- 형질전환 랫드를 제작하기 위해서는 수정란 단계(1-cell stage)에서 미세주입기술을 이용하여 유전자편집물질(gene-editing reagents)을 주입해야 합니다. 이를 위해 먼저 암컷 랫드에 과배란(superovulation)을 유도하여 다량의 수정란을 확보합니다.

- 과배란 유도를 위해, 암컷 랫드에 호르몬(PMSG: Pregnant Mare Serum Gonadotropin, hCG: human Chorionic Gonadotropin)을 투여합니다. 아래는 과배란을 통한 수정란 확보, 형질전환 랫드 제작하기 위한 전반적인 과정입니다.

1. PMSG 투여

· 4주령 이상의 암컷 랫드에 PMSG을 30 IU, IP(Intraperitoneal injection, 복강 내 주사)에 투여합니다.

2. hCG 투여 및 교배

· PMSG 투여 48시간 후에 hCG을 30 IU, IP에 투여한 후 수정란을 획득하기 위해 수컷 랫드와 교배합니다.

3. 수정란 확보(1-cell stage)

· 1-cell stage인 수정란을 확보하기 위해, hCG 투여 20-24시간 후에 암컷 랫드의 vaginal plug을 확인한 후 암컷 랫드를 희생하여, 난관팽대부(oviduct ampulla)를 분리합니다.

· 분리한 난관팽대부는 M2 배지에 담근 후, 난관팽대부를 찢어 난구세포(cumulus cell)가 붙어있는 난자를 방출하여 난자를 회수합니다.

· 수정란 확보 및 미세주입을 위해서는 난구세포가 깨끗이 제거된 난자의 상태가 되어야합니다. 난구세포를 제거하기 위해 hyaluronidase를 사용합니다.

· 난구세포가 깨끗이 제거된 난자는 mineral oil이 덮힌 Rat Ksom 배지 방울에서 CO2 배양기에 넣어 배양합니다.

4. 미세주입

· 수정란(1-cell stage)을 확인한 후, 미세주입기술을 활용하여 수정란의 전핵(pronucleus)에 유전자편집물질을 주입합니다.

5. 대리모 이식 및 유전자형 검사

· 미세주입이 완료된 수정란은 대리모에 이식합니다(대리모는 통상 미세주입 실험을 진행하기 하루 전날에 정관이 절제된 수컷에 암컷 랫드를 자연 교배한 후 실험 당일에 vaginal plug를 확인하여 준비합니다).

6. 대리모에 이식한 후로부터 20~22일 후 새끼가 태어나며, 각 개체의 genomic DNA를 이용하여 유전자형을 검사합니다.

7. 표적 유전자에 편집이 이루어진 랫드(founder, F0)는 정상 랫드(wild-type)와 교배하여 표적한 유전자가 다음 세대(F1)에 안정적으로 전달되었는지(germline transmission) 확인 후에 연구에 활용해야 합니다.

1. 재료

1) Oocyte 제공자용 8주령 암컷 랫드

2) 수용자(recipient)용 10-12주령 암컷 랫드

3) 12주령 이상 수컷 랫드

4) PB1 medium (R-P185)

5) P5 solution : 5% (v/v) propylene glycol in PB1

6) PEPeS solution : 10% (v/v) propylene glycol + 30% (v/v) ethylene glycol + 0.3 M sucrose + 20% (v/v) Percoll in PB1

7) SPB1 : 0.3 M sucrose in PB1

8) Rat KSOM (potassium simplex optimized medium)

9) Cryotubes

10) Crushed ice

11) Water bath (25°C, 50°C, 37°C 조절 가능)

12) Liquid nitrogen (LN₂) storage tank

2. 2-cell 배아 냉동법 (Vitrification of 2-cell embryos)

1) 실온(23 °C)에서 배아를 5% PG/PB1 (10–50 µL) 용액에 현탁하고, 10분 동안 3회 washing 한다.

2) 5 µL 배지 (10–20개의 배아 포함)를 Cryotube (MS-4501W) 바닥에 놓고, 0 °C에서 1분간 냉각한다.

3) 0 °C로 예냉한 PEPeS (10 µL) 를 Cryotube에 첨가하고 40초간 배양한다.

4) Cryotube를 즉시 LN₂에 담가 냉동 보존한다.

