 행동을 보입니다. 이러한 자극이 지속적으로 노출되면 일정 시간이 지나면서 선충의 반응은 초기보다 감소하게 되는데 이를 습관화(Habituation)라고 합니다. 습관화는 반복적인 자극에 대해 생물체의 반응이 점차 약해지는 과정을 의미합니다. 이는 학습의 한 형태로 무의미한 자극에 불필요하게 에너지를 소모하지 않으려는 생물체의 적응 과정 중 하나로 볼 수 있습니다.

이러한 습관화 관찰 실험은 실험실 조건에서도 충분히 가능합니다. 습관화는 일종의 학습과 기억 실험으로 다양한 자극을 통해 선충의 반응을 관찰할 수 있습니다. 학습은 선충이 반응하는 거의 모든 자극에서 가능하며 대표적인 자극으로는 진동, 냄새, 물리적 자극, 온도 등이 있습니다.

선충은 외부 자극에 따라 다양한 반응을 보이지만, 특히 움직임의 변화를 쉽게 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 거의 움직이지 않는 선충에게 외부 자극을 주면 운동성이 증가하는 반응을 보일 수 있으며, 앞으로 움직이는 선충에 자극을 가했을 때는 반대로 움직이는 행동을 관찰할 수 있습니다. 또한 학습을 통해 선충이 싫어하는 자극을 형성한 후, 해당 자극을 주면 그 자극을 피하려는 움직임을 보이기도 합니다.

1. 진동 자극에 의한 습관화
진동 자극에 의한 습관화 실험은 다양한 방식으로 진행될 수 있지만 그 중에서도 지속적인 자극에 선충이 더 이상 반응하지 않는 현상을 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 선충이 있는 플레이트에 지속적으로 진동을 가하면 처음에는 선충이 반응하지만 시간이 지나면 선충에게 직접적인 물리적 자극을 가해도 더 이상 움직이지 않는 모습을 확인할 수 있습니다. 이후 진동이 멈추고 시간이 흐르면 선충은 점차 다시 자극에 반응하며 움직이기 시작합니다.

2. 냄새(화학감각) 자극에 의한 습관화
예쁜꼬마선충은 특정 화학물에 대해 선천적인 선호를 보입니다. 처음에는 그 화학물의 냄새에 반응해 움직이지만, 지속적으로 같은 냄새에 노출되면 점차 반응이 줄어들고, 결국 더 이상 반응하지 않게 됩니다. 그러나 냄새 자극이 사라지고 일정 시간이 지나면, 다시 그 냄새에 반응하는 모습을 보입니다.

3. 온도 자극에 의한 습관화
예쁜꼬마선충은 실험실 조건에서 일반적으로 20°C에서 배양됩니다. 그러나 30°C와 같은 더 높은 온도로 이동하면 운동성에 급격한 변화가 나타납니다. 하지만 사전에 30°C에서 30분간 노출된 선충은 20°C에서 30°C로 다시 옮겨졌을 때 이러한 급격한 운동성 변화를 보이지 않습니다. 이는 선충이 온도 변화에 적응하여 더 이상 급격한 반응을 하지 않게 된다는 것을 나타내며 온도 자극에 대한 습관화의 한 예로 볼 수 있습니다.

예쁜꼬마선충의 신경돌기는 손상 후 재생될 수 있습니다. 하지만 신경의 종류와 성장단계, 유전적 요인에 따라 그 능력이 달라집니다.

- 신경의 종류: 예쁜꼬마선충은 다양한 종류의 신경을 가지고 있습니다. 종류는 크게 감각신경, 운동신경, 연합신경으로 나누어지고 세부적으로는 더욱 다양한 신경들이 있습니다. 다양한 신경세포들은 서로 다른 축삭재생 능력을 가지고 있습니다.
- 성장 단계: 예쁜꼬마선충의 성장 단계는 유충 단계인 L1부터 L4, 그리고 성충(Adulthood) 단계로 나누어집니다. 선충은 유충과 성충 단계에서 모두 축삭재생이 꽤 잘 일어납니다. 하지만 노화가 일어나면서 이러한 축삭재생 능력도 떨어지게 됩니다.
- 유전적 요인: 여러 유전자들이 축삭재생에 관여합니다. 어떤 유전자들은 축삭재생을 돕지만 재생을 방해하는 유전자들도 존재합니다.

과학자들은 달라지는 축삭재생 능력을 평가할 때, 신경의 형태 또는 기능 회복을 관찰합니다. 다음과 같은 방법들로 축삭재생을 연구합니다.

