제노프스 알을 실험에 사용하기 위해서는 알을 감싸고 있는 젤리층(Jelly Coat)을 제거해야 합니다. 이 과정을 'Dejellying'이라고 합니다. 방법은 다음과 같습니다.

1. 젤리층 제거(Dejellying) 과정
 1) 2% 시스테인 용액(pH 7.8-8.0)을 사용합니다.
 2) 알을 시스테인 용액에 넣고 부드럽게 섞어줍니다.
 3) 3-5분 정도 처리하면 젤리층이 녹기 시작합니다. 젤리층이 녹기 시작하면 배아들이 더 가깝게 모이기 시작합니다.

2. 주의사항
 1) 용액을 섞을 때 너무 세게 휘저으면 안 됩니다. 이는 배아의 전후축 중복을 유발할 수 있습니다.
 2) 시스테인 용액에 너무 오래 두면 배아가 손상될 수 있으므로 주의해야 합니다.

3. 세척
젤리층이 제거되면 즉시 시스테인 용액을 따라내고 1/3× MMR 용액으로 5회 정도 철저히 세척합니다.

4. 보관
세척 후 X. laevis 배아는 16°C에서, X. tropicalis 배아는 23°C에서 보관할 수 있습니다.

5. 시간 고려
X. laevis의 경우 젤리층 제거 후 첫 번째 세포 분열까지 30-40분, X. tropicalis의 경우 25-30분 정도 소요됩니다.

[제노프스 개체의 성별을 구분하는 방법]

1. 유전자 검사 방법
 - DM-W 유전자를 target으로 하는 PCR 분석을 통해 성별을 판별할 수 있습니다. DM-W 유전자는 암컷에서만 발현되는 W 염색체 연관 유전자입니다. TaqMan probe를 이용한 실시간 PCR 방법으로 DM-W 유전자의 존재 여부를 확인합니다.

2. 표현형적 방법
 1) 성체의 경우 크기 차이로 구분 가능합니다. 암컷이 수컷보다 더 큽니다.
 2) 수컷은 손과 팔에 검은 반점이 있습니다. 이는 암컷을 붙잡는데 도움이 됩니다.
 3) 암컷은 엉덩이 같은 불룩한 부분이 뒷다리 위에 있습니다. 이는 내부의 알 위치를 나타냅니다.
 4) 수컷은 목구멍 부위의 피부가 얇고 주름져 있습니다. 이는 울음주머니 때문입니다.
 

유전자 검사 방법은 표현형이 발달하지 않은 어린 개체나 성 전환 개체의 성별도 정확히 판별할 수 있어 유용합니다.
특히 TaqMan 분석법은 100% 정확도로 유전적 성별을 판별할 수 있는 것으로 보고되었습니다.

[제노프스 정소 보관과 정자 Cryopreservation]

1. 제노프스 정소 보관
- 일반적으로 제노프스 정소는 testis buffer에 담아 16°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

2. 정소 보관 기간 연장 방법
- Cryopreservation: 정소에서 정자를 추출하여 동결보존하면 장기간 보관할 수 있습니다.
- 동결보존 과정:
 1) 정자 추출
 2) 적절한 동결보존액(예: glycerol 포함) 첨가
 3) 완만동결법 사용: 천천히 온도를 낮춰 얼음결정 형성 최소화
 4) 액체질소에 보관 (-196°C)

3. Cryopreservation의 장점
 1) 장기간 보관 가능 (수개월에서 수년)
 2) 유전적 변이 최소화
 3) 필요할 때마다 해동하여 사용 가능

[3가지 기존 Protocol]

1. Sargent and Mohun 방법
 1) 동결보호제: sucrose와 난황 기반 용액 사용
 2) 냉각 방법: 드라이아이스-에탄올 배스에서 동결

2. Mansour et al. 방법
 1) 동결보호제: 운동성 억제 생리식염수(Motility Inhibiting Saline) 사용
 2) 냉각 방법: 액체질소 증기에서 동결

3. Harland lab 방법
 1) 동결보호제: Sargent 방법과 유사하지만 NaHCO3와 sucrose 농도가 절반
 2) 냉각 방법: 스티로폼 상자에 넣어 -80°C 냉동고에서 천천히 동결
 3) 특징
  - 각 정소를 얼음 차가운 500 μL L15(glutamine 포함)에서 분쇄
  - 얼음 차가운 동결보호제 용액 추가 후 4개의 동결 튜브에 균등 분배
  - 실온의 스티로폼 상자에 튜브 랙을 넣고 -80°C 냉동고에 보관
  - 24시간 후 -80°C 랙에 보관하거나 액체질소로 옮김

[제노프스의 Single-cell Sequencing]

1. 조직을 단일세포로 분리하는 방법
 1) 효소적 분해: 콜라게나제, 트립신, 디스파제 등의 효소를 사용합니다.
 2) 기계적 분리: gentleMACS나 pipetting을 통한 물리적 분리 방법을 사용합니다.
 3) 조합 방법: 효소적 분해와 기계적 분리를 함께 사용하여 효율을 높입니다.