→ 배아가 냉동보존 용액에 처음 노출된 시점부터 LN₂에 들어가기까지 총 11분 40초 소요된다.

3. 해동법 (Thawing methods)

1) Cryotube를 25 °C에서 1분간 정치한다.

2) 50°C로 예열된 SPB1 (1 mL, 0.3 M sucrose in PB1) 을 첨가한다.

3) 배아를 dish로 옮겨 3–4분간 정치한다.

4) 이어서 Rat KSOM 으로 옮기고 정상 형태의 배아를 배양한다. (배양액은 매일 교환)

5) 혹은 1시간 배양 후 ET(embryo transfer) 를 수행한다. (난관당 8개 배아 이식)

1. 재료
 

1) Oocyte 제공자용 4-5주령 암컷 랫드

2) 수용자(recipient)용 10-15주령 암컷 랫드

3) 11-13주령 수컷 랫드

4) CPA (Sperm Cryoprotective Agent)

5) mHTF (modified Human Tubal Fluid medium; KYUDO Co. Ltd)

6) 35mm tissue culture dish

7) crushed ice 

8) Straws (크라이오 보관용) 및 Straw connector

9) syringe 및 seal 장치(impulse sealer) 

10) Tin plate 

11) Styrofoam float frame 

12) Liquid nitrogen 저장 탱크 및 캐니스터(triangle cassette)

2. 방법

1) mHTF (4mg/ml BSA)를 ice 에 정치해놓는다. 

2) 11-13 주령의 수컷 부고환관 미부 2 개를 회수한다 (마리 당, 15개의 straw를 만들 수 있다) 회수된 조직을 filter paper 에 놓는다. 

3) 지방조직과, 혈액을 제거하고, CPA 3ml 이 담긴 35mm dish 에 놓는다. 하나의 부고환관 미부를 사용할 경우는 1.5 ml 만 사용한다.

4) 미세가위로 절반으로 나눈 후, 다시 세밀하게 자른다.

5) 아래와 같이 4분간 정치한다 (수평).

6) 15도로 기울어진 다른 tin tray 에 아래와 같이 정치한다.

7) 2분마다 180도로 회전하며, 총 6분간 정치한다.

8) 6분 기간 동안, connector + 1ml syringe 후 30㎕ mHTF (4mg/ml BSA)를 흡입 (0oC) 후 1cm 공기를 흡입 후 대기한다 (수평).

  요령 : 
   - 말단으로부터 15mm, 25mm 부위에 네임펜으로 표시한다. 
   - mHTF (4mg/ml BSA) 30㎕를 15mm 까지 흡입.
   - 공기 (10mm)를 25mm까지 흡입
   - 결과적으로, 주사기 plunger 가 0.05ml 까지 다다르게 된다.

9) CPA-sperm dish를 또 회전시키고, 조직은 위로, sperm suspension 은 아래로 향하게 한다.

10) 150㎕의 sperm suspension을 빨아들인다 (0.2ml 의 눈금에 다다른다)

11) 처음에 흡입한 mHTF가 cotton plug 에 다다를 때까지 plunger를 당긴다.

12) sealing 한다.

13) straw를 30분간 ice 에 정치한다.

14) 30분 동안, 남아있는 sperm suspension을 37도에서 데운 후 검경한다.

15) 30분 동안, 얼음 위에 있는 tin plate 위에 sperm plate 철망을 놓는다.

16) straw를 sperm plate 로 옮긴다 (차가운 forcep을 이용하여 옮김).

17) 액체질소가 담긴 스티로폼 박스에 스티로폼 float을 띄운다.

18) float 에 sperm plate 철망을 장착 후 10분간 정치한다.

19) LN2에 straw를 담근 후, 미리 액체질소로 차가워진 triangle cassette 로 옮긴다.

20) 액체질소통에 넣는다.
 

