보통 제노프스 실험에 사용하는 동물은 outbred line 입니다. 마우스와 같이 실험 동물에서 유전적 다형성 (genetic heterogeneity) 영향을 최소화 하기 위해 오랜 기간 근친교배(inbreeding)를 통해서 유전적으로 균일성이 높은 inbred line 을 유지하고 실험에 활용하는 경우가 많습니다. 제노프스에서도 근친교배를 오랫동안 진행해서 유전적 균일성이 높은 line 들이 일부 있습니다. Xenopus laevis 의 J-strain 은 1948년 스위스 바젤에서 시작된 근친교배를 아직까지 지속해서 유지하고 있으며[Session, et al., 2016], 유전적 균일성으로 Xenopus laevis genome project 의 샘플로 사용되었습니다.

Xenopus tropicalis 의 경우 “Nigeria” 와 “Ivory Coast” 라는 2개의 wild-type strains 이 알려져 있는데, “Nigeria” strain 이 미토콘드리아 haplotype 을 보다 잘 유지하고 있는 것으로 알려져 있습니다 [Horb, et al., 2016]. 비교적 최근에 근친교배로 inbreeding 을 시작한 “Golden” 및 “Superman” strains 도 있습니다.

하지만 transgenic line 을 만드는 실험이나 CRISPR를 이용한 형질전환 실험에서 특별히 이러한 inbred line 을 꼭 사용해야 하는 건 아닙니다. 제노프스 실험은 대부분 배아 초기 발달 단계의 형질 전환을 관찰하는데 여러 개체에서 얻은 수백 개의 배아를 한꺼번에 관찰할 수 있기 때문에 유전적으로 다양한 개체에서 공통적으로 나타나는 형질 변화를 관찰하는 게 훨씬 정확한 데이터를 얻을 수 있기 때문입니다. 또한 CRISPR 실험에서도 대부분 단백질 유전자 영역을 표적으로 할 때 DNA 상의 변이가 있는 경우가 많지 않기 때문에 알려진 표준 유전체 정보를 바탕으로 실험을 설계해도 대부분의 경우 문제가 없습니다.

이러한 inbred line 이 필요한 경우에는 미국의 제노프스 소재 은행인 National Xenopus Resource Center (NXR, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA 에 위치)이나 유럽 소재 은행인 European Xenopus Resource Center (Portsmouth, UK 에 위치), 일본 히로시마 대학의 양서류 연구소에서 분양 받을 수 있습니다.

제노프스에서 CRISPR 실험을 하기 위해서는 (1) Cas enzyme 과 (2) guide RNA 가 필요합니다.

일반적으로 CRISPR 실험을 할 때에는 Cas enzyme 을 mRNA 의 형태로 주입하거나 protein 형태로 주입할 수 있습니다. 하지만 F0 에서 형질을 관찰하고 싶을 경우나 transgenic 을 만들 때 가급적 많은 세포에서 동일한 변이가 일어나는 것이 필요하기 때문에 주입하자마자 Cas enzyme 이 표적에 작용하는 것이 좋습니다. mRNA 를 주입하게 되면 단백질로 번역되는 데 시간이 걸리기 때문에 초기에 작용하기 어려워 대부분 제노프스 실험에서는 단백질 형태의 Cas enzyme 을 사용하게 됩니다.

직접 단백질을 정제해서 사용하는 방법도 있으나 대부분 제노프스 연구실에서는 Integrated DNA Technologies (IDT)와 같은 업체에서 구입해서 사용합니다. 특히 낮은 온도에서 배양하는 제노프스 배아에서도 효과가 좋은 Cas12a-Ultra 의 경우 IDT 사에서 직접 제작한 효소입니다. Cas9 의 경우 다른 업체에서 판매하는 제품도 성능 면에서는 큰 차이가 없습니다. (Yun, et al., 2023)