2. Yolk Cell 제거 방법
 1) 밀도 구배 원심분리: Percoll이나 Ficoll을 사용하여 yolk cell을 분리합니다.
 2) FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting): 형광 표지를 이용해 원하는 세포만 분리합니다.
 3) 크기 기반 필터링: 특정 크기의 필터를 사용하여 yolk cell을 제거합니다.

3. 주의사항
 1) RNA 분해를 최소화하기 위해 모든 과정을 빠르게 진행해야 합니다.
 2) RNase 억제제를 사용하여 RNA의 품질을 유지합니다.
 3) 세포 생존율을 높이기 위해 적절한 배양액과 온도 조건을 유지해야 합니다.

[제노프스 개체를 구분하는 방법]

1. 사진 식별법
성체 제노프스의 배면 무늬를 사진으로 찍어 개체를 구분할 수 있습니다. Wild-ID와 같은 pattern matching software를 사용하여 개체를 식별할 수 있습니다. 이 방법은 비침습적이지만, 시간이 지남에 따라 정확도가 떨어질 수 있습니다.
2. VIE(Visible Implant Elastomer) Tag
피하에 형광 색소를 주입하는 방법입니다. 다양한 색상을 사용하여 개체를 구분할 수 있습니다.
3. 마이크로칩 삽입
피하에 작은 마이크로칩을 삽입하여 개체를 식별할 수 있습니다. 장기간 추적이 가능하지만 침습적인 방법입니다.
4. 체형과 크기
성별, 크기, 특징적인 무늬 등을 조합하여 개체를 구분할 수 있습니다.
5. 발가락 절단법
양서류에서 사용되는 방법이지만 윤리적 문제가 있을 수 있습니다.
6. 색소 주입
피부에 무해한 색소를 주입하여 일시적으로 표시할 수 있습니다.

마우스에서 사용하는 ear punch나 ear tag은 제노프스에게 적합하지 않습니다.
제노프스는 수생 동물이며 귀가 외부로 돌출되어 있지 않아 이러한 방법을 적용하기 어렵습니다.

[Haploid의 정의]

Haploid란 정상적인 체세포의 염색체 수(2n)의 절반(n)만을 가진 세포나 개체를 말합니다. 제노프스의 경우, X. laevis는 정상적으로 36개의 염색체를 가지지만 haploid는 18개의 염색체만을 가집니다. Haploid 배아는 모계 유래의 단일 세트 염색체만을 가지고 있어 유전학적 연구에 매우 유용한 도구가 됩니다. 그러나 대부분의 haploid 배아는 발생 과정에서 치사되며 일부만이 초기 발생 단계를 지나 연구에 사용될 수 있습니다.

[Haploid 제작 방법]

제노프스에서 haploid 배아를 만드는 과정은 다음과 같습니다.

1. 정자 불활성화
- 준비된 정자 용액을 유리 페트리 디쉬에 옮깁니다.
- UV 조사기를 사용하여 정자 DNA를 불활성화합니다. X. laevis의 경우 30-60초, X. tropicalis의 경우 20-30초 동안 조사합니다.
2. 수정
- 불활성화된 정자 용액을 난자 위에 골고루 뿌립니다.
- 15-20분 후 1/3X MMR 용액으로 수정란을 덮습니다.

[Haploid의 특징]

Haploid 배아는 짧아진 체축, 소두증(Microcephaly), 불완전한 장 형성, 부종(Edema)과 같은 특징을 보입니다. 이러한 특징을 "haploid syndrome"이라고 합니다.

[Haploid를 이용한 실험]

Haploid 제노프스 배아는 다양한 연구에 활용될 수 있습니다.
1. 유전학 연구: 열성 돌연변이의 표현형을 쉽게 관찰할 수 있습니다.
2. 발생학 연구: 단일 세트의 염색체가 발생에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.
3. 게놈 편집: CRISPR-Cas9 등의 기술을 사용할 때, haploid에서는 단일 대립유전자만 편집하면 되므로 효율이 높습니다.
4. 배수성 연구: Haploid와 정상 배아를 비교하여 배수성이 발생에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.
5. 모계 효과 연구: 부계 유전자의 영향 없이 모계 유전자의 효과만을 관찰할 수 있습니다.

[GRP의 중요성]

GRP는 제노프스 배아에서 좌우축 결정에 중요한 역할을 하는 구조입니다. 이는 마우스의 ventral node와 기능적으로 유사합니다.

[GRP의 특징]

1. 위치: 배아의 위장관(Gastrocoel) 지붕에 위치합니다.
2. 구조: 단일 섬모를 가진 세포들로 구성되어 있습니다.
3. 기능: 섬모의 회전 운동으로 왼쪽 방향의 유체 흐름을 생성합니다.

* 그림출처: Schweickert A et al. Differentiation. 2012;83(2):S67-S77.