- 신경의 형태: 레이저를 이용하여 신경의 축삭돌기를 손상시켜 자릅니다. 잘려진 부위로부터 축삭돌기가 자라날 수 있습니다. PLM 신경세포와 같은 감각신경의 경우 손상 후 다시 자라난 축삭돌기의 길이를 측정하고, 운동신경의 경우 손상 후 다시 VNC(Ventral Nerve Cord; 배쪽 신경삭)와 연결되는지 여부 등을 평가하여 재생 능력을 측정합니다.
- 신경의 기능: 외부 자극(예: touch, 냄새)에 대한 반응, 행동, 신경의 전기 신호 등을 통해 기능적으로 회복되는 수준을 평가합니다.

* 그림출처: Malinow RA et al. Front Cell Neurosci. 2019;13:348.

이 방법들을 통하여 예쁜꼬마선충의 신경돌기가 얼마나 재생되고 기능하는지 종합적으로 평가할 수 있습니다.

예쁜꼬마선충의 신경세포는 유형에 따라 감각신경(Sensory Neurons), 연합신경(Interneurons), 운동신경(Motor Neurons)으로 나뉩니다. 예쁜꼬마선충의 움직임은 감각신경이 다양한 환경 요인을 감지하고 이를 연합신경을 통해 하부 경로인 운동신경으로 전달함으로써 결정됩니다. 따라서 세 신경 집단 connection의 조화가 예쁜꼬마선충의 행동을 조절하기 때문에 신경세포의 유형에 따라 표현형들을 구분짓고 예쁜꼬마선충의 행동 변화를 관찰할 수 있습니다.

* 그림출처: Tsalik EL et al. J Neurobiol. 2003;56(2):178-197.

1. 감각신경 결함
예쁜꼬마선충의 감각신경의 결함은 먹이와 화합물 탐색 및 인지 실험을 통해 평가할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 먹이와 화합물 냄새 감지 능력은 chemotaxis assay와 food seeking assay라는 실험을 통해 평가됩니다. Chemotaxis assay와 food seeking assay는 선충이 환경에서 냄새 분자를 탐지하고 이에 반응하여 먹이로 이동하는 능력을 측정하는 방법입니다.  감각신경세포의 결함이 있는 예쁜꼬마선충은 냄새를 인지하지 못하기 때문에 먹이 또는 좋아하는 냄새의 화합물로 이동하지 못하게 됩니다.

* 그림출처: Suryawinata N et al. Sci Rep. 2024;14(1):5529.

이와 유사하게 예쁜꼬마선충이 먹이를 인지하고 먹이 주변에서 느려지는 행동 변화를 관찰하는 basal slowing assay로도 감각신경세포의 능력을 평가할 수 있습니다. 감각신경세포에 결함이 있는 예쁜꼬마선충은 먹이가 있는 환경을 인지하지 못하고 먹이를 찾기 위한 행동을 지속하게 되면서 운동성이 감소되지 않습니다.

* 그림출처: Lee Y et al. Ecotoxicol Environ Saf. 2023;255:114752.

예쁜꼬마선충은 화합물의 냄새 뿐만 아니라 touch, 압력, 진동과 같은 물리적 힘의 기계감각을 인지하는 신경세포도 보유하고 있습니다. 기계감각 실험은 예쁜꼬마선충이 물리적 자극을 감지하고 이에 반응하는 능력을 평가하는 방법입니다6. 정상적인 선충은 touch 자극에 즉각적으로 반응하여 빠르게 touch 반대 방향으로 이동하는 반면 기계감각 신경 세포가 손상된 선충은 반응을 하지 않고 계속 앞으로 이동합니다. 대표적으로 gentle touch assay와 harsh touch assay가 있으며, 각각에 자극 반응에 관여하는 신경세포의 종류가 다릅니다. 
 

* 그림출처: Koopman M et al. Nat Protoc. 2020;15(6):2071-2106.

2. 운동신경 결함
예쁜꼬마선충의 감각신경세포와 중간신경세포의 신호전달은 최종적으로 운동신경세포에 의해 행동으로 출력됩니다. 운동신경의 결함은 예쁜꼬마선충의 운동성을 제한합니다. 선충의 운동신경세포의 결함을 평가할 수 있는 실험들은 body bending assay, thrashing assay, locomotion assay 등이 있습니다. 예쁜꼬마선충이 고체 배지의 먹이 위에서 움직일 때 S자 형태의 동일한 경로를 보이며 이동하는데, body bending assay는 이 빈도를 측정하여 전반적인 운동성을 평가하는 방법입니다. Thrashing assay는 액체 배지에서 선충의 수영 능력을 평가하는 실험으로 일정 시간을 두고 수영 횟수를 계수하여 운동성을 평가합니다. Locomotion assay는 선충을 고체 배지 위에서 얼마나 멀리 이동하는지를 측정하는 실험입니다. 운동신경의 결함이 있는 예쁜꼬마선충은 움직임의 빈도가 현저히 감소하게 되고, 이동 거리가 줄어드는 등의 비정상적인 표현형을 나타냅니다. 