(2) Guide RNA

표적 특이적인 guide RNA 의 경우 Cas12a, SpCas9, SaCas9 등 사용하는 Cas eyznme 의 PAM site, GC content 및 tandem repeat 의 여부를 가지고 설계를 할 수 있습니다. CHOPCHOP 이 대표적인 웹 설계 도구이며 X. laevis 및 X. tropicalis 모두 최신 genome 을 지원하고 있어 편하게 설계에 사용할 수 있습니다. 최근 AI를 이용하여 CRISPR 효율을 예측하는 연구도 많이 진행되어 인간 및 마우스에서 많이 활용되고 있는데, 그러한 도구 가운데 하나인 inDelphi의 경우 마우스 배아줄기세포(mESC) 기반 예측 모델이 제노프스에서 잘 작동하는 것이 보고되었습니다 [Neart, et al., 2020]. 이러한 도구를 사용해서 보다 효율이 높은 guide RNA 설계가 가능하게 되었습니다.

Guide RNA 설계 이후에는 일반적인 primer 주문하는 것과 동일한 방법으로 guide RNA 를 제작할 수 있습니다. SpCas9 의 경우 표적을 결정하는 crRNA 와 Cas9 enzyme 과 결합에 필요한 tracRNA 를 별도로 제작할 수도 있고, 둘을 결합하여 sgRNA 의 형태로 사용할 수도 있습니다. 전문 업체에 주문할 경우 RNA 에 변형을 가하여 보다 안정성을 높이는 방법도 가능하지만 DNA template 을 제작하고 in vitro transcription 을 통해 만든 sgRNA 도 널리 사용되고 있습니다. Integrated DNA Technologies (IDT) 가 대표적으로 이러한 CRISPR 전문 guide RNA 를 제공하고 있습니다.

Cas12a 의 경우 crRNA 의 길이가 짧고 tracRNA 가 없기 때문에 보통 IDT 와 같은 업체에서 주문해서 사용하게 됩니다. Cas12a 는 여러 개의 crRNA 가 있는 polycistronic guide RNA 를 프로세싱해서 여러 표적을 한꺼번에 타게팅할 수 있는 IN4MER 기술이 있어 이를 활용할 경우 in vitro transcription 을 이용해서 guide RNA 를 제작하는 것도 가능합니다. IN4MER 기술은 특히 여러 부위를 동시에 표적해야 하는 경우나 X. laevis 의 L/S form 을 동시에 표적하는 guide RNA 가 없는 경우 유용하게 활용될 수 있습니다.

Xenbase 에서는 논문에서 사용된 guide RNA 를 별도 데이터베이스로 관리하고 있으니, 관심있는 유전자에 검증된 guide RNA 가 있는지 확인하고 사용하는 방법도 있습니다.

제노프스도 transgenic line 이 있습니다. 1980년대부터 다양한 방법으로 transgenesis 실험을 제노프스 모델에서 진행했지만 다른 모델동물에 비해 transgenic line 의 활용이 많지 않았는데 다음 세대를 만들기 위해 걸리는 시간이 5-8개월(X. tropicalis) 또는 6-12개월(X. laevis) 상대적으로 길어서 F2 homozygotes 을 만드는 데 시간이 오래 걸리는 게 주요 걸림돌이었습니다. 하지만 Xenopus 는 다른 모델 동물에 비해 수명이 길어서, X. laevis female 의 경우 15년 이상 알을 낳을 수 있기 때문에 한 번 구축해 놓은 transgenic line 은 오랫동안 유용하게 사용할 수 있습니다 [Horb, et al., 2019].

CRISPR 가 보편적으로 유전자 편집에 사용되면서 미국의 National Xenopus Resource Center (Woods Hole, MA, USA)를 중심으로 보다 체계적으로 transgenic line 을 만들고 있습니다. 크게 구분해서  (1) reporter expression lines, (2) inducible lines, (3) GAL4 and Cre driver lines,(4) single landing site lines 으로 나뉠 수 있습니다 [Horb, et al., 2019].