1. 재료

 1) 6-8주령 암컷 랫드
 2) 12-14주령 수컷 랫드
 3) CARD Rat IVF medium (KYD-FR-002)
 4) CARD mHTF (KYD-008-02-EX or KYD-008-02EX-X5)
 5) Rat KOSM (R-R151)
 6) 0.1% hyaluronidase in M2
 7) 미네랄오일
 8) 35mm tissue culture dish

2. 정자의 수정능 획득
 

 1) 35mm dish에 100㎕ mHTF (frozen sperm 은 Rat IVF medium) drop을 미네랄오일로 덮은 후 37℃에서 1시간 평형시킨다.
 2) 부고환관 미부 두 개를 분리한다.
 3) Filter paper 에 부고환관을 놓고, 지방조직을 분리한다.
 4) 분리된 부고환관 두 개를 1) dish의 drop 옆 오일층으로 옮긴다.
 5) forcep 으로 부고환관을 고정 후 인슐린주사기 needle 로 조직 일부를 절제 후 mHTF로 옮긴다 (200,000 sperm per 100㎕)
 6) 한 시간 동안 수정능획득을 유도한다.

3. 체외수정

 1) 200ul mHTF medium 드랍 1 개에 미네랄오일을 도포 후 30분간 배양한다.
 2) 80ul mHTF medium 드랍 3개에 미네랄 오일을 도포 후 30분간 배양한다.
 3) 난관을 dish 1의 미네랄오일로 옮긴 후, needle로 난관을 절개 후 COC를 200ul drop 안으로 끌고 온다 (신속하게 수행한다)
 4) 5분간 배양 후 glass needle로 denuding을 한다.
 5) 난자를 dish 2에 옮긴다
 6) 수정능 획득이 완료된 정자 10ul를 난자 drop에 넣어준다.
 7) 22 시간 뒤에, 수정율을 측정한다. 두 개의 전핵이 보이거나, 정자의 꼬리가 세포질 내에 보임 
 8) 80ul 의 Rat KSOM drop 4 개를 준비 후 30분간 평형시킨다.
 9) 수정란을 옮긴 후 순차적 세정 후, 3번째 드랍에서 배양한다.
 10) 2-cell 이 형성되면, 네 번째 드랍에서 배양한다.

랫드 질도말 검사를 통해 번식주기를 어떻게 판별할 수 있나요? 

1. 재료

 1) 11-14주령 암컷 랫드

 2) 0.1% Crystal violet solution : 0.1g + 100ml DW

 3) 멸균 PBS or 0.9% saline

 4) 슬라이드 글라스

 5) 커버슬립

 6) DW

 7) Glycerol

 8) 멸균 면봉

2. 방법

 1) 스포이드에 1ml tip을 끼우고, 0.1cc 의 saline을 담는다

 2) 암컷 랫드를 고정(restraint)하고 꼬리를 들어 질 입구(vaginal opening)를 노출한다.

 3) Vagina 입구에서 채취한다 (7-8회 반복)

 4) Slide에 떨어뜨린 후 건조시킨다.

 5) 0.1% Crystal Violet 용액에 1분간 담가 염색한다

 6) DW wasing, 1분 수행한다.

 7) glycerol 20ul를 떨어뜨린 후 coverslip으로 덮는다

3. 판독

 Protestrus : 난원형 상피세포, 무핵세포 관찰

 Estrus : 각화 다각형 편평 상피세포, 군집 (cluster) 형태, 대부분 무핵세포

 Metestrus : 각화 편평 상피세포, 무핵세포 및 호중구 관찰

 Diestrus : 유핵 상피세포 등장. 진한 호중구 다수 관찰.

<그림1> McLean et al., Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp 2012;67:e4389.

랫드는 생리학적 특성이 인간과 유사하고, 체격이 크기 때문에 수술적·약리학적 실험에 용이하다는 장점이 있어 다양한 질환 연구에서 활용되고 있습니다. 랫드 질환 모델은 크게 Spontaneous 모델, 유전자 변형 모델, Chemical-induced 모델로 나눌 수 있습니다.

Spontaneous 모델은 특정 계통에서 자연적으로 발생한 돌연변이나 표현형을 활용하며, 대표적으로 Spontaneously hypertensive rat (SHR), Zucker rat, Bio-Breeder (BB) rat, Goto-Kakizaki (GK) rat 등이 있습니다.

유전자 변형 모델은 특정 유전자의 결손이나 과발현을 통해 질환을 유도하였으며, 대표적으로 Cyp3a1/2 KO rat, mRen2 rat, ApoE KO rat, p53 KO rat 등이 있습니다.