* 그림출처: Koopman M et al. Nat Protoc. 2020;15(6):2071-2106.

예쁜꼬마선충의 신경세포의 결함은 행동 수준에서 뿐만 아니라 세포 수준에서도 평가될 수 있습니다. 다른 동물 모델과 다르게 몸이 투명한 예쁜꼬마선충은 형광 단백질로 감각신경세포 또는 운동신경세포를 표지하여 손상과 퇴행을 현미경을 통해 실시간으로 관찰이 가능합니다. 신경세포의 결함 표현형으로는 대표적으로 신경세포의 신경돌기(축삭돌기 및 수상돌기)가 끊어지거나 신경돌기의 손상, 세포체의 구형화 등이 있습니다. 따라서 신경세포를 관찰하기에 적합한 예쁜꼬마선충은 신경세포의 결함에 따른 행동 표현형의 변화에 대한 직접적인 인과관계를 도출할 수 있습니다.

* 그림출처: Bijwadia SR et al. J Vis Exp. 2021;(177):10.3791/62894. 

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 자신이 싫어하는 화학물질에 대해 회피 행동을 보입니다. 예를 들어, 예쁜꼬마선충은 화학물질을 피하기 위해 뒤로 물러나거나 머리를 돌려 나아가는 방향을 바꿉니다. 이 회피행동을 정량적으로 측정하기 위해 다양한 실험 방법이 사용됩니다. 예를 들어, 화학 물질과 대조군을 떨어뜨린 배지에 예쁜꼬마선충 여러 마리를 놓고 얼마나 많은 선충이 해당 화학 물질을 피하는지 관찰할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 휘발성 물질이 아닌 경우에는 적용하기 어렵습니다. 이러한 경우에는 드롭 테스트 기법을 사용합니다. 

드롭 테스트는 휘발성이 아닌 물질에도 적용할 수 있을 뿐만 아니라 예쁜꼬마선충이 화학 물질에 즉각적으로 반응하는 모습을 관찰할 수 있어 기존의 회피 행동 관찰방법과 차별화됩니다. 이 실험을 통해 예쁜꼬마선충의 신경계가 특정 화학물질에 어떻게 반응하는지 이해하는데 도움이 됩니다.

[실험 기법 모식도]

1. 굶지 않은 건강한 어른 상태의 예쁜꼬마선충을 다량 준비하고 이들을 먹이(박테리아)가 존재하지 않는 깨끗한 plate로 이동시킵니다.
2. 예쁜꼬마선충이 앞으로 기어가고 있을 때, 유리 피펫을 사용해 버퍼 액체에 희석된 화학물질을 머리 앞에 떨어뜨려 예쁜꼬마선충이 화학물질과 접촉하게 해줍니다.
3. 화학물질과 접촉한 후, 해당 예쁜꼬마선충이 뒤로 물러 가는 거리와 반응 시간을 관찰하고 기록합니다. 

[실험 결과의 예시]

* 그림출처: Hong M et al. Curr Biol. 2017;27(20):3168-3177.e3.

본 그래프는 다양한 농도의 예쁜꼬마선충 페로몬 ascr#3을 사용해 실험한 결과입니다.

야생형 동물의 경우, 일반적인 상황에서(파란색) 10nM과 100nM의 페로몬은 각각 10-20%, 이보다 더 고농도인 300nM와 400nM에서는 60-70% 가량의 회피 반응을 보입니다.
그러나 예쁜꼬마선충이 어린 시절 페로몬에 노출된 경험이 있는 경우(빨간색), 기존에 비해 훨씬 높은 반응을 보입니다. 

이 실험 기법을 통하여 페로몬 회피반응에 기존의 경험이 중요함을 알 수 있습니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 자연 상태에서 주로 박테리아를 먹으며 생활합니다. 연구실에서는 이를 재현하기 위해 대장균(E. coli)을 배양하여 먹이로 제공하는데 그 중에서도 OP50이라는 변형된 대장균 균주가 예쁜꼬마선충의 성장과 번식에 적합하여 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충이 먹이를 섭취하는 방식은 매우 단순합니다. 입을 통해 대장균을 섭취한 후 장으로 이동시키면서 소화하여 필요한 영양소를 얻습니다. 이 섭식 과정을 연구하기 위해 여러 실험적 방법이 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 대장균이 포함한 배지 위에서 입으로 먹이를 섭취할 때 발생하는 인두의 펌핑(Pharyngeal Pumping)을 측정하는 방법이 있습니다. 이 방법은 실체현미경을 이용하여 비교적 접근하기 쉬운 실험 기법입니다.