사용 가능한 transgenic line 정보는 미국 NXR 및 영국 EXRC 웹사이트를 통해서 확인할 수 있습니다. 또한 제노프스 정보를 통합 관리하는 Xenbase 를 중심으로 이러한 transgenic line 정보를 체계적으로 관리하는 노력을 지속하고 있습니다. 체계적으로 transgenic line 을 부르는 명명법(nomenclature)를 제정하여 기존의 line 들과 새로 개발되고 있는 line 들에 적용하고 있습니다 [https://www.xenbase.org/xenbase/static/gene/tgNomenclature.jsp].

2025년 현재 Xenbase 에는 420개의 transgenic constructs, 605개의 lines and strains 정보가 등록되어 있습니다. 제노프스 transgenic line 을 실험에 사용하기 위해서는 생태계위해우려종 관련 신고 이외에도 다른 모델동물의 transgenic line 과 마찬가지로 유전자변형생물체(Living Modified Organism; LMO) 관련 도입 신고가 반드시 필요합니다. 아울러 transgenic line 을 유지하기 위해서는 LMO 사육 시설에 대한 승인도 도입 이전에 받아야 합니다.

CRISPR 기술은 2012년 진핵세포에서 사용될 수 있다는 것이 보고된 이후 인간 및 모델동물을 이용한 연구 뿐만 아니라 많은 분야의 생물학 연구에서 유전자 형질전환이 필요한 실험에 널리 사용되고 있습니다. 하지만 처음 보고된 S. pyogenes Cas9 과 이후 보고되어 많이 사용되는 대부분의 Cas9 단백질의 경우 세균과 세포주 배양이 주로 이루어지는 37도 온도에서 실험을 해 왔습니다. 하지만 제노프스의 경우 37도 온도에서 배아가 살 수 없고, 배아를 키우는 22-24도의 낮은 온도에서는 Cas9 단백질의 기능이 떨어지는 것이 알려져 있습니다.

이후 발견된 Cas12a 의 경우에는 이러한 온도 의존도가 더 높아서 제노프스의 배아 사육 온도에서는 기능을 하지 못하는 것이 알려져 있습니다 [Moreno-Mateos, et al., 2017]. 이러한 문제를 해결하기 위해 배아에 CRISPR 를 주입하고 0-4시간 정도 30도의 높은 온도에서 키우면 CRISPR 의 효과를 좋게 할 수 있습니다. 하지만 이 방법은 비교적 높은 온도(28 C)에서 배양이 가능한 X. tropicalis 에서만 적용 가능하며, X. laevis 의 경우에는 적용이 어렵습니다. 따라서 X. laevis 에서 온도를 높여 CRISPR 효율을 높이기 위해서 이보다 낮은 28 C 정도에서 heat shock treatment 를 진행합니다.

Integrated DNA Technologies (IDT) 에서는 온도 의존도가 낮고 효율이 훨씬 우수한 Cas12a 를 개발했는데 (AsCpf1-Ultra 및 LbCpf1-Ultra)[Zhang, et al., 2021] 이는 16 C 의 낮은 온도에서도 충분히 효율적인 성능을 보여줍니다 [Yun, et al, 2023]. 그 결과 F0 에서도 DNA 변이에 의한 gene knock-out 형질 변환을 쉽게 관찰할 수 있게 되었습니다. 또한 SpCas9은 온도 의존도가 상대적으로 낮고, 농도를 높이면 그 의존도가 훨씬 감소하게 됩니다 [Yun, et al, 2023]. CRISPR/Cas 시스템의 효율은 온도가 높을수록 좋지만, 반면에 제노프스에 변이가 일어나고 회복되는 효율은 오히려 온도가 낮을수록 좋다는 보고도 있어서 [Kato, et al., 2021], 온도 의존도가 낮은 Cas12a 를 활용하면 보다 다양한 조건에서 제노프스의 CRISPR 효율을 높일 수 있을 것입니다.