Chemical-induced 모델은 독성 물질이나 약리학적 자극을 이용하여 특정 장기 손상이나 병태생리를 재현하는 모델입니다. 대표적으로 Streptozotocin (STZ) rat model, Carbon tetrachloride (CCl₄) rat model, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) rat model, 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) rat model 등이 있습니다.

제시된 모델들은 각각의 범주에서 널리 활용되는 대표적인 예시로, 연구 목적에 따라 적절히 선택하여 활용될 수 있습니다.
 

SHR은 가장 자주 사용되는 고혈압 랫드 모델로, 고혈압 연구에서 큰 비중을 차지하는 모델입니다.  1963년 일본 Okakamoto, Aoki 연구팀이 개발한 랫드로, 정상 Wistar 랫드 중에서 혈압이 상대적으로 높은 개체들을 선발해 여러 세대 동안 반복적인 근친교배로 확립된 strain입니다.
SHR은 생후 5~6주경부터 혈압이 상승하여 수축기 혈압이 180~200mmHg에 도달하며 꾸준히 증가합니다.

이 랫드는 심장 비대, 심부전, 신장 기능 장애, 고혈압성 말단 기관 손상을 보입니다. 이 모델은 인간 고혈압의 병태생리를 연구하는 데 적합하며, 혈관 수축 및 이완 반응, 심장 비대, 심부전 등 심혈관 기능 변화를 평가하는 데 활용됩니다. 또한, 항고혈압제와 심혈관계 약물의 전임상 효능 및 안전성 평가에도 널리 사용됩니다.

2) 유전자 변형 모델

Cyp3a1/2 KO rat은 CYP450 효소 중 Cyp3a1과 Cyp3a2 유전자가 동시에 결손된 유전자 변형 모델입니다.

Cyp3a1/2는 사람 간에서 가장 풍부한 CYP 효소로, 임상에서 사용되는 약물의 절반 이상과 내인성 물질, 독성물질, 발암물질 등의 대사에 중요한 역할을 합니다. Cyp3a1/2 KO rat은 CRISPR-Cas9 기술을 이용해 Cyp3a1과 Cyp3a2 유전자를 동시에 제거하여 생성된 이중 결손 모델으로, 이 모델은 생존 가능하고 생식 능력을 유지하며, 혈중 지질, 포도당, 담즙산 등 주요 생리 지표에서 정상 범위를 보여 생리학적으로 이상이 없는 특성을 가집니다. 또한, CYP3A 기질 약물의 대사 능력이 현저히 감소함을 확인할 수 있었습니다. 이러한 특성으로 Cyp3a1/2 KO rat은 CYP3A 매개 약물 대사, 독성, 약리학적 연구에 유용하게 사용됩니다.
 

Apolipoprotein E, (ApoE)는 299개의 아미노산으로 이루어진 당단백질로, 콜레스테롤 운반과 항염증 작용에 핵심적인 역할을 합니다.

ApoE는 키로미크론(chylomicron)과 초저밀도 지질단백(very low-density lipoprotein) 잔류물을 간세포로 운반시키며, 혈중 콜레스테롤 조절에 관여합니다. ApoE KO rat은 CRISPR/Cas9 기술과 같은 유전자 편집을 통해 제작될 수 있습니다. ApoE KO은 혈중 지질 불균형으로 인해, 제3형 고지질단백혈증(type III hyperlipoproteinemia)과 가족성 이상지질혈증(familial dysbetalipoproteinemia)의 발생 위험을 높이며, 동맥경화 발생 위험을 증가시킵니다. 이 모델은 동맥경화 발생 기전 연구뿐만 아니라, 지질대사 이상, 심혈관 질환 및 그와 관련된 약물 평가 연구에도 활용됩니다.