반면에, 마이크로입자 이동 실험(Microsphere Movement Assay)은 기존의 섭식 행동 관찰법보다 먹이의 이동을 직접적으로 관찰이 가능합니다. 이 기법은 예쁜꼬마선충의 몸 내부에서 먹이가 어떻게 이동하는지를 시간에 따라 관찰할 수 있어 섭식 행동의 미세한 변화를 보다 정밀하게 분석할 수 있습니다. 이 방법은 특히 섭식 행동을 조절하는 특정 유전자의 역할을 이해하는 데 유용합니다.

[마이크로입자 이동 실험 기법의 모식도]

1. 예쁜꼬마선충의 먹이인 대장균(OP50)은 투명한 먹이이기 때문에 섭식 행동을 시각적으로 보기 위하여 형광마이크로입자를 사용합니다. 
2. 형광마이크로입자를 대장균과 9:1로 섞어서 NGM(Nematode Growth Medium) plate에 전체에 도말하여 실험 plate를 만듭니다. 
3. 잘 먹고 자라 성충이 된 예쁜꼬마선충을 형광마이크로입자가 섞인 실험 plate에 옮겨 20분 동안 먹입니다.
4. 20분 후 대장균(OP50)만 도말된 plate에 예쁜꼬마선충을 옮겨 형광 현미경을 통해 시간의 흐름에 따른 형광마이크로입자의 변화를 관찰합니다. 

[실험 결과의 예시]

이 사진들은 5분 동안 1분 간격으로 장내 형광마이크로입자의 형광 밝기(각 사진들의 왼쪽 아래, 녹색) 변화를 관찰한 결과입니다.

야생형(Wild Type)의 경우, 5분 동안 섭식행위를 통해 장 앞쪽 부분의 형광마이크로입자 밝기가 점점 줄어드는 현상을 관찰할 수 있습니다. 그러나 섭식 행위에 문제가 있는 돌연변이의 경우 (pezo-1 mutants), 5분이 지나도 여전히 장 앞쪽 부분에서 형광마이크로입자가 관찰됩니다.

이 실험 기법을 통하여 장 내부에서 섭식 행동을 조절할 수 있는 특정 유전자의 기능을 연구하는데 활용될 수 있습니다.

예쁜꼬마선충은 짧은 수명(약 2-3주)을 가지며 개체당 300마리 이상의 많은 자손을 낳아 노화 연구에 적합합니다. 또한, 유전적 조작이 용이하여 무작위 돌연변이, RNA 간섭(RNAi), CRISPR 유전자 편집 등을 통해 노화를 조절하는 유전자를 쉽게 식별할 수 있습니다.

수명 실험은 보통 20℃에서 NGM 플레이트에 성체 예쁜꼬마선충을 배양하여 수행합니다. 동일한 나이의 예쁜꼬마선충은 자손의 부화를 막기 위해 5-10μM FUDR(5-Fluoro-2′-deoxyuridine)이 포함된 plate로 옮겨지며 실험자는 2-3일에 한 번씩 생존여부를 측정합니다. FUDR을 사용하지 않는 경우에는 예쁜꼬마선충이 더 이상 알을 낳지 않을 때까지 새로운 plate로 옮겨줍니다. 생존여부 측정 시, 파열되거나 내부 부화가 발생하거나 plate를 벗어난 개체는 검열 처리됩니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서 최소 2명의 독립적인 실험자가 실험을 수행하며 실험에 사용한 모든 worm이 죽으면 통계 분석을 진행합니다. p-value는 log-rank(Mantel-Cox) test로 계산합니다. 

돌연변이체를 사용할 경우, 보통 예쁜꼬마선충의 대표적인 먹이인 OP50 박테리아를 사용합니다. RNAi 실험에서는 특정 유전자를 표적으로 하는 이중가닥 RNA를 발현하는 HT115 박테리아를 사용하며, 전 생활 단계에서 RNAi를 적용하거나 성체에만 적용하는 방법을 선택할 수 있습니다. 전 생활 단계에서 RNAi 처리시 발달 문제를 일으킬 경우 성체에만 적용하는 방법을 사용합니다. 