유전자 knock-out 은 보통 유전자를 완전하게 없애는 complete knock-out 과 유전자에 변이를 많이 도입하여 유전자의 기능을 없애는 gene inactivation 을 언급하는 경우가 많습니다.

Complete knock-out 은 원하는 영역의 유전자를 완전히 없애는 기술인데 이를 위해서는 (1) CRISPR 등의 기술로 체세포 전반에 mosaic 형태의 knock-out 세포들을 만들고(보통 homologous recombination 기반의 기술을 사용), (2) 이 가운데 생식세포로 전달되는 개체를 스크리닝한 다음, (3) 이들간의 교배를 통해 균일한 형태의 knock-out 을 만들 수 있습니다. 하지만 제노프스의 경우 다음 세대에서 이를 관찰하기까지 1년 정도의 시간이 필요하기 때문에 하나의 complete knock-out을 완성하기 위해서 2년 이상의 실험이 필요하게 됩니다. Cre-lox 와 같이 다른 모델동물에서 complete knock-out 을 만들기 위한 transgenic line 도 개발중이나 아직 그 숫자가 다양하지는 않습니다. 따라서 제노프스에서 complete knock-out 실험을 진행하는 경우는 거의 없습니다.

반면 유전자의 기능을 없애는 gene inactivation 은 다양한 방법으로 실험할 수 있습니다. 이전에는 modified antisense oligo 인 morpholino 를 이용하여 단백질 생성을 막는 실험을 많이 했지만, 최근 CRISPR 기술의 발달로 단백질 발현 유전자 또는 발현 조절 영역에 임의의 변이를 도입하여 유전자의 기능을 없앨 수 있습니다. 유전자 및 표적 위치에 따라 다르기는 하지만 처음 배아에 주입한 후 유전자 기능을 약 80% 까지 없앨 수 있습니다.

하지만 바로 CRISPR 를 주입한 배아에서는 완벽한 유전자 기능 상실을 구현하기는 매우 어렵습니다. 세포 분열이 일어나기 전에 변이가 일어난다면 가능한 경우이기는 하지만, 매우 드물게 일어날 수 있는 일이며 세포 분열이 시작되어 여러 세포가 발생하는 단계에서 CRISPR 가 작용하는 시점이 다르고 복구 경향도 다를 수 있기 때문에 mosaic 의 형태로 유전자 기능 상실이 일어나게 됩니다. 따라서 CRISPR 주입한 배아에서 직접 유전자의 기능을 보는 경우 knock-out 보다는 유전자 발현을 억제한 knock-down 과 유사한 형질 전환으로 이해하고 있습니다.

CRISPR 에 의한 유전자에 임의 형태의 변이를 도입하고 형질 전환을 만든 경우에는 해당 유전자가 제노프스의 성장에 큰 문제가 없다면 다음 세대의 배아를 얻어서 gene inactivation 과 유사한 환경을 관찰할 수 있습니다. 특히 생식세포의 한 쪽 DNA 를 파괴하고 수정시켜 haploid 배아를 만든 다음 세포 분열을 조절하여 diploid 배아를 만드는 gynogenesis 기술을 이용하면 바로 다음 세대에서 complete gene inactivation 배아를 구현할 수 있습니다 [Nakayama, et al., 2022].

Gene inactivation 의 정도는 단백질의 발현을 western blot 으로 확인하는 방법이 가장 많이 사용되며 CRISPR 표적 영역을 해독해서 얼마나 많은 종류의 변이가 생겼는지 확인하는 방법이 사용됩니다. NGS 로 분석하는 방법이 표준적으로 사용되고 있으나 전통적인 Sanger sequencing 방법으로도 chromatogram 분석을 통해 변이 구성을 확인할 수 있는 방법이 있어 이 방법도 간단히 검증하는 용도로는 많이 활용되고 있습니다.