[GRP 연구 방법]

1. GRP 분리
- 신경배 단계의 배아를 사용합니다.
- 미세 수술 기술을 이용하여 GRP를 분리합니다.
- 칼슘-마그네슘이 없는 배지를 사용하면 분리가 더 쉽습니다.
2. 섬모 관찰
- 면역염색을 통해 F-actin, fibronectin 등의 표지자를 관찰할 수 있습니다.
- 전자현미경을 이용하여 섬모의 구조를 상세히 관찰할 수 있습니다.
3. 유체 흐름 관찰
- 형광 비드를 이용하여 GRP에서 생성되는 유체 흐름을 시각화할 수 있습니다.

[제노프스의 Animal Cap]

Animal cap은 제노프스 배아의 동물극(Animal Pole) 주변 부위를 말합니다. 이 부위는 다음과 같은 특징을 가집니다:
1. 배아의 포배기(Blastula Stage)에 위치합니다.
2. 정상 발생 과정에서는 외배엽(Ectoderm)으로 분화됩니다.
3. 다능성(Pluripotency)을 가지고 있어 특정 유도 물질에 노출되면 신경, 중배엽, 내배엽 조직으로 분화할 수 있습니다.

* 그림출처: Lee J et al. Sci Adv. 2023;9(14):eadd5745.

[Animal Cap을 이용한 표피 연구 방법]

Animal cap은 제노프스 표피 연구에 매우 유용한 도구입니다. 다음과 같은 방법으로 연구를 진행할 수 있습니다.

1. Animal Cap 분리
- 포배기 배아에서 animal cap을 미세 수술로 분리합니다. 이 과정은 칼슘-마그네슘이 없는 배지를 사용하여 더 쉽게 할 수 있습니다.
2. Animal Cap 배양
- 분리된 animal cap을 적절한 배양액에서 키웁니다. 특정 유도 물질 없이 배양하면 표피로 분화합니다.
3. 분화 과정 관찰
- Animal cap은 약 24시간 내에 성숙한 표피로 분화합니다. 면역염색을 통해 F-actin, fibronectin 등의 표지자를 관찰할 수 있습니다.

이 방법을 통해 yolk가 많은 배아 전체를 사용하지 않고도 표피 분화에 대한 상세한 연구를 진행할 수 있습니다. Animal cap은 배아의 다른 조직들로부터 분리되어 있어 순수한 표피 분화 과정을 관찰하기에 이상적입니다.

[제노프스 세포 배양 가능성]

제노프스에서 세포를 추출하여 배양하는 것은 가능합니다. 실제로 여러 제노프스 세포주가 개발되어 연구에 활용되고 있습니다.

[제노프스 세포주 현황]

1. Xenopus laevis 유래 세포주: X-C, XTC, A6, XL177, XL2, XL58, XLK-WG 등 20개 이상의 세포주가 Cellosaurus 데이터베이스에 등록되어 있습니다. S3 세포주는 정상 염색체 수를 가진 것으로 알려져 있습니다.

2. Xenopus tropicalis 유래 세포주: Speedy 세포주가 알려져 있으며 21개의 염색체를 가진 안정적인 이수성 핵형을 보입니다. 최근 XTN-6, XTN-8, XTN-10, XTN-12 등 4개의 새로운 세포주가 개발되었습니다.

[제노프스 세포 배양의 장점]

1. 간단한 배양 조건: 30°C, 희석된 L-15 배지, 혈청 사용
2. CO2 incubator 불필요
3. 인체 병원체 위험이 낮아 BSL2 주의사항 불필요

[Microinjection 주입량 결정 방법]

Microinjection 주입량은 주로 다음 요소들을 고려하여 결정합니다.
1. 주입 압력과 시간
2. 미세주사 바늘의 직경
3. 주입 용액의 농도

일반적으로 다음과 같은 방법으로 주입량을 계산하고 조절합니다.

1. 주입 압력과 시간을 조절하여 원하는 부피를 주입합니다.
2. 미세주사 바늘을 calibration하여 특정 압력과 시간에서의 주입량을 측정합니다.
3. 형광 물질을 이용해 주입량을 시각화하고 정량화합니다.

[제노프스 배아 주입량 계산]

제노프스 배아에 morpholino나 mRNA를 주입할 때는
1. 일반적으로 배아 당 50-100nL의 용액을 주입합니다.
2. Morpholino의 경우 보통 20-80ng/배아의 범위에서 주입합니다.
3. mRNA는 실험 목적에 따라 다양한 농도(예: 100-1000pg/배아)로 주입합니다.

예를 들어, 40ng의 morpholino를 주입하고 싶고 stock 농도가 1 ng/nL인 경우, 40ng÷1ng/nL = 40nL의 용액을 주입해야 합니다.
정확한 주입을 위해 미세주사 바늘을 calibration하고 형광 물질로 주입량을 확인하는 것이 좋습니다.