3) Chemical-induced 모델

STZ은 췌장 β세포를 선택적으로 파괴하여 당뇨병을 유도하는 대표적인 화학물질로, 췌장의 β세포에 특이적으로 흡수되어 세포 독성을 나타냅니다. β세포 내에서는 주로 GLUT2를 통해 세포 내로 들어가며, GLUT2 발현이 적은 세포는 STZ에 내성을 가질 수 있습니다. STZ는 세포 내에서 DNA 손상을 유발하고, NAD+ 고갈로 세포 에너지를 감소시키며, 산화적 스트레스와 질소 산화물 생성을 증가시켜 세포사멸을 일으킵니다. 이러한 작용을 통해 β세포가 파괴되고, 인슐린 분비가 감소하며, 결과적으로 고혈당 상태와 당뇨 증상이 나타납니다. STZ의 β세포 선택성과 독성 정도는 용량, 성별, 나이, strain, 그리고 투여 경로에 따라 달라지며, 세포 내 GLUT2 발현이 핵심 결정 요소로 작용합니다. 이러한 STZ 투여를 통해 제 1형과 제 2형 당뇨병 모델을 다양하게 구축할 수 있습니다. 이 모델은 β세포 기능, 인슐린 분비 및 저항성, 혈당 조절, 합병증 연구뿐만 아니라 당뇨 치료제 개발과 당뇨 병태생리 비교 연구에도 활용 가능합니다.

DMBA는 강력한 발암물질이자 면역억제제로, 유방암 발생을 유도하는 대표적인 화학적 발암제로 활용됩니다.

DMBA rat model은 널리 사용되는 유방암 모델로, 랫드에서 발생한 종양은 인간 유방암과 유사한 병리학적 특성을 보여 연구 활용도가 높습니다. Huggins 등이 50~65일령 암컷 SD rat에 DMBA를 단회 경구 투여하여 유방암이 발생함을 보고하였습니다. DMBA는 간과 유방에서 DMBA-3,4-diol-1,2-epoxide (DMBA-DE) 형태로 활성화되어 조직 내 산화환원 균형을 교란하고 산화적 스트레스를 유발합니다. 이로 인해 생성된 활성산소종은 DNA 손상 및 세포 주기 단백질 손상을 초래하여 세포의 비정상적 증식과 성장으로 이어질 수 있습니다. 이 모델은 유방암 발생 기전 연구뿐만 아니라, 항암제 효능 평가, 산화적 스트레스 및 세포 신호 경로 분석 등 다양한 연구 분야에서 활용될 수 있습니다.

랫드의 평균 임신 기간은 약 21~23일로, 일반적으로 8-18마리의 새끼를 낳습니다. 랫드의 임신 여부 및 교배를 확인하는 방법은 다음과 같습니다.

<그림1> 랫드 육안 plug 관찰법 (Yugesh et al., 2023)

멸균한 일회용 피펫을 이용하여 0.9% Normal Saline 200ul를 흡입한 뒤, 피펫의 끝을 vaginal orifice 가까이에 대고, 깊숙이 삽입하지 않은 상태에서 식염수를 부드럽게 주입하여 세척한 후 세포를 피펫에 흡인합니다. 이후 멸균 유리 슬라이드 위에 2~3 방울 떨어뜨려 펼친 후, 저배율(10X)과 낮은 조명 조건에서 광학현미경으로 관찰합니다.

교미가 이루어진 경우, 세척액에서 정자를 직접 관찰할 수 있으며, 정자의 구조는 crystal violet stain을 통해 확인할 수 있습니다. 교미가 이루어진 경우, 아래 그림과 같이 세포 현탁액에서 정자가 직접 관찰되며, 세척액이 탁하게 보이는 특징을 가집니다.(A) 반대로 정자가 관찰되지 않는 경우에는 세척액이 맑게 보입니다(B).

<그림2> 질 세척액에서의 정자 존재 비교 예시 (Yugesh et al., 2023)

3) 복부 촉진법(Abdominal palpation method)

랫드의 등쪽을 한 손으로 부드럽게 잡고, 다른 손의 엄지손가락을 앞쪽 복부 중앙 1/3 지점에, 나머지 세 손가락은 복부 중앙선에 위치시킵니다. 세 손가락을 부드럽게 위쪽과 측면으로 눌러, 엄지와 세 손가락 사이를 통해 배아를 촉진합니다.

랫드의 발정 주기는 평균 4~5일이며, 발정전기(Proestrus), 발정기(Estrus), 발정후기(Metestrus), 발정간기(Diestrus)의 네 단계로 구분됩니다.

각 단계는 아래 그림과 같이, 랫드의 질 세포 형태의 변화로 확인할 수 있습니다.

[FAQ 동영상으로 보기: 바로가기]

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