Knock-in 기술은 대부분 HDR(Homology-Directed Repair)에 기반한 기술로, Knock-in 하려는 삽입  DNA 서열의 양쪽 끝에 타겟 DNA 서열을 연결하여 HDR 반응에 의한 DNA 가닥이 대체되어 유도됩니다. 하지만, 제노프스 배아는 HDR 효율이 매우 낮고, 주로 NHEJ(Non-Homologous End-Joining)  방법으로 DNA break가 교정되어 정확한 Knock-in 효율이 매우 낮습니다. 또한,  1-cell stage가 아닌 2~4-cell stage에서 주입하는 경우가 많아 유전자 삽입의 모자이크 발생하고, 매우 낮은 효율로 발생하여 생식세포로의 유전자 삽입 역시 어렵습니다.

하지만 아래와 같은 방법으로 Knock-in을 성공적으로 수행한 연구결과가 보고되었습니다.

제노프스에서 유전자 과발현은 주로 미세주입(microinjection) 통해 이루어집니다. 사용 목적에 따라서 2세포~8세포기 배아의 할구에 합성된 mRNA를 양을 다르게 해서 주입하거나, CMV 프로모터에 의해 조절되는 plasmd를 직접 주입합니다. DNA 벡터는 pCS2, pCS107, pCS108 등 다양한 종류의 CMV 프로모터 기반 플라스미드를 사용합니다.

위 방법은 초기 배아 발생 과정에서 유용한 방법이나, 배아발생기 이후에 올챙이 조직, 또는 성체 조직에 전기천공법 (electrophorarion), LNP 등의 Lipofection 용액과 함께 DNA를 원하는 조직에 직접 주입하여 모자이크 패턴의 과발현 기법을 사용하기도 합니다.

미세천공 기법은 TSS20 OVODYNE electroporator, Intracel 기기가 사용된 적이 있으며, 전극은 직접 제작하거나 사용 목적에 맞는 전극을 구매하여 사용합니다.

Lipofection 기법은 세포의 transfection에 사용되는 대부분의  lipid-based transfection 용액이 사용 가능합니다.

마우스의 C/loxP 시스템과 같은 세포타입 특이적인 유전자의 프로모터를 이용한 조직 특이적 발현 조절은 아직 범용적으로 사용되지 않고 있습니다. 하지만 발생단계 배아의 초기 난할 과정에서 할구의 운명지도 (Fate map)가 비교적 자세이 알려져 있어서, 배아의 할구에 mRNA 또는 morpholino를 미세주입 (microinjection)을 통해 유전자의 발현을 초기 배아 조직 단위로 조절할 수 있습니다. 제노프스 데이터베이스인 Xenbase 32세포기의 운명지도를 확인할 수 있습니다.

대표적인 예는 아래와 같습니다.

또한, 일부 조직에서 조직특이적인 유전자의 프로모터를 사용하여 조직 특이적으로 유전자의 발현을 유도한 연구가 있습니다. 예는 아래와 같습니다.

결론적으로, 제노프스에서도 조직특이적인 유전자 조절이 가능하지만, Cre/loxP 시스템과 같은 정밀 조절은 어려우며, Fate map을 이용한 할구 특이적 미세주입, 프로모터를 사용한 조직 특이적 발현등을 사용합니다.

Morpholino의 부작용은 Zebrafish를 사용에서 최초로 보고되었으며, 부작용의 주요 원인으로는 비특이적인 오프타겟 효과, MO 자체 독성 등으로 요약됩니다.

Xenopus를 사용한 MO 부작용으로는 선천적 면역반응 (innate immune response) 을 유발함이 보고되어 있습니다. 이 연구에서는 MO 주입에 의해 광범위한 선천적 면역반을 유전자의 발현을 증가시키고 또한 여러 유전자의 mis-splicing을 유도할 수 있음이 보고되었습니다.