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans; C. elegans)은 노화 연구에 널리 사용되는 모델 생물로 여러 방법을 통해 건강 노화를 측정할 수 있습니다. 다음은 주요한 측정 방법들입니다.

[Swimming Assay]
이 방법은 예쁜꼬마선충의 운동 능력을 평가하는 방법으로 건강한 선충은 더 활발하고 빠르게 수영하는 반면 노화된 선충은 운동 능력이 감소하게 됩니다. 실험적으로는 선충을 액체 배지에 넣고 특정 시간 동안의 수영 속도나 빈도를 측정합니다. 이를 통해 노화에 따른 운동 기능 저하를 모니터링할 수 있습니다.
 

[Pumping Rate(섭식 속도)]
예쁜꼬마선충의 인두(Pharynx) pumping 속도를 측정하는 방법으로 섭식 속도는 노화와 밀접하게 연관되어 있습니다. Pumping 속도는 노화가 진행됨에 따라 감소하며 이를 통해 건강 상태를 평가할 수 있습니다. 섭식 속도를 측정하기 위해 선충의 인두가 수축하는 빈도를 관찰하여 기록합니다.

[Progeny Number Assay (자손 수 분석)]
자손의 수는 생식 건강의 지표로 사용되며 건강한 예쁜꼬마선충은 더 많은 자손을 생산합니다. 노화가 진행됨에 따라 자손 생산 능력이 감소하기 때문에 자손 수를 측정하는 것은 건강 노화의 중요한 지표가 됩니다. 이 방법은 일정 기간 동안 생성된 자손의 수를 계수하여 평가합니다.

이 외에도 Lifespan Assay, Antioxidant Assay(항산화 능력 측정), Lipid Accumulation Assay(지질 축적 분석) 등 다양한 방법들이 예쁜꼬마선충의 건강 노화를 평가하는데 사용됩니다. 각 방법들은 노화와 관련된 다양한 생리적 변화를 정량적으로 평가할 수 있어 노화 연구에서 중요한 도구로 활용됩니다.

C. elegans에는 자웅동체와 수컷, 2가지 성이 존재합니다. 교배를 할 때는 자웅동체와 수컷을 각각 사용해야 합니다. 먼저 bacteria가 seeding 되지 않은 NGM(Nematode Growth Media) plate의 중앙에 OP50 박테리아를 약간 올려놓습니다. 이는 C. elegans가 섭취하는 먹이로 박테리아를 중앙에만 배치함으로써 자웅동체와 수컷이 더 자주 만나 교배 효율을 높일 수 있습니다. 이후, 교배를 위해 자웅동체 L4 stage 또는 prefertile adult stage 자웅동체 한 마리와 수컷 여섯 마리를 같은 plate에 올려놓습니다. 자웅동체의 stage가 중요한 이유는 자웅동체가 자신의 sperm을 사용하기 전에 수컷의 sperm을 우선적으로 사용하도록 하기 위해서입니다. Mating이 제대로 이루어지지 않을 상황에 대비해 최소 3개의 plate를 준비하는 것이 좋습니다.

다음 날, 자웅동체와 수컷을 새로운 plate로 옮기고 만약 수컷이 사라졌다면 추가로 수컷을 넣어줍니다. 그 다음 날도 동일하게 자웅동체와 수컷을 새 plate로 옮긴 후, 3일째 되는 날에는 남아 있는 자웅동체와 수컷을 모두 제거하고 자웅동체가 낳은 알만 남깁니다. 이렇게 하면 교배 1, 2, 3일차에 자웅동체가 낳은 알만 남은 plate가 남습니다. 1일차에는 교배가 잘 이루어지지 않았을 수 있어 되도록 사용하지 않고, 2일차 plate에서 수컷과 자웅동체가 섞여서 태어난다면 교배가 성공적으로 이루어진 것입니다. 이 plate에서 필요한 수컷이나 자웅동체를 골라서 사용하면 됩니다.

수컷을 얻는 기본적인 방법은 WT(Wild Type) 수컷과 교배하여 수컷 자손을 얻는 것입니다. 하지만 연구실에 수컷이 전혀 없어서 교배가 불가능하다면 heat shock을 이용해 낮은 확률로 수컷을 얻을 수 있습니다. 이를 위해 bacteria가 seeding된 NGM plate 5개를 준비하고, 각 plate에 L4 stage의 자웅동체를 4-5마리씩 올려놓습니다. 이 plate들을 31℃에서 5-6시간 동안 incubation한 후 다시 20℃로 옮기면 됩니다. 이렇게 하면 태어나는 F1 자손 중 약 2-5%가 수컷으로 태어나므로 이 수컷을 골라내어 사용합니다.