Extrachromosomal array를 염색체에 삽입한 것을 integrated line이라고 부르는데, integrated line을 얻으면 매 세대마다 형질전환종을 고르지 않아도 Mendelian genetics에 따라 transgene이 다음 세대로 100% 전달되는 장점이 있습니다.

삽입하는 방법은 UV나 감마선 irradiation 등으로 염색체 DNA에 double strand break를 만들면 repair 과정에서 가끔 transgene이 삽입되는 경우가 있는데 이 것이 일어난 선충을 찾으면 됩니다.

이는 발생할 확률이 적은 편에 해당하므로 UV-irradiation 후 나오는 F1을 충분히 확보하여 다음 세대로 transgene이 전달되는 양상을 관찰하면서 integrated strain을 찾아야 합니다.

주입된 DNA는 선충의 생식세포 전구체에 유입되어 그 다음 세대(F1)에 co-injection marker 표현형이 나타나는데, 이 중 5-10%만 F2 세대로 transgene이 전달됩니다.

F2 이후로부터는 더 안정적으로 transgene이 다음 세대로 전달되므로 F2 이후의 선충들을 사용하면 됩니다.

Expression plasmid는 일반적으로 프로모터::유전자::3’UTR(비번역 영역) 구조로 설계합니다.

예쁜꼬마선충의 경우 보통 pPD95.75와 같은 C. elegans expression vector를 기본 골격으로 사용하며 Addgene에서 구입할 수 있습니다.

DNA 주입은 선충의 생식세포 전구체가 있는 gonad syncytium에 주입하게 됩니다.

이 곳은 세포막이 완전히 닫히지 않은 생식세포 전구체들이 모여있어서 DNA가 세포 안으로 들어가기 용이합니다. Gonad syncytium은 길게 늘어져서 양쪽으로 접혀있는 gonad(생식선)에서 distal부분에 있고 벌집과 같이 핵이 표면에 고르게 분포되어 있는 모양으로 식별합니다.

제대로 주입이 되었으면 용액이 생식선을 따라 퍼지며 생식선이 부푸는 모습을 관찰할 수 있습니다.

미세주입 바늘은 borosilicate glass capillary(유리 모세관)를 needle puller 장비를 이용하여 만듭니다. Needle puller 장비는 열로 유리관 한 가운데를 가열하면서 양쪽으로 당겨 가느다란 바늘을 두 개 뽑아내는 장치입니다.

이러한 needle puller 장비로는 Sutter Instruments P-87이나 P-97, 또는 Narashige사에서 나오는 제품이 있습니다. Sutter Instrument는 전기생리학 실험에 사용하는 microelectrode를 만드는 장비로서 당기는 힘이나 속도를 미세하게 조절할 수 있다는 장점이 있습니다.

Narashige사 제품은 중력으로 당겨 바늘을 만드는 원리로서, 장비가 더 저렴하고 사용법이 간단하다는 장점이 있으나 Sutter Instrument 제품만큼의 미세한 힘조절은 불가능하다는 단점이 있습니다. 자세한 제품 정보나 세팅 등은 reference를 참고하시길 바랍니다.

DNA 용액 구성은, 도입할 유전자를 적절한 프로모터에 연결한 플라즈미드와 co-injection marker 플라즈미드로 이루어집니다.

각각의 DNA를 물에 희석하여 총 10ng/ul의 농도로 준비하는데, 이 때 각각의 플라즈미드 농도는 유전자와 프로모터에 따라 적정량이 다를 수 있으니 같은 플라즈미드나 프로모터를 사용한 다른 논문을 참조하시면 좋습니다.

때로는 filler DNA를 넣어주어 10ng/ul의 농도의 총량을 맞출 수도 있습니다. 이 때 쓰는 filler DNA는 선충세포에서 읽히지 않은 DNA로서 DNA ladder, 또는 empty vector 등이 쓰입니다. DNA 용액은 순도가 높을 수록 injection 효율이 좋아지므로 높은 purity를 보장하는 miniprep 또는 midi, maxiprep kit를 사용하는 것이 좋습니다.

형질전환종은 주입한 DNA를 일부러 염색체에 삽입하는 과정을 거치지 않은 한 extrachromosomal array로서 존재하게 되고 이는 다음 세대에 100% 전달되지 않기 때문에 배양시 매 세대마다 형질전환 DNA를 가지고 있는 선충을 골라주는 과정을 거쳐야 합니다.

이 때 형질전환종 식별 방법은 co-injection marker의 형질을 찾는 것인데, co-injection marker는 시각적으로 형질전환종을 식별이 가능하게끔 특정 부분에 형광단백질이 발현하게 하거나 움직임의 변화를 가져오는 유전자를 지닌 플라즈미드를 사용합니다.

사용하는 형질전환종의 genotype 정보를 참고하여 해당 형질을 골라 배양하면 됩니다.

외부 DNA가 플라즈미드 형태로 주입되면 해당 DNA는 여러 개의 복제본이 서로 연결되어 뭉친 형태로 세포핵에 존재합니다.

이를 extrachromosomal array라고 합니다.

이로 인해 나타나는 현상으로서 주의해야 할 것은:

돌연변이는 기존 유전자를 손상시키거나 변형시키는 반면, 형질전환은 외래 DNA를 추가로 주입해서 새로운 기능이나 발현을 유도합니다.

즉, 돌연변이는 파괴(disruption), 형질전환은 추가(addition) 방식입니다.

예쁜꼬마선충이 원래 발현하지 않은 외부 유전자를 발현하고 싶을 때, 또는 특정 유전자 변이종에서 해당 유전자를 특정 부분에만 다시 발현시키고 싶을 때 형질전환종을 제작하게 됩니다.

또 다른 경우는, 조직이나 세포별 유전자 발현양을 알고 싶을 경우, 예쁜꼬마선충은 특정 조직이나 기관을 해부하여 분리하는 것이 어렵기 때문에, western blot 이나 qPCR 대신 해당 유전자 프로모터에 형광단백질을 발현시켜 형광단백질의 양을 in vivo에서 측정함으로서 발현양을 가늠합니다.