그러나, 이후 발표된 광범위하고 체계적인 연구에서는 기존의 연구들이 적절한 실험 대조군을 사용하지 않거나, 실험적 검증이 부족한 데이터들을 포함하고 있기 때문이며, 또다른 연구에서는 MO를 사용한 Xenopus 연구의 광범위한  RNA-seq 데이터들을 분석하여 선천적 면역반응 유전자의 변화를 분석한 결과, 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 주장하고 있습니다.

이러한 오류들을 줄이기 위해 아래와 같은 적절한 MO 사용방법이 제시되었습니다.

  • 실험 결과를 해석함에 있어서 신중하게 해석할 것

MO는 발생학 연구에 있어서 여전히 대체 불가능한 장점들을 보유하고 있습니다.

결론적으로, MO의 부작용을 우려하여 사용을 자제하는 것보다 적절한 대조군과 실험 환경에서 목적에 맞게 사용하는 것이 권장됩니다.

제노프스(Xenopus) 배아는 발생 속도가 빠르고 투명하여, 특정 시기(stage)나 조직에서 유전자의 기능을 정밀하게 조절하기에 좋은 모델입니다.

그러나 조기 발현이나 억제로 인한 비특이적 결함 때문에 후기 기능을 분석하기 어려운 경우가 많습니다. 이를 해결하기 위해 빛(자외선)을 이용해 유전자 발현을 시간적으로 제어하는 photo-morpholino (photo-MO)기술을 사용할 수 있습니다.

Photo-MO는 표적 mRNA에 결합해 번역을 억제하는 morpholino(antisense oligonucleotide)의 변형체로, 염기 중간에 빛 민감성 결합부(light-sensitive subunit)를 포함합니다.

이 결합부는 365 nm 자외선을 받으면 절단되어 두 조각으로 나뉘며, 결합력이 약화되어 표적 mRNA로부터 떨어지게 됩니다. 그 결과 mRNA의 번역이 허용되어 유전자 발현이 켜집니다 (UV-ON 시스템).

(1) UV-ON 시스템 (Photo-Antisense MO)

Antisense 방향의 photo-cleavable morpholino는 일반 morpholino와 동일하게 mRNA의 번역을 차단하지만, 자외선 조사 후 절단되면 억제가 해제되어 유전자 발현이 시작됩니다.

이 방식은 in vitro 전사된 mRNA와 photo-antisense MO를 미리 혼합(pre-hybridization)하여 배아에 미세주사한 후, 원하는 발생 단계에서 자외선을 조사함으로써 특정 시점(stage 8, 22 등)에 유전자 발현을 켜는(ON) 효과를 얻을 수 있습니다.

(2) UV-OFF 시스템 (Sense-Photo MO)

반대로 sense-photo morpholino (S-photo-MO) 를 이용하면 UV-OFF 시스템도 구현할 수 있습니다. 이 경우, 일반 morpholino(MO)가 표적 유전자를 억제하는데, sense-photo-MO가 그 MO와 상보적으로 결합하여 그 활성을 임시로 차단합니다.

자외선을 비추면 sense-photo-MO가 절단되어 일반 MO가 다시 활성화되므로, 빛으로 유전자 기능을 끄는(OFF) 조절이 가능합니다.

antisense-photo-MO → UV 조사 시 유전자 발현 ON

sense-photo-MO + regular MO → UV 조사 시 유전자 발현 OFF

이 두 가지 조합을 통해 연구자는 빛으로 유전자 기능을 시기별로 켜거나 끌 수 있으며, 특정 세포나 조직에만 광원을 제한적으로 조사하면 공간적(spatial) 조절도 가능합니다.

이 기술은 optogenetics와 마찬가지로 광자극을 이용한 정밀한 시간·공간적 제어를 가능하게 하지만, 단백질 수준이 아니라 mRNA 번역 단계에서 작동한다는 점이 다릅니다. 따라서 전사인자나 효소의 조기 발현이 전체 발생에 영향을 주는 경우에도, 이 시스템을 사용하면 후기 단계의 유전자 기능을 선택적으로 분석할 수 있습